植物透射电镜样品制备

图3所示的多层结构即为药室内壁的胼胝质加厚现象。 可见新方法制备的样品能够提高植物样品的分辨率， 使超薄切片显示出更多的微细结构。
3.2 拟南芥
拟南芥是液泡组织较大的植物，在溶液中叶片难 以下沉，是较难固定的植物透射电镜样品。加之， 细胞壁结构坚硬，药物难以渗透，其样品制备更加 困难。若采用常规制备方法，则会出现叶片内部结 构不清晰、切片有颤痕和开裂等不良现象，不能进 行大视野的结构观察和摄影。笔者采用该方法制备 出了30多个此类透射电镜样品，整体信息丰富，结 构保存良好，没有出现效果不良现象。
3 结果
3.1杂种鹅掌楸花粉
细胞壁厚，组织坚硬，药物难以渗透，是典型 的制备难度大的透射电镜样品。采用常规制备方 法，超薄切片常会出现花粉内部结构不清晰、切 片有颠痕、污染等不良现象，甚至无法观察到样 品的超微结构，造成前功尽弃，只能从头再来， 进一步延长了工作周期。笔者采用延长锇酸固定 时间，减少树脂渗透浓度的新方法制备出了50 多个杂种鹅掌楸花粉样品，整体信息丰富，结构 保存良好，没有出现不良现象。
4 结果
4.1 一般情况下，植物样品用锇酸进行后固定，时 间延长可提高固定效果，但植物的种类较多，性 能区别较大，在后固定时需区别对待，对于迅速 发黑的植物样品，用锇酸固定时不易超过2小时， 否则，会造成样品发脆，难以操作，甚至破坏掉 已保存的结构。
4.2 在812树脂渗透的过程中，采用3：1；3：2； 3：3梯度渗透法，主要是提高样品的渗透效果。 根据植物的细胞壁厚，结构密集，药物渗透较慢 的特点，梯度渗透的时间间隔必须在2小时以上， 否则，影响渗透效果。
研究背景
超薄切片的分辨率高，信息丰富，是透射电镜样品制备方法 中最优秀、最常用、最基本的常规技术，从取材到染色有二十 几个步骤，任何环节出现问题都会影响到样品制备质量甚至导 致样品制备失败。加之，植物的细胞壁厚，结构密集，药物渗 透较慢，其制备难度就显得更大一些。
我们经过多次试验，发现采用延长锇酸固定时间和减少树脂 渗透浓度的方法可提高植物透射电镜样品的制备成功率和制备 质量，使植物的花粉、径、叶、根等细胞结构显示得更加清晰， 整体信息提供的更加丰富。经过200多个植物透射电镜样品的 观察，不但能准确观察到植物的超微结构形态，还缩短了植物 透射电镜样品的制备周期。本课件以杂种鹅掌楸、拟南芥和毛 竹三种典型的植物材料为例。
1 材料
1.1 杂种鹅掌楸花粉，南京林业大学校园内 随机取样，浸入3%的戊二醛固定。
1.2 拟南芥，南京农业大学提供，采摘后即 时浸入3%的戊二醛固定。
1.3 毛竹，江苏大学提供，取样后即时浸入 3%的戊二醛固定。
2 方法
样品在3%的戊二醛中，固定2小时以上， 然后0.1mol/l磷酸缓冲液清洗2次，每次10 分钟，锇酸固定5小时后，0.1mol/l磷酸缓 冲液清洗2次，每次10分钟，丙酮梯度脱水， 纯丙酮脱水2次，812树脂按3：1；3：2； 3：3梯度渗透，之后打开样品瓶盖，放置 干燥处8小时，再包埋，梯度聚合，切片， 染色，透射电子显微镜观察。
图4为进行抗水实验的拟南芥大视野观察图面，可见片面 平整、无污染、整体结构保存良好。图5、图6为叶绿体的 全貌和叶绿体组织的片层结构，可见片中信息丰富，结构 清晰，没有污染、肿胀、开裂等不良的现象出现。
3.3 毛竹
毛竹根、茎、叶片的细胞壁坚硬密集，药 物难以渗透，细胞腔大，样品容易吸收二氧 化碳并造成污染，在超薄切片样品制备中属 于难度很大的样品。采用常规制备方法时， 极易出现切片颠痕、严重多个竹叶样品，取得了较为一致的理 想效果。
图7为复水后的毛竹细胞结构状态，片中信息丰富，细胞 内含物质和结构都保存良好。
图8和图9为毛竹经过不同工艺处理后的细胞结构比较。图8为经过加 热处理后的细胞结构状态，可见细胞形态变化较大，呈扭曲状，但无 断裂和损坏现象，内部物质尚能得到保存。切片完整，无颤痕和污染 现象。图9为联合处理后的细胞结构状态，图中显示的内部细胞结构变 化较小，细胞壁基本处于完好状态，个别细胞壁间出现断裂现象，细 胞内部物质保存良好，可见此工艺对毛竹的整体损伤较小。
4.3 样品经树脂梯度渗透后，必须在干燥处放置 8小时以上，最好过夜，否则，在切片时会出现发 散现象。
4.4 812树脂的渗透性能和切割性能都比较好， 是制备植物样品的良好材料，但容易受潮，一 旦受潮发软，切片上会出现波浪型条纹，轻则 影响观察效果，重则无法看到细胞结构。因此， 配制812树脂、树脂渗透和包埋等环节都要在干 燥的环境中进行。尤其在样品渗透时必须放置 在干燥器内或其他干燥、干净的环境中过夜， 使丙酮彻底挥发掉。否则，会造成超薄切片制 备失败。
植物透射电镜样品制备 技术探讨
徐柏森 杨静 南京林业大学电镜室
研究背景
近年来，随着林业经济的不断发展，研究植物 资源的内容也越来越深入，利用透射电镜掌握大量 的植物细胞信息，已经成为科学工作者保护森林资 源和人类生态环境的重要理论依据。但因植物材料 坚硬，难以制备出高分辨的透射电镜样品，从而限 制了透射电镜在植物研究中的应用，同时也影响了 人类对植物资源的开发和利用。为此，电镜样品的 制备技术一直是电镜工作者深入研究的重要内容。
图1为发育正常的杂种鹅掌楸花粉细胞全貌，可见花粉内部 细胞器结构保存良好，细胞壁结构保存完整，边缘信息丰富， 在许多花粉中都可见到尾状突起。
图2为败育的杂种鹅掌楸 花粉全貌，可见花粉内部 的质体减少，线粒体变异， 细胞器呈退化状态，边缘 的细胞壁组织也出现了明 显的变异和加厚现象，使 药物更难渗透，对于此类 样品若采用常规方法制备， 则结构模糊，信息量较少， 往往只能看到少量的片层 结构。采用改进方法对其 进行制备时，由于固定彻 底、渗透均匀，不但可以 很好的保存组织结构，还 可以提供丰富的信息资料。