高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸残留

高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸残留

【摘要】目的建立高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸的残留含量。方法色谱柱：采用Hypersil ODS柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长210 nm，流动相：0.08%磷酸溶液（Ph 3.0）-甲醇（95：5），流速1.0 ml/min，柱温：35℃。结果三氟乙酸浓度在 2.05～12.12 μg/ml范围内，线性关系良好，r=0.9998；检测限为1.0 ng；加样回收率平均为98.57%，RSD 为0. 99%。结论此法可用于塞来昔布中三氟乙酸含量的测定，准确度高。

【关键词】塞来昔布；高效液相色谱法；三氟乙酸；含量测定

塞来昔布（4-[5-（4-甲基苯基）-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺）是第一个在骨关节炎和风湿病的治疗中起作用的COX-2抑制剂[1，2]。这个药与传统的非类固醇性抗炎剂联用时无通常的副作用。GD Searle研发出了塞来昔布，目前市场上商品名为西乐葆。

在塞来昔布的合成工艺中，一般以对甲基苯乙酮和三氟乙酸乙酯经Claisen 缩合反应制得中间体，然后与对苯磺酰胺基苯肼盐酸盐化合制得塞来昔布。由于三氟乙酸乙酯会水解生产三氟乙酸，因此在塞来昔布原料药的质量标准中，对三氟乙酸限量有明确要求，进口注册标准中规定三氟乙酸不得超过0.04%。本实验建立了高效液相色谱法（HPLC）测定塞来昔布中三氟乙酸残留的方法。

1 材料

塞来昔布，江苏正大清江制药有限公司提供，批号：20121029、20121103、20121109、20121118；三氟乙酸对照品（色谱纯），美国天地试剂有限公司；甲醇（色谱纯），江苏汉邦科技有限公司；其余试剂均为市售分析纯。美国Waters Alliance 2695 高效液相色谱仪，2487紫外可变波长检测器，Empower 2色谱工作站。

2 方法与结果

2. 1 色谱条件色谱柱：Hypersil ODS 柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：0.08% 磷酸溶液（pH

3.0）- 甲醇（95：5）；流速：0.8 ml/min；检测波长：210 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μl。

2. 2 溶液配制

2. 2. 1 对照品溶液的配制取三氟乙酸对照品适量，精密称定，加流动相溶解并制成每 1 ml 中含三氟乙酸10.1 μg的溶液，作为对照品溶液。

2. 2. 2 供试品溶液的配制取塞来昔布适量，精密称定，加流动相溶解并制成每1 ml中含塞来昔布25 mg 的溶液，作为供试品溶液。

2. 3 测定方法精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪。记录色谱图（见图1），按外标法以峰面积计算供试品溶液中三氟乙酸的含量。

A.对照品溶液

B. 供试品溶液

图 1 塞来昔布中三氟乙酸测定的HPLC色谱图

2. 4 加样回收率测定用加样回收法，精密量取供试品溶液250 mg，置10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为回收试验用空白溶液（浓度为25 mg/ml），另精密量取塞来昔布样品250 mg分别用含三氟乙酸8.08、10.10、12.12 μg/ ml的对照溶液溶解并定容到10 mL 量瓶中，释至刻度，摇匀，作为回收率测定溶液，按2.3项方法分别测定，并计算回收率，测定结果见表1。平均回收率为98. 57%，RSD（n= 9）为0.99%。

2. 5 线性范围取三氟乙酸对照品适量，精密称定，加流动相溶解并分别稀释制成、2.02、4.04、6.06、8.8、10.10、12.12 μg/ ml的溶液，依次进样20 μl，记录色谱图，以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X，g/ml）为横坐标，进行线性回归。回归方程：Y = 958.75X-90.07，r=0.9998，线性范围为2.05～12.12 μg/ml。

2. 6 精密度测定取塞来昔布（批号：20121029）适量，精密称定，加流动相溶解并制成每 1 ml 中含塞来昔布25 mg的溶液，作为供试品溶液，共配制6 份，按2.3项方法分别测定三氟乙酸的含量，均未检出。

2. 7 检测限取三氟乙酸对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成1.01 μg/ml 的溶液，进行测定，信噪比S/N=3，测得三氟乙酸的检测限为

1.0 ng。

2. 8 塞来昔布中三氟乙酸含量测定取塞来昔布4批（批号：20121029、20121103、20121109、20121118），按2.3 项方法测定三氟乙酸的含量，结果均未检出。

3 讨论

目前三氟乙酸含量测定的方法多采用气相色谱法[3]，由于三氟乙酸的极性大，酸性强，对气相色谱柱损伤大，分析成本较高，且效果不是很理想。而用氧瓶燃烧法测定氟的含量[4，5]，操作繁琐且误差较大，且塞来昔布样品本身含有氟元素干扰样品检测。另据报道[6]，也可考虑用强酸型阳离子交换色谱柱测定三氟乙酸的含量，本文采用C18色谱柱分离测定塞来昔布中三氟乙酸的含量，方法简便，准确度高。在三氟乙酸对照品的配制过程中，因三氟乙酸极易挥发，故在称量过程中，量瓶内应先加入适量流动相，再加入三氟乙酸后需充分振摇，使三氟乙酸充分溶解于流动相中，减量法称样比较准确。

在整个试验过程中，塞来昔布主峰未能洗脱出来，多次进样尚未发现其对三氟乙酸测定有干扰，因此，应对色谱柱进行清洗后再保存。

参考文献

[1] Simon L S，Lanza F L，Lipsky P E，et al.Preliminary study of the safety and efficacy of SC-58635，a novel cyclooxygenase 2 inhibitor：efficacy and safety in two placebo-controlled trials in osteoarthritis and rheumatoid arthritis，and studies of gastrointestinal and platelet effects.Arthritis & Rheumatism，1998，41（9）：1591-1602.

[2] Goldstein J L，Silverstein F E，Agrawal N M，et al. Reduced risk of upper gastrointestinal ulcer complications with celecoxib，a novel COX-2 inhibitor. The American journal of gastroenterology，2000，95（7）：1681-1690.

[3] 孟静娟，单风平.气相色谱法测定液相合成蛋酸脑啡肽中杂质残留量.微生物学杂志，2008，28（3）：106 -108.

[4] 颜冬梅.人发中微量氟的测定.医疗保健器具，2008，15（9）：74-75.

[5] 张莉，晁若冰.有机药物中残留三氟醋酸测定方法的研究.华西药学杂志，2001，16（6）：427-428.

[6] 高春，高恒莹，姚瑛，等.高效液相色谱法测定醋酸奥曲肽中醋酸含量.中国生化药物杂志，2004，25（4）：237 -238.