呋喃唑酮及其代谢物 牙鲆肌肉组织

2013 年 20 中国渔业质量与标准
为色谱纯， 其他未做特别说明的实验药品均为分析 纯， 实验所用水为 Millipore 纯水器制备的超纯水。 1． 1． 3 牙鲆 选自辽宁省旅顺市太平洋海珍品养殖基地 ， 平均 质量为 100 g， 鱼体表面无白化或黑化斑块， 体质健 壮， 经抽样检测无呋喃唑酮和 AOZ 残留后作为实验 用鱼， 共 200 尾， 实验期间水温为（ 22 ± 2 ） ℃ 之间。
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实验方法
给药与采样 称取 2． 00 g 呋喃唑酮于 200 mL 烧杯中， 先用少
量淀粉糊将呋喃唑酮制成乳化液， 再加入约 200 mL 水， 待完全溶解后转移到 250 mL 容量瓶中定容， 配制 的药物浓度为 8． 0 mg / mL。采用灌服的方式喂药， 每 尾鱼灌服 1 mL， 灌服剂量约为 80 mg / kg （ 以体质量 计） 。具体操作如下： 先将鱼随机捞出， 以 1 mL 的一 次性针管抽取 1． 0 mL 药液， 小心的插入牙鲆喉部， 推 拔出针管， 稍待片刻， 将鱼放回池中， 并开 入药液后， 始计时（ 灌喂过程中有回吐的鱼应弃去） 。 1． 5 、 2、 本实验共设置 28 个采样点， 分别为： 0． 5 、 2． 5 、 3、 3． 5 、 4、 4． 5 、 5、 5． 5 、 6、 7、 8、 9、 10 、 12 、 14 、 16 、 18 、 20 、 24 、 36 、 48 、 96 、 144 、 240 、 384 、 528 h； 每个采样点随 机抽取牙鲆 6 尾。 迅速将牙鲆处死后取其背部肌肉 20 ～ 25 g， 置于冰箱中 － 20 ℃ 冷冻待用。测试呋喃唑 酮和代谢物 AOZ 的牙鲆鱼分别取样， 每一个样取一 尾鱼， 每组药物 3 个平行样。 1． 2． 2 1． 2． 2． 1 标准品溶液的制备 呋喃唑酮标准工作液配制 呋喃唑酮标准储备液： 称取 10． 0 mg 呋喃唑酮， 用乙腈水溶液溶解并稀释定容至 50 mL 棕色容量瓶
mL / min； 检 测 波 长 365 nm； 柱 温 为 25 ℃ ； 进 样 量 20 μL。 1． 2． 4． 2 AOZ 检测
呋喃唑酮 （ Furazolidone ） 是硝基呋喃类药物的一 ［1 － 3 ］ 。 该药主要用来防治水生动物的细菌性疾病 种， 呋喃类药物曾被广泛用于鱼类养殖 ， 虽然呋喃唑酮在 ［4 ］ 生物体内的消除时间很短 ， 但其代谢物 3 － 氨基 － 2 － 噁唑烷酮（ AOZ） 能够与组织蛋白结合， 且消除时 ［5 ］ 可在胃部的酸性 间较长 。AOZ 与组织蛋白结合， 具 有 很 强 致 癌 作 用 。 因 此， 环境中 被 释 放 出 来， 1995 年起欧盟禁止硝基呋喃类药物在畜禽及水产动 物食品中使用， 并严格限定水产品中硝基呋喃及其代 ［7 ］ 谢物的残留限量为 1 μg / kg 。 美国 21 CFR 530． 41 规定食源性动物禁止使用呋喃唑酮和呋喃妥因 ， 韩国 2002 年版《食品公典 》 规定猪肉中不得检出呋喃唑 酮。我国农业部在 2002 年 193 号公告《食品动物禁 用的兽药及其他化合物清单 》 中撤销其产品批准文 号， 明确规定禁止在所有食物动物中以任何用途使 ［8 ］ 用， 残留限量为 1 μg / kg 。 关于呋喃唑酮和呋喃西林代谢物在大菱鲆 罗非鱼
中国渔业质量与标准 2013 年 3 月 Mar. 2013 Chinese Fishery Quality and Standards Vol. 3 No. 1 第3 卷 第1 期
呋喃唑酮及其代谢物在牙鲆肌肉组织中的代谢动力学研究
收稿日期： 2013 － 01 － 03 ； 接收日期： 2013 － 03 － 06 资助项目： 中央级公益性科研院所基本科研业务费（ 2012A10 ） 和（ 20603022011014 ） 作者简介： 刘莹（ 1980 － ） ， 女， 工程师， 研究方向为水产品质量安全 。E － mail： qd8588@ 126． com 通信作者： 李兆新， 博士， 副研究员， 主要从事水产品质量安全检测与控制技术研究 。E － mail： lizx@ ysfri． ac． cn
中， 在冰箱中冷藏保存， 保存期 1 个月。该液 1 mL 相 取呋喃唑酮标准储 当于 200 μg 呋喃唑酮。 临用前， 备液， 用流动相稀释成 0． 01 ～ 1． 00 μg / mL 的标准工 作液。 1． 2． 2． 2 AOZ 标准溶液的制备 AOZ 标准储备液（ 0． 5 mg / mL ） ： 精确称取约 5． 0 mgAOZ， 4 ℃ 用甲醇溶解并定容于 10 mL 容量瓶中， 。 冷藏保存 AOZ 标准工作溶液： 准确吸取 AOZ 标准储备液， 4 ℃ 用水逐级稀释配制成 100 ng / mL 标准工作溶液， 冷藏保存。 氘代内标储备液（ 0． 5 g / L） ： 准确称取 5 mg 氘代 内标物 AOZ － d4 ， 用甲醇溶解并定容于 10 mL 容量 4 ℃ 冷藏保存。 瓶中，
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值较高。 呋喃唑酮已经禁用， 但是禁而不止， 在牙鲆 养殖中违法使用现象仍然存在。 本研究探讨了呋喃 唑酮及其代谢物 AOZ 在牙鲆肌肉组织中的代谢和消 除规律。
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材料和方法
仪器、 试剂及材料
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仪器 Agilent 1100 高 效 液 相 色 谱 仪， 配 紫 外 检 测 器； Agilent 1100 离子阱质谱仪， 配有 Agilent 1100 液相色 谱仪、 自动进样器和电喷雾离子源（ 美国 Agilent 科技 有限公 司 ） ； Anke TDL － 40B 离 心 机 （ 日 本 日 立 公 司） ； Laborota400 型 旋 转 蒸 发 仪 （ 德 国 Heidolph 公 司） ； HZS － H 水浴恒温振荡器（ 哈尔滨市东联电子技 术开发有限公司 ） ； IKA － T18basic 匀质机 （ 德国 IKA 公司） ； pHS － 3C 精密 pH 计（ 上海雷磁仪器厂 ） ； Milli
1， 3 2* 1 2 3 刘莹 ， 李兆新 ， 郑炯 ， 邢丽红 ， 王英姿
（ 1． 青岛市渔业技术推广站， 青岛 266071 ； 2 中国水产科学院黄海水产研究所，青岛 266071 ； 3． 中国海洋大学化学与化工学院， 青岛 266003 ） 摘要： 采用高效液相色谱法和液相色谱 － 串联质谱联用法分别测定牙鲆肌肉组织中的呋喃唑酮及其代谢物 3 － 氨基 － 2 － 噁唑烷酮（ AOZ） 的残留浓度。在（ 22 ± 2 ） ℃ 条件下， 研究了单剂量口灌条件下（ 以 80 mg / kg 计） ， 呋喃唑酮及其 代谢物 AOZ 在牙鲆肌肉中的代谢规律 。结果显示： 1 ） 呋喃唑酮在牙鲆肌肉组织中的药 － 时曲线出现明显的双峰现象， 非房室模型统计矩原理分析药动学数据， 第一次达峰时间 Tmax（ 1） 出现在 2 h， 第一次达峰浓度 Cmax（ 1） 为 3 060． 5 μg / kg； 第 二次达峰时间 T max（ 2） 出现在 8 h， 第二次达峰浓度 C max（ 2） 为 508． 3 μg / kg； 药 － 时曲线下面积 AUC 为 10． 9 ； 平均滞留时 间 MRT 为 6． 9 h， 说明呋喃唑酮在牙鲆体内吸收较迅速， 消除时间较短。2 ） 代谢物 AOZ 在牙鲆肌肉中的药代动力学 一级吸收速率常数 K a 为 0． 2 ， 吸收半衰期 t1 /2Ka 为 3． 2 h， 分布半衰期 t1 /2α 为 4． 2 h， 消除半衰期 模型符合二房室模型， t1 /2β 为 95． 1 。说明代谢物 AOZ 在牙鲆体内吸收、 消除所需时间较长， 直至停药后 528 h 仍然能够检测到残留。［ 中国 2013 ， 3 （ 1 ） ： 19 － 26］ 渔业质量与标准， 关键词： 牙鲆； 呋喃唑酮； 3 － 氨基 － 2 － 噁唑烷酮； 药物代谢动力学； 残留 中图分类号： S94 文献标志码： A 文章编号： 2095 － 1833 （ 2013 ） 01 － 0019 － 26
、ห้องสมุดไป่ตู้
组织中的药物代谢 动力学研究已有报道。呋喃唑酮及其代谢物 AOZ 在 牙鲆体内的药代动力学还未见相关报道。 牙鲆是我 国重要的海水增养殖鱼类品种， 其营养价值和经济价
、 日本鳗鲡
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以及鲤
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－ Q 纯水器（ 美国 Millipore 公司） 。 1． 1． 2 试剂 AOZ 标 样， AOZ － d4 标 样 （ 含 量 ＞ 呋喃 唑 酮， 98% ） ， 美国 SIGMA 公司； 乙腈， 甲醇， 二硝基苯甲醛
氘代内标使用液： 准确吸取氘代内标储备液， 用 4 ℃ 水于逐级稀释配制成 100 ng / mL 标准工作溶液， 冷藏保存。 标准工作曲线的制备： 移取标准工作溶液， 使之 2、 5、 10 、 20 μg / L 的系列浓度， 成为 1 、 分别加入 100 μL 内标工作溶液。 1． 2． 3 样品处理 呋喃唑酮： 称取经均质的匀浆样品约 10 g （ 精确 至 0． 01 g ） ， 加 25 mL 二氯甲烷搅拌分散后浸泡 15 min， 在振荡器上振荡 5 min， 提取液经无水硫酸钠柱 残渣分别用 25 mL 和 15 mL 二氯甲 滤入蒸发烧瓶中， 烷按上述方法各重复提取一次， 再用 15 mL 二氯甲烷 并采用洗耳球吹出柱中液体， 滤 冲洗无水硫酸钠柱， ， 液均滤入同一蒸发烧瓶中 滤液于旋转蒸发仪上在 45 ℃ 左右水浴下减压蒸发去除溶剂， 蒸发速度控制 在每秒一滴。 用 1． 0 mL 流动相和 1． 0 mL 正己烷溶 将液体移入离心管中， 解残渣并充分洗涤蒸发烧瓶， 在 4 000 r / min 离心 5 min， 用尖嘴吸管移去上层正己 烷层， 再向离心管中加入 1． 0 mL 正己烷， 混匀 2 min， 离心， 用尖 嘴 吸 管 移 去 上 层 正 己 烷 层， 下层清液经 0. 45 μm 膜孔滤器过滤后进 HPLC 分析。 AOZ： 称取 2 g（ 精确到 0． 01 g ） 匀化后的样品于 100 mL 聚丙烯离心管中， 加入 100 μL 内标工作溶 液， 加入 20 mL 含 0． 2 moL / L 盐酸的水溶液， 涡动 1 min， 然后加入 500 μL 的 2 － 硝基苯甲醛溶液 （ 0． 05 mol / L 2 － 硝基苯甲醛二甲亚砜溶液） ， 在 37 ℃ 下， 水 浴振荡 16 h。取出上述样品， 冷却至室温， 反应产物 用 0． 5 mL 磷酸钠溶液 （ 0． 3 mol / L ） 中和， 然后用 2 mol / L 的氢氧化钠溶液将 pH 值调节至 7． 0 ～ 7． 5 ， 加 入 5 mL 的乙酸乙酯， 室温振荡 30 min， 然后离心 10 min。将有机相转移至干净的试管， 上述萃取过程重 45 ℃ 蒸到 复一次。 将两次的乙酸乙酯有机相合并， 近干， 然后在氮气流下吹干， 立即用 1 mL 70% 乙腈甲 V / V ） 溶液将残留 酸（ CH3 CN∶ 0． 1% HCOOH = 70∶ 30 ， 物溶解， 过 0． 45 μm 滤膜， 进行 LC － MS / MS 分析。 1． 2． 4 1． 2． 4． 1 仪器条件 呋喃唑酮检测 色谱 条 件： Zorbax SB － C18 柱 （ 4． 6 mm × 250 mm， 5 μm ） ； 流动相： 乙腈 / 水 （ 40 ∶ 60 ， V / V） ， 500 mL 乙腈水混合溶液中加 0． 5 mL 磷酸 （ 85% ） ， 流速 1． 0