透射电镜标本制备方法

透射电镜样品制备方法

透射电镜的样品制备方法，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。

一．取材的基本要求

组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞器自溶现象。因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。

（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。

（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm，取样形状为牙签状。也可将组织修成1mm*1mm*2-5mm大小长条形。

因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将

不能得到良好的固定。

（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。推荐使用手术刀或双面刀片。

（4）操作最好在低温（0℃—4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。

（5）取材部位要准确。切片窗小于1mm*1mm，如取样带有太多的多余组织，可能造成你需要的部分刚好被修掉。

二．取材方法（按照自己的样品类型检索）

1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）

动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5 ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官。用手术刀切割取一小块组织，放在干净的硬质板上（例如培养皿底部），滴一滴冷却的固定液。用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1 mm宽，3~5 mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条（牵拉损伤将直接破坏组织，切取时刀片下压，不要来回拉锯），用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的

1.5 ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）4小时或以上。

*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用磷酸盐缓冲液于4度冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。

送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。

2.体外培养细胞的取材（在冰浴上进行）

培养在培养瓶中的细胞取材时，先倒出培养液，用磷酸盐缓冲液清洗培养皿后使用胰酶消化（注意消化程度不可太过），轻轻收集细胞，将悬液转移到离心管中，离心机4℃低速离心（2000转/分）10分钟，使细胞聚成团块，弃去上清，沿壁小心加入新鲜的固定液。保持细胞成团状态，于4℃冰箱中固定，如细胞团体积大于15 ul，固定30 min后用注射器针头将细胞团挑离管壁，可将大团细胞划开成小团，因为团块太大会影响

内部固定效果，但是不可挑成弥散状。原则是必须保证有数个不小于芝麻大小的固体团块，才可以后续操作。冰箱内固定2-3小时。

*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用磷酸盐缓冲液于4度冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。

送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。

3.植物组织取材

植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不像动物细胞那么迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透，因此，植物材料的取材宜切成薄片状或牙签状，推荐使用配方为：（多聚甲醛4%和戊二醛2.5%）的固定液，固定过夜。

*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用磷酸盐缓冲液于4度冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。

送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。

4.细菌及藻类等样品取材

对于不易成团的样品，需先清洗，加入固定液后吹散，于4℃冰箱中固定2-3小时或者过夜，固定结束后，磷酸盐缓冲

液清洗3次，继续按照文献《琼脂铸模法制备透射电镜样品》（白焕红）内描述方法进行琼脂预固定。再将琼脂预包埋后的

样品于4℃冰箱中固定过夜。

*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用磷酸盐缓冲液于4度

冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。

送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用

透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。

磷酸盐缓冲液（三个步骤）

1.磷酸盐缓冲液（0.2M）

甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液乙液：0.2M的磷酸二氢钠溶液

Na2HPO42H2O 35.61g (Na2HPO47H2O) 53.65g (Na2HPO412H2O) 71.64g NaH2PO4H2O 27.60g ( NaH2PO42H2O) 31.21g

加蒸馏水溶解成1000ml 加蒸馏水溶解成1000ml

2. 按下表混合甲、乙两液既得所需pH的0.2M缓冲液（pH值一般为7.4）

0.2M磷酸盐缓冲液的配制

2.将溶液用蒸馏水1：1稀释，则配得0.1M的缓冲液。

改良版琼脂铸膜法：

1．参照之前方法收取藻或细菌，固定清洗后制成高浓度样品悬液备用（一般10 ul固体加入10 ul磷酸盐缓冲液）

2．1.5 ml的EP管，剪下管盖，用剪刀或者烧热的镊子在正中间钻一个圆形小孔，将20ul的枪头插在小孔内，再盖回EP管时，可见枪头在EP管内部悬空，不碰到管壁。

3．向EP管内注入1ml浓度1.5%—2%的热琼脂，盖上第2步做好的管盖，以枪头没入液面下0.5cm为准——如果灌的琼脂少于1ml或者枪头没入太深，会造成后面的操作困难。完成后放在四度或者室温等待充分凝固。

4．凝固后先小心拔出枪头，可见形成一个小孔，即可开盖使用。

5．用黄枪头把第一步做好的悬液加入小孔内，5000转离心5分钟左右，取出后可见样品沉积在小孔底部，一般有2-3mm深，上方的上清液用剪细的滤纸条吸干，但是尽量不要把纸条插进样品里。注意，未吸干会造成下一步封口不严。

6．吸干后，用黄枪头吸取100ul热琼脂灌注封口，一次性注入，溢出也没关系，等待冷却。这个步骤尽量避免在小孔内产生气泡，需要多练习。

7．全部聚合后，取出琼脂块，修切成截面为1.5mm*1.5mm的立方柱。

8．每组样品做2-3个包埋块，做好后4度冰箱内戊二醛固定过夜。

9．按照常规样品进行保存和清洗。