腺病毒载体工艺平台说明
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
源兴基因药物研发中心
腺病毒载体工艺平台介绍
研发中心厂房及设备
源兴基因药物研发中心建筑面积1900多平方 米，其中符合国家GMP要求的洁净厂房面积1600 多平方米，包括原液生产车间、制剂生产车间、 质量控制实验室以及研发实验室。
研发中心配置了NBS细胞罐、AKTA纯化系统、 高速冷冻离心机、切向流超滤系统、二氧化碳培 养箱、生物安全柜、分析型HPLC系统、PCR仪、 电泳仪、酶标仪、超声波破碎仪、超声波西林瓶 清洗机、隧道式灭菌烘箱、液体灌装加塞机、轧 盖机、凝胶扫描成像系统、超纯水仪、多效蒸馏 水机等仪器设备。
罐细胞染毒
毒种制备
罐病毒培养
纯化
细胞罐葡萄糖消耗监控曲线图
日糖耗(g)
图2 六罐实验日糖耗曲线 70
60 50
40
30
20 10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
培养天数(天)
B0704日糖耗(g) B0802日糖耗(g)
B0705日糖耗(g) B0803日糖耗(g)
B0706日糖耗(g) B0804日糖耗(g)
细胞罐产毒浓度曲线
罐内病毒VP浓度(HPLC峰面积)
图4 EGFR三罐病毒培养期VP浓度曲线
700000
600000
500000
400000 300000
200000
100000 0
0 4 6 30 48 72 96 120 144
1
2
3
4
5
6
7
8
9
病毒培养时间(小时)
品种
治疗性重组 HBV腺病毒疫 苗
代号
CHB3
研究单位
源兴
治疗性HIV腺病 H30
毒载体疫苗
源兴
研究时间
2004年3月至 2005年11月
2005年12月 至2007年8月
治疗性重组腺 病毒EB病毒潜 伏膜抗原疫苗
LMP2
CDC病毒病所委托 源兴承担药学研究
2007年9月至 2008年10月
新药申报三方面研究内容
B0704病毒培养期VP浓度(HPLC峰面积) B0804日收获病毒VP(HPLC峰面积)
B0803日收获病毒vp(HPLC峰面积) 感染时间(小时)
细胞罐病毒收获曲线
日收获病毒VP(e14)
图3 EGFR三罐实验日糖耗&日收获病毒比较
8
7
6
5
4 3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
病毒培养时间(天)
B0704日收获病毒VP(e14) B0804日收获病毒VP(e14)
• 药学研究 • 药效研究 • 安全评价
药学研究主要内容
• 上游构建及鉴定 • 细胞/毒种研究及三级库建立 • 原液工艺研究 • 制剂工艺研究 • 检测方法及质量标准研究 • 稳定性研究 • 试制三批样品
细胞及毒种研究
• 细胞检定、传代稳定性研究 • 毒种检定、代次及遗传稳定性研究
建细胞库
原始细胞
罐 收获物
6000RPM离 心20min 500K膜超滤浓缩10倍
超滤浓缩液 SOURCE 30Q 阴离子交换柱层析
层析收集液 Sepharose 6 Fast Flow 分子筛层析
原液
H30产量
（3批平均）
460ml 1.1×1015 VP
回收率
（3批平均）
53%
细胞罐工艺
细胞复苏培养
罐细胞培养
700
600
500
400
300
200
100
0 0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
min
制剂工艺流程图
原液
检测 西林瓶清洗、干烤
半成品配制除菌 分装
轧盖 灯检 贴签 包装、贮存
病毒保存 液
胶塞灭菌 铝盖清洗、烘干
检测
制剂处方筛选结果
滴度（IU/ml）
不同处方贮存情况比较图
4.50E+09 4.00E+09 3.50E+09 3.00E+09 2.50E+09 2.00E+09 1.50E+09 1.00E+09 5.00E+08 0.00E+00
能够满足腺病毒载体药物研发、生产和质量 控制的要求。
研发中心生产系统组织图
总经理
生产总监
工艺开发部 （10人）
质控部 （5人）
设备工程部 （4人）
细胞病毒培养
纯化
制剂分装
清洁辅助
物控部 （3ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ）
研发队伍
• 打造了一支技术过硬的研发队伍，能 够保证工艺水平及产品质量稳定。
• 历经多次新药申报，比较熟悉新药审 评程序和规定，积累了较丰富的申报 经验，能够比较顺利的解决有关问题。
管理制度
• 建立了300多个SOP、SMP等标准程 序和规章管理制度，按照GMP要求 严格规范管理。
研发中心工艺平台
• 研发中心工艺产业化平台是通用型腺病毒载体药 物生产工艺和质量标准研究的药学技术平台，中 试生产工艺水平达到了国内同行业先进水平，可 以在产量及质量上满足腺病毒载体药物临床前和 临床用样品制备的要求。
• 本工艺拥有自主知识产权，可作为腺病毒载体新 药研发及生产的技术基础。
• 5L细胞罐收获物经纯化后产量能达到E15VP/批， 注射液制剂工艺达到了小容量水针1万支/批的生 产能力。
• 产品纯度大于98%，比滴度大于3.3%，各项质检 结果都能达到FDA对腺病毒类生物制品的质量标 准要求。
研发中心已完成申报临床所需药学研究的 品种
细胞扩增
主细胞库
细胞扩增
工作细胞库
细胞来源于ATCC
质量控制 质量控制
建毒种库
原始种子批
病毒扩增
主种子批
病毒扩增
工作种子批
鉴定检 测
质量控 制
质量控 制
原液工艺流程、参数及技术指标
细胞种子
重组腺病 毒种子
细胞罐扩增
5L罐细胞培养，病毒扩增： DO60%,37℃,pH7.2, 耗糖40g/d接种病毒，MOI为20
B0803日收获病毒vp(e14)
纯化工艺
罐病毒收获液 离心
超滤浓缩 酶切
离子交换层析 分子筛层析 原液
纯化图谱
mAU 800
Manual run 1:1_UV1_280nm
Manual run 1:1_UV2_260nm
Manual run 1:1_Cond
Manual run 1:1_Conc
0 123 456 78
贮存时间（周）
处方1 处方2 处方3 处方4
从以上结果可以看出，处方Ⅰ为最优，处方Ⅱ次之，处方 Ⅲ最差，处方Ⅳ较差。于是将处方确定为处方Ⅰ。
质量标准及检测方法
检测项目 外观
（含可见异物） pH 值 装量
鉴别试验
病毒颗粒数
比滴度 （IU/ Vp） HPLC纯度 小鼠效力试验 293细胞DNA
残留量 牛血清白蛋白残留量
RCA
AAV检测 293细胞蛋白残留量
无菌试验 （含支原体） 细菌内毒素 小鼠异常毒性试验
腺病毒载体工艺平台介绍
研发中心厂房及设备
源兴基因药物研发中心建筑面积1900多平方 米，其中符合国家GMP要求的洁净厂房面积1600 多平方米，包括原液生产车间、制剂生产车间、 质量控制实验室以及研发实验室。
研发中心配置了NBS细胞罐、AKTA纯化系统、 高速冷冻离心机、切向流超滤系统、二氧化碳培 养箱、生物安全柜、分析型HPLC系统、PCR仪、 电泳仪、酶标仪、超声波破碎仪、超声波西林瓶 清洗机、隧道式灭菌烘箱、液体灌装加塞机、轧 盖机、凝胶扫描成像系统、超纯水仪、多效蒸馏 水机等仪器设备。
罐细胞染毒
毒种制备
罐病毒培养
纯化
细胞罐葡萄糖消耗监控曲线图
日糖耗(g)
图2 六罐实验日糖耗曲线 70
60 50
40
30
20 10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
培养天数(天)
B0704日糖耗(g) B0802日糖耗(g)
B0705日糖耗(g) B0803日糖耗(g)
B0706日糖耗(g) B0804日糖耗(g)
细胞罐产毒浓度曲线
罐内病毒VP浓度(HPLC峰面积)
图4 EGFR三罐病毒培养期VP浓度曲线
700000
600000
500000
400000 300000
200000
100000 0
0 4 6 30 48 72 96 120 144
1
2
3
4
5
6
7
8
9
病毒培养时间(小时)
品种
治疗性重组 HBV腺病毒疫 苗
代号
CHB3
研究单位
源兴
治疗性HIV腺病 H30
毒载体疫苗
源兴
研究时间
2004年3月至 2005年11月
2005年12月 至2007年8月
治疗性重组腺 病毒EB病毒潜 伏膜抗原疫苗
LMP2
CDC病毒病所委托 源兴承担药学研究
2007年9月至 2008年10月
新药申报三方面研究内容
B0704病毒培养期VP浓度(HPLC峰面积) B0804日收获病毒VP(HPLC峰面积)
B0803日收获病毒vp(HPLC峰面积) 感染时间(小时)
细胞罐病毒收获曲线
日收获病毒VP(e14)
图3 EGFR三罐实验日糖耗&日收获病毒比较
8
7
6
5
4 3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
病毒培养时间(天)
B0704日收获病毒VP(e14) B0804日收获病毒VP(e14)
• 药学研究 • 药效研究 • 安全评价
药学研究主要内容
• 上游构建及鉴定 • 细胞/毒种研究及三级库建立 • 原液工艺研究 • 制剂工艺研究 • 检测方法及质量标准研究 • 稳定性研究 • 试制三批样品
细胞及毒种研究
• 细胞检定、传代稳定性研究 • 毒种检定、代次及遗传稳定性研究
建细胞库
原始细胞
罐 收获物
6000RPM离 心20min 500K膜超滤浓缩10倍
超滤浓缩液 SOURCE 30Q 阴离子交换柱层析
层析收集液 Sepharose 6 Fast Flow 分子筛层析
原液
H30产量
（3批平均）
460ml 1.1×1015 VP
回收率
（3批平均）
53%
细胞罐工艺
细胞复苏培养
罐细胞培养
700
600
500
400
300
200
100
0 0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
min
制剂工艺流程图
原液
检测 西林瓶清洗、干烤
半成品配制除菌 分装
轧盖 灯检 贴签 包装、贮存
病毒保存 液
胶塞灭菌 铝盖清洗、烘干
检测
制剂处方筛选结果
滴度（IU/ml）
不同处方贮存情况比较图
4.50E+09 4.00E+09 3.50E+09 3.00E+09 2.50E+09 2.00E+09 1.50E+09 1.00E+09 5.00E+08 0.00E+00
能够满足腺病毒载体药物研发、生产和质量 控制的要求。
研发中心生产系统组织图
总经理
生产总监
工艺开发部 （10人）
质控部 （5人）
设备工程部 （4人）
细胞病毒培养
纯化
制剂分装
清洁辅助
物控部 （3ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ）
研发队伍
• 打造了一支技术过硬的研发队伍，能 够保证工艺水平及产品质量稳定。
• 历经多次新药申报，比较熟悉新药审 评程序和规定，积累了较丰富的申报 经验，能够比较顺利的解决有关问题。
管理制度
• 建立了300多个SOP、SMP等标准程 序和规章管理制度，按照GMP要求 严格规范管理。
研发中心工艺平台
• 研发中心工艺产业化平台是通用型腺病毒载体药 物生产工艺和质量标准研究的药学技术平台，中 试生产工艺水平达到了国内同行业先进水平，可 以在产量及质量上满足腺病毒载体药物临床前和 临床用样品制备的要求。
• 本工艺拥有自主知识产权，可作为腺病毒载体新 药研发及生产的技术基础。
• 5L细胞罐收获物经纯化后产量能达到E15VP/批， 注射液制剂工艺达到了小容量水针1万支/批的生 产能力。
• 产品纯度大于98%，比滴度大于3.3%，各项质检 结果都能达到FDA对腺病毒类生物制品的质量标 准要求。
研发中心已完成申报临床所需药学研究的 品种
细胞扩增
主细胞库
细胞扩增
工作细胞库
细胞来源于ATCC
质量控制 质量控制
建毒种库
原始种子批
病毒扩增
主种子批
病毒扩增
工作种子批
鉴定检 测
质量控 制
质量控 制
原液工艺流程、参数及技术指标
细胞种子
重组腺病 毒种子
细胞罐扩增
5L罐细胞培养，病毒扩增： DO60%,37℃,pH7.2, 耗糖40g/d接种病毒，MOI为20
B0803日收获病毒vp(e14)
纯化工艺
罐病毒收获液 离心
超滤浓缩 酶切
离子交换层析 分子筛层析 原液
纯化图谱
mAU 800
Manual run 1:1_UV1_280nm
Manual run 1:1_UV2_260nm
Manual run 1:1_Cond
Manual run 1:1_Conc
0 123 456 78
贮存时间（周）
处方1 处方2 处方3 处方4
从以上结果可以看出，处方Ⅰ为最优，处方Ⅱ次之，处方 Ⅲ最差，处方Ⅳ较差。于是将处方确定为处方Ⅰ。
质量标准及检测方法
检测项目 外观
（含可见异物） pH 值 装量
鉴别试验
病毒颗粒数
比滴度 （IU/ Vp） HPLC纯度 小鼠效力试验 293细胞DNA
残留量 牛血清白蛋白残留量
RCA
AAV检测 293细胞蛋白残留量
无菌试验 （含支原体） 细菌内毒素 小鼠异常毒性试验