外泌体提取 ppt课件
外泌体研究ppt课件
胞膜融合, 由细胞主动分泌释放到细胞外的腔
泌
内囊泡 (intraluminal vesicles, ILVs)。
体
直径约为30-150nm，具有“杯状”或 “碟状”形态, 外侧含有脂质双分子层。
的 携带母体细胞特征性生物信息分子，如蛋白质、脂质、脱氧核糖核酸(DNA)、信使 RNA(mRNA)、微小RNA（miRNA）以及非编码RNA（Non-codingRNA）等。
“货物”释放进入胞质内，并重新形成多
泌
不同来
泡体。
源的外
体
泌体进
外泌体直接与受体细胞膜融合，将携
入受体
带的“货物”释放进入受体细胞胞质。
的
细胞的 方式
外泌体上的配体与受体细胞膜上特殊
特
受体结合，既能起到信号传导作用，也能 通过内吞作用，将“货物”运入胞内。
征
.
8
外
泌
鉴 定
体 的 分
分
特 点
离 方 法
大部分内容物在外泌体的保 护下能够存在较长时间不被降解 并保持活性，具有较长的半衰期，
药肿
物 载
的
瘤 治
体疗
并且能作用于体内大部分器官，甚至于中枢 神经系统。普通药物会因为血脑屏障的存在 而被拒之脑外，无法发挥其药物活性，而外 泌体作为一种脂质囊泡则能够通行自由，对 于靶向脑部的药物有非常大的发展空间。
试剂盒
近年来各种商业化的外泌体提取试剂 盒逐渐得以推广。
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9
研究生科研汇报
外 泌 鉴 体的 透射电子显微镜 定 (transmission electron microscopy, TEM) 分 观察外泌体的大小、 形态，测量直径 离 与
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一种细胞分泌的小囊泡，它们在细胞间传递信息，参与调控细胞的生理活动，对于细胞间的相互作用和信号传导起着重要的作用。
因此，外泌体的提取方法对于细胞生物学和临床医学研究具有重要意义。
下面将介绍几种常用的外泌体提取方法。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液进行低速离心，去除细胞残渣和细胞碎片，然后将上清液进行高速离心，将外泌体沉淀下来。
最后，用洗涤液洗涤沉淀物，得到纯净的外泌体。
这种方法操作简单，提取效率高，适用于大规模提取外泌体。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜对细胞培养液进行过滤，将外泌体从培养液中分离出来。
这种方法不需要离心步骤，操作简便，适用于小规模外泌体提取。
但是需要注意的是，选择合适的超滤膜孔径和分子量截留率，以确保外泌体能够有效地被提取出来。
3. 密度梯度离心法。
密度梯度离心法是利用不同密度的梯度液体将外泌体与其他细胞成分分离开来。
首先，将细胞培养液加入密度梯度离心管中，然后进行超速离心，外泌体会沉淀在不同密度的梯度液体中。
通过调整离心参数，可以将外泌体从其他细胞成分中有效地提取出来。
这种方法提取的外泌体纯度较高，适用于对外泌体纯度要求较高的实验。
4. 免疫亲和法。
免疫亲和法是利用外泌体表面蛋白与特定抗体的结合来提取外泌体。
首先，将抗体固定在亲和树脂上，然后将细胞培养液与亲和树脂进行免疫反应，外泌体会与抗体结合，然后通过洗涤等步骤将外泌体从亲和树脂上提取出来。
这种方法可以选择特定的外泌体蛋白进行提取，适用于对外泌体特定蛋白的研究。
总结。
外泌体的提取方法多种多样，可以根据实验的需要选择合适的方法。
在进行外泌体提取时，需要注意操作规范，避免外泌体的污染和损失。
同时，根据实验要求选择合适的提取方法，可以提高外泌体的提取效率和纯度，为后续的实验研究提供可靠的样品。
希望以上介绍的外泌体提取方法能够对您的研究工作有所帮助。
细胞生物学-外泌体-文献汇报ppt课件
离
验
及
培
养
统
计
Matrigel体内
学
成血管实验
处
理
HUVEC网状 结构形成实验
PKH26荧光标记 外泌体观察与 HUVEC间相互作 用
Matrigel：基底膜基质
HUVEC. ：人脐带静脉内皮细胞
骨髓间充质干细胞的分离及培养 无菌抽取
正常献髓者骨髓 约5ml
密度梯度离心法
骨髓单个核细胞
DF12完全培养液
• MSC可以抑制淋巴细胞产生和分泌IFN-γ，我们实验结果也证明在培养 PBMNC时，加入BM-MSC分泌的外泌体能抑制其产生IFN-γ，这说明外泌体 可能是其中一个作用机制。miR．301a为NF—KB通路关键分子，与肿瘤迁移 、炎症反应有关。
• BM—MSC外泌体可以促进HUVEC向血管结构形成，这在临床上有重要应用 价值，如对缺血损伤性疾病等等。
人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体特性研究
• 本研究旨在探讨正常人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)分泌的外泌体(exosome)免疫调节功能及支持血管 形成能力。
• 结论：BMMSC分泌外泌体具有免疫调节功能与支持血管形成作用。
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背景知识
图4
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图5
在两者共培养时BMMSC外泌体明显促进HUVEC网状结构的形成，对照组为(4579． 00±358．38)，实验组为(9149．67±470．70)，结果有统计学意义(P<0．01)(图5)。
在裸鼠体内实验中，在外泌体组 可明显见到血管生成，对照组无肉眼 可见血管生成(图6)。
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图6
讨论
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一种外泌体的提取方法及其应用与流程
一种外泌体的提取方法及其应用与流程一、引言外泌体是一种存在于细胞外液中的小颗粒，其直径一般在30-150纳米之间。
外泌体中富含蛋白质、核酸、脂质等生物分子，具有广泛的生物学功能。
近年来，外泌体的提取方法及其应用得到了广泛关注。
本文将介绍一种常用的外泌体提取方法，并探讨其在生物医学研究中的应用与流程。
二、外泌体提取方法目前常用的外泌体提取方法主要包括超速离心法、滤膜法、沉淀法和免疫亲和法等。
其中，超速离心法是最常用的方法之一。
其主要步骤如下：1. 收集细胞培养上清液或生物体体液，如血浆、尿液等。
2. 进行一系列离心步骤，以去除细胞碎片和大颗粒物质。
一般先进行低速离心，去除大颗粒物质，然后再进行高速离心，沉淀外泌体。
3. 分离外泌体。
将高速离心上清液转移到新离心管中，再次进行超高速离心，将外泌体沉淀下来。
4. 去除上清液，将外泌体沉淀悬浮于适当的缓冲液中。
三、外泌体的应用与流程外泌体作为一种新型的细胞间通讯介质，具有广泛的应用前景。
下面将介绍其在生物医学研究中的应用与流程。
1. 生物标志物的发现与应用外泌体中含有丰富的蛋白质和核酸等生物分子，这些分子的组成和含量可以反映细胞的生理状态和病理变化。
因此，外泌体被广泛应用于生物标志物的发现与应用。
研究人员可以通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，来寻找与特定疾病相关的生物标志物，从而实现早期诊断和治疗监测。
2. 药物传递系统的研究与应用外泌体具有天然的包裹和传递生物分子的能力，因此被广泛应用于药物传递系统的研究。
研究人员可以将药物封装在外泌体中，并通过改变外泌体的表面性质，实现药物的靶向输送和释放。
这种外泌体作为药物传递系统的方法具有较高的稳定性和生物相容性，对于治疗肿瘤等疾病具有潜在的应用价值。
3. 疾病机制的研究与探索外泌体中富含的生物分子可以提供重要的疾病机制信息。
通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，研究人员可以了解疾病发生发展的分子机制，从而为疾病的治疗和预防提供新的思路和靶点。
外泌体提取
外泌体提取
Exosome 分离需知注意： 分离 exosome 前的样品不能加入任何 RNA 保护剂（如 Trizol，RNA later）；已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察， 只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。 1. 血清样品（不能加抗凝剂） （1）干燥管采血后，轻轻将全血滴入洁净的 EP 管或者离心管； （2）4 度下静置 3~4 小时，可见血块析出（也可放置 4 度冰箱过夜）； （3）5000 rpm，4 度离心 10min，可见淡黄色血清，取出上清后可再 3000rpm 4度离心 10min，以最大程度保证血清质量。 （4）将血清分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 2. 血浆样品(不能用肝素抗凝) 1) 用采血针和抗凝管（含 EDTA）抽取全血，混匀； 2) 4 度下静置 3~4 小时（也可放置 4 度冰箱过夜），5000 rpm，4 度离心 5min，取上清即为血浆； 3) 可将血浆分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 3. 细胞上清需要提前预备的实验材料：去除 exosome 的血清（自己制备或购买） 1) 培养皿的细胞汇合率达到 80%~90%时； 2) 把原有培养基吸掉，加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行）进行消化； 3) 细胞变圆后加入等体积的含正常血清培养基终止消化； 4) 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来； 5) 1100rpm，离心 5 分钟； 6) 吸掉上清液，用无 exosome 血清的培养基清洗细胞一次； 7) 1100rpm，离心 5 分钟； 8) 吸掉上清液，加入无 exosome 血清的培养基，悬浮细胞； 9) 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中（ 收集上清时细胞汇合率为60%~80%），继续培养； 10) 培养 48h~72h 后，收集细胞上清； 11) 2000 rpm，离心 10min，然后 10000 rpm, 离心 30min, 去除细胞或者细胞碎片，取上清即可。
干货外泌体的提取储存、临床应用和给药途径
干货外泌体的提取储存、临床应用和给药途径摘要：外泌体是细胞分泌的纳米级细胞外小囊泡，携带核酸、蛋白质、脂质等生物活性物质，在机体的生理病理过程中发挥作用。
与脂质体、纳米颗粒等合成载体相比，外泌体的内源性和异质性使其在疾病诊断和治疗领域具有广泛而独特的优势。
直径约 40-100nm 的外泌体是由细胞分泌的生物纳米级球形脂质双层囊泡，以 1.13-1.19 g ∙ mL-1 的密度漂浮在梯度溶液中。
1981 年，科学家Trams 等将质膜来源的囊泡统称为外泌体，并首次提出了“外泌体”的概念，将其视为具有5'-核苷酸酶活性的膜囊泡，可能具有生理功能，起源于各种细胞系培养物的分泌物。
外泌体 Exosomes目前定义的外泌体（40-100nm）于1983年首次在绵羊网织红细胞中发现，科学家Johnstone 等人追踪了网织红细胞成熟过程中的转铁蛋白受体，发现外泌体的形成是成熟红细胞中转铁蛋白受体丢失的机制细胞。
为了将它们与其他类型的细胞外囊泡(EV) 区分开来，它们被命名为外泌体。
然而，值得注意的是，根据ISEV 2018 指南，“外泌体”一词即使被广泛使用，也被建议替换为“小细胞外囊泡(sEVs)”一词，由于分离方法上的困难。
研究发现，外泌体含有核酸、蛋白质、脂质、细胞因子、转录因子受体等生物活性物质。
其中，外泌体蛋白成分主要分为两类，一类是公共成分，参与这一过程囊泡的形成和分泌，即外泌体无处不在，包括膜转运和融合相关蛋白（如Rab、GTPases）、热休克蛋白（如HSP70、HSP90）、四跨膜蛋白超家族（如CD63、CD81）、 ESCRT 复合物相关蛋白（如 Tsg101、Alix）、整合素等；另一种是特异性成分，与其祖细胞密切相关，即细胞特异性，如抗原呈递细胞来源的CD45和MHC-II。
随着外泌体研究的深入，其应用越来越广泛。
外泌体可以在生理和病理过程中发挥作用，充当细胞间通讯和物质交换的介质。
外泌体研究演示课件
被认为是细胞间分子交换和信息传递的生物纳米颗粒。
6
研究生科研汇报
外
人体中大约有1014个外泌体，近乎于平均每个细胞产生 1000-10000个。
泌
正常细胞及肿瘤细胞均分泌外泌体，恶性肿瘤细胞较非
体
恶性细胞能分泌更多外泌体。通过分析外泌体可以直接获得
癌细胞的基本信息。
的
特
被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液及乳汁等体
体
体在与一种包含多肽的囊泡结合后, 囊泡与
的
细胞膜分离, 分泌到上清, 这是人类首次观测 到游离于细胞外存在的囊泡。
发
现 与
1987年, 他们发现这些囊泡中含有在网织红细胞成熟过程中丢失的一些成分（乙酰 胆碱酯酶、葡萄糖转运蛋白、核苷转运蛋白和转铁蛋白受体等），同时, 他们发现这些 囊泡膜具有网织红细胞细胞膜的特征, 比如也有极高的鞘磷脂含量, 显示了其区别于细胞
纳米粒子跟踪分析 (nanoparticle tracking analysis, NTA)
测量外泌体的直径
Western-blot （ WB ） 法 或 磁 珠 分选的免疫学方法等可清楚地 分析外泌体表面存在标志蛋白
流式细胞技术
(flow cytometry, FACS) 分离外泌体并分析其纯度
Байду номын сангаас
10
的 特 征
携带母体细胞特征性生物信息分子，如蛋白质、脂质、脱氧核糖核酸(DNA)、信使 RNA(mRNA)、微小RNA（miRNA）以及非编码RNA（Non-codingRNA）等。
表面标记蛋白主要有 Alix，TSG101，CD63，CD9，CD81和 HSP70。主要含有以下几种 物质：MHC I 类和/或 II 类分子、热休克蛋白（hsp）、四跨膜蛋白、整合素、细胞骨架 蛋白以及一些生物酶类。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一种细胞外囊泡，其在细胞间传递信号、调节免疫应答、参与细胞间通讯等方面发挥着重要作用。
因此，外泌体的提取方法对于研究细胞间通讯、疾病诊断和治疗等具有重要意义。
本文将介绍几种常用的外泌体提取方法，希望能够对相关研究工作提供一定的参考价值。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养上清液收集起来，并经过一系列离心步骤，逐渐提取出外泌体。
这种方法操作简单，提取效率较高，适用于大量样本的处理。
但是，超速离心法需要专业的离心设备，并且在操作过程中需要严格控制离心参数，以确保外泌体的完整性和纯度。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜的选择性透过性，将外泌体从细胞培养上清液中分离出来的方法。
这种方法操作简便，无需离心设备，适用于小样本的处理。
但是，超滤法对超滤膜的选择和使用要求较高，需要根据外泌体的大小和特性选择合适的超滤膜，以确保提取的外泌体具有较高的纯度和完整性。
3. 免疫磁珠法。
免疫磁珠法是利用特定抗体与外泌体表面标记物的结合，通过磁珠的作用将外泌体从细胞培养上清液中提取出来的方法。
这种方法操作简便，提取效率高，适用于特定标记物的外泌体的提取。
但是，免疫磁珠法需要具有高特异性和亲和性的抗体，且对于不同类型的外泌体需要选择不同的抗体，因此在实际操作中需要进行充分的前期筛选和验证工作。
4. 超声法。
超声法是利用超声波对细胞培养上清液进行处理，破碎细胞膜，将外泌体释放出来的方法。
这种方法操作简便，无需昂贵的设备，适用于小样本的处理。
但是，超声法对超声处理的参数和时间需要进行严格控制，以避免外泌体的损伤和降解。
综上所述，外泌体提取方法各有特点，选择合适的方法需要根据具体实验要求和条件来确定。
在实际操作中，需要根据样本的特性和实验的目的，选择合适的外泌体提取方法，并进行充分的验证和优化工作，以确保提取的外泌体具有较高的纯度和完整性。
希望本文介绍的外泌体提取方法能够对相关研究工作提供一定的帮助和参考价值。
最常用的外泌体提取方法
最常用的外泌体提取方法外泌体作为近几年来的研究热点，受到了科研工作者的青睐及追捧。
由于外泌体内携带有大量的miRNA, 少量lncRNA,Mrna 以及DNA蛋白质成为液体活检的潜力无限的研究对相。
所以，获得纯度高、内容物完整的外泌体非常之重要，那么，外泌体的提取方法也显得尤为重要。
一、差速离心法差速离心法可以说是最传统最普遍的外泌体提取方法。
原理是：首先低速离心以除去细胞和细胞凋亡碎片；随后，高速离心以去除大囊泡；最后高速离心以沉淀外泌体。
具体步骤是: 以下所有步骤都在4℃下进行，1、300×g 10min，弃沉淀，去除细胞2、2000×g 20min，弃沉淀，去除死细胞3、10,000×g 30min ，弃沉淀，去除细胞碎片等亚细胞成分4、10,000×g 70min，弃上清，沉淀即为外泌体5、PBS（每10ml细胞培养液用30mlPBS重悬）清洗沉淀物，混匀， 10,000×g 70min6、l ml PBS溶解沉淀（外泌体），立即使用或置于-80℃备用。
7、一般超速离心法会结合密度梯度离心，这样得到的外泌体更纯，具体做法第4步后蔗糖梯度离心，10,000×g 70min，以去除密度大于1.21g/ml的颗粒。
优点是：成本低，操作简单，获得的囊泡数较多。
缺点是：耗时耗力（需用时8-30h，并且每次只能处理6个样本），获得的外泌体纯度不是很高，高速及重复离心也会对外泌体产生很大的伤害，并且不适用于如血浆和血清等粘性液体生物样本。
二、密度梯度离心法该方法由于比较繁琐，用的较少。
原理是：像所有的脂质小囊泡一样，外泌体可以悬浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范围1.13g/ml-1.21g/ml，将要分离外泌体的样本液体置于梯度蔗糖介质上，随后通过离心将外泌体分离。
此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时，对离心时间极为敏感。
具体步骤是：收集培养2d的上清液。
外泌体的介绍和进展ppt课件
•种类繁多
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外泌体可以看作细胞的信使，分泌母细胞的缩微 ，以旁分泌和自分泌的形式影响远处细胞从以下 几种方式影响 这也就是为什么主要的研究存在 于肿瘤领域
•免疫 •凋亡 •血管生成 •炎症 •凝结 •----内异症
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外泌体的功能
•外泌体可以携带蛋白，运送RNA，在细胞间物质和 信息转导中起重要作用。外泌体可能通过调控免疫 功能，促进肿瘤血管新生和肿瘤转移，以及直接作 用于肿瘤细胞等途径，影响肿瘤的进展。外泌体可 应用于肿瘤的诊断。本文总结了近年来有关外泌体 在肿瘤发展中作用的研究进展。
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治疗部分
•目前关于其治疗文献研究不多，但其思路是癌细胞和免疫细胞都会释放不同的 Exosome，根据癌细胞释放的exsomes不同，癌症远处转移的器官不同，我们如果 能够block癌症释放的exosomes，加强免疫细胞的exosomes的免疫监视，则能够 治疗癌症
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•Exosomes----the next small thing
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But...
•"I don't think GPC1 CrExos is a cancer-specific biomarker," commented Nicola Schultz, MD, PhD, a consultant surgeon in the Department of Gastrointestinal Surgery and Transplantation at the Rigshospitalet, University of Copenhagen, in Denmark, who was approached by Medscape Medical News for comment.5来自exosomes的应用
peg提取外泌体原理
peg提取外泌体原理
外泌体是一类由细胞中分泌的小囊泡组成的细胞外泡泡，它们在细胞间传递信号、调节细胞功能并参与许多生物学过程中起着重要的作用。
PEG（聚乙二醇）提取外泌体的原理是利用PEG对外泌体的特殊亲和力，将其与外泌体相互结合，然
后通过离心等方式将外泌体与其他成分分离。
PEG提取外泌体的步骤可以简要概括如下：
1.准备样品：首先，我们需要获得含有外泌体的细胞培养液或体液样品。
这个
样品可以是细胞培养基中的上清液、血浆、尿液等。
2.预处理样品：为了去除残留的细胞碎片、蛋白质和其他物质，我们首先对样
品进行预处理。
这可以通过离心将样品离心来去除大颗粒物质，然后用滤膜过滤以去除更小的颗粒物质。
3.PEG结合：将样品与一定浓度的PEG混合，并在适当的温度条件下进行搅拌。
PEG与外泌体之间存在特殊的相互作用力，使得它们结合在一起形成复合物。
4.离心：将PEG和外泌体的复合物通过离心的方式分离出来。
通过调整离心的
速度和时间，我们可以获得不同大小和浓度的外泌体颗粒。
5.洗涤：为了去除与复合物中的PEG残留物，我们可以使用缓冲液对复合物进
行洗涤。
这可以通过多次离心的方式进行。
6.最后抗凝固洗涤：在洗涤过程中可以添加抗凝固剂，以防止外泌体在洗涤过
程中的凝聚。
通过以上步骤，我们可以有效地从样本中提取外泌体。
PEG提取外泌体的方法
简单、高效，并且可以得到高纯度的外泌体颗粒。
这为研究外泌体的组成、功能和生物学机制提供了重要工具和平台。
体液中外泌体(Exosomes)的提取
【注】： 冻存样品置水浴锅解冻后置 2-8℃保存。 -4-
2. 将样品在 4℃条件下，3000g 离心 15 分钟。弃沉淀，收集上清。 3. 小心将上清移入另一干净离心管中。 4. 将样品在 4℃条件下，10000g 离心 20 分钟。弃沉淀，收集上清。 5. 小心将上清移入另一干净离心管中。 6. 在 4ml 上清中加入 1ml 提取液 A，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀 1 分钟左右，使液
产品特点： 使用方便，无需超速离心，省时省力； 纯度高，富集量大，应用范围广； 获取的 Exosome 结构和功能完整； 稳定性好，便于运输，便于保存。
相关试剂盒选择指南：
货号 BB-3901 BB-39012 BB-39013 BB-39014
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使用方法：
使用注意事项： 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂。 以下以 4ml 体液为例，实际操作时按体液和提取液 A 用量体积比 4：1 使用即可。 不同体液中所含的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择体液样品的量，根据下游应用和
参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的体液样本。 除非已经确认体液样本中含有较多外泌体或者体液样本较难获得，一般体液样本建议每个样体
-5-
抽提得到的 RNA 浓度低？ 很多细胞外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样 量。
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Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒 BB-4101
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外泌体,未来的医学研究和应用新方向共35页PPT
外泌体,未来的医学研究和应用新方向
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
外泌体,未来的医学研究和应用新方向共33页PPT共35页
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
外泌体,未来的医学研究和应用新方向 共33页
16、自己选择的路、跪着也要把它走 完。 17、一般情况下)不想三年以后的事， 只想现 在的，心里必须 充满光 明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的 人只能 引为烧 身，只 有真正 勇敢的 人才能 所向披 靡。
Thank you
外泌体提取的具体步骤及方法
外泌体提取的具体步骤及方法外泌体提取的具体步骤及方法外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。
其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
现已证实可以分泌外泌体的细胞有：肥大细胞、淋巴细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞等。
外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。
同时，不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。
1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。
多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。
其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。
有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。
外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。
由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。
外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。
据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离：1. 超速离心法（差速离心）超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。
干货肿瘤组织外泌体提取全流程
干货肿瘤组织外泌体提取全流程一些小伙伴们看了前期有关组织外泌体的软文后，咨询组织外泌体的提取方法，感受到大家的热情，吉凯基因外泌体平台组织外泌体项目的小伙伴们专门为大家准备了直观的流程图片，来吧，让我们一起看看以MDA-MB-231肿瘤组织为例的外泌体提取过程吧!相关实验材料及耗材冻存的肿瘤组织、胶原酶（Gibco）、PBS缓冲液、RPMI-1640基本培养基、Quick-Seal Centrifuge Tubes（Beckman）等。
相关仪器和设备. 01恒温孵育器（Eppendorf ThermoMixer C）. 02小型冷冻离心机（Thermo Fresco21）. 03超速离心机（Beckman Optima XPN-90）一、实验方法及步骤1. 预处理样本：肿瘤组织获取后，用PBS缓冲液冲洗干净，切成小块，称重，20mg的肿瘤组织加入500ul 含Ⅰ型胶原酶的RPMI-1640基本培养基，如图：清洗干净的MDA-MB-231瘤体。
2. 酶解组织：将组织小块与胶原酶的混合液放到恒温孵育器中，37℃，震荡消化，期间进行1-2次轻柔的翻转，20min后轻轻地用移液枪吹打，混匀，继续消化直到无块状颗粒，如图：消化好的肿瘤组织3. 去除细胞：4℃，300g离心5min，如图：4. 去除组织碎片：转移上清液到新的1.5ml EP管中，4℃，2000g离心10min，如图：5. 去除较小的杂质：转移上清液到新的1.5ml EP管中，4℃，10000g离心30min，如图：6. 富集外泌体：收集上清液并用0.22um滤网过滤，装到Quick-Seal Centrifuge Tubes中，用预冷的PBS补满，4℃，120000g离心90min，可明显观察到沉淀，此沉淀的为外泌体粗提物，如图：7. 纯化外泌体：弃上清，用PBS重悬沉淀，并装到新的Quick-Seal Centrifuge Tubes中，4℃，120000g离心70min，此次的白色沉淀即为外泌体。
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25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
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29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
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30、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
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26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
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27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
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28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
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外泌体提取
Nanosight（NTA） 测粒径大小
电镜
测颗粒形态
有风险！
因为标本各异，提 取出外泌体进行电 镜检测可能无法得 到典型的图片
2. 血浆样品(不能用肝素抗凝) 1) 用采血针和抗凝管（含 EDTA）抽取全血，混匀； 2) 4 度下静置 3~4 小时（也可放置 4 度冰箱过夜），5000 rpm，4 度离心 5min，取上清即为血浆； 3) 可将血浆分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上
外泌体提取
Exosome 分离需知注意： 分离 exosome 前的样品不能加入任何 RNA 保护剂（如 Trizol，RNA later）；已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察， 只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。 1. 血清样品（不能加抗凝剂） （1）干燥管采血后，轻轻将全血滴入洁净的 EP 管或者离心管； （2）4 度下静置 3~4 小时，可见血块析出（也可放置 4 度冰箱过夜）； （3）5000 rpm，4 度离心 10min，可见淡黄色血清，取出上清后可再 3000rpm 4度离心 10min，以最大程度保证血清质量。 （4）将血清分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上
3. 细胞上清需要提前预备的实验材料：去除 exosome 的血清（自己制备或购买） 1) 培养皿的细胞汇合率达到 80%~90% 2) 把原有培养基吸掉，加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行）进行消化； 3) 细胞变圆后加入等体积的含正常血清培养基终止消化； 4) 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来； 5) 1100rpm，离心 5 分钟； 6) 吸掉上清液，用无 exosome 血清的培养基清洗细胞一次； 7) 1100rpm，离心 5 分钟； 8) 吸掉上清液，加入无 exosome 血清的培养基，悬浮细胞； 9) 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中（ 收集上清时细胞汇合率为60%~80%），继续培养； 10) 培养 48h~72h 后，收集细胞上清； 11) 2000 rpm，离心 10min，然后 10000 rpm, 30min, 去除细胞或者细胞碎片，取上清即可。