色谱柱相关知识详解演示文稿

键合相色谱柱
以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳 八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点∶
固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响
缺点∶
pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同
对HPLC柱填料的了解（四）
含碳量
含碳量越高，k'值越大（固定相传质效应增加）
残基处理的效果
① 抗坏血酸 ② 烟酰胺 ③ 对氨基苯甲酸 ④ 哌咯西叮 ⑤ 核黄素 ⑥ 苯酚 ⑦ 盐酸硫胺
NovaPak C18
未封口 C18
对HPLC柱填料的了解（六）
硅胶的活性
主要影响碱性化合物的保留行为：k' 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 是选择性差异的主要来源
硅胶的杂质含量
重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志
色谱柱化学及外形结构的关系
液 相 色 谱 柱
填 料 柱 管
质 性 面 表 粒 颗
度 粒 颗 长 度内 径材 料
a 化 学 性 质 ∶ k ，
分 辨 率
N 机 械 因 素 ∶
寿 命 ， 柱 效 ， 速 度 ， 溶 剂 消 耗
对HPLC柱的了解
理论塔板数(N),容量因子(K’),选择性系数(a), 其影响因素有∶
对HPLC柱填料的了解（七）
填料的稳定性
硅胶填料 pH：2-8
聚合物填料
pH：2-12 pH值小于2时 键合相水解
硅 胶 的 溶 解 曲 线
1 2 3 4 5 6 7 8 9 p H
填料基质物理性质的影响
所有C18柱都是相同的吗? 填料基质的物理性质对色谱柱的影响
平均孔径及其分布∶影响被分析样品的分子量，大孔径的可 分析高分子量样品 平均孔体积及其分布∶影响同孔径 含碳量∶影响化合物的保留时间，高含碳量保留时间长 填料的端基封口∶主要影响碱性化合物的峰形，未封口会使 碱性化合物拖尾 硅胶的活性∶主要影响碱性化合物的保留行为：K’，高活性 的K’大 硅胶的杂质含量∶更苛刻条件下的碱性化合物峰形
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Symmetry
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Spherisorb ✓
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Waters不同品牌的色谱柱
m-BondaPak
文献背景强, 是工业标准 平均孔径125Å，10mm高活性、无定形硅胶 中等疏水性表面，端基封口。有独特选择性
Nova-Pak
平均孔径60Å，4mm高韧度低活性球形硅胶 低酸性，高疏水性, 极好的端基封口 有利于小分子物质的分析
H H 3 C S C i H 2 C H 3 H H 3 C S C i H 3 C H 3 H H 3 C S C i H 2 C H 3 H H 3 C S C i H 2 C H 3 H H 3 C S C i H 2 C H 3 H H 3 C S C i H 3 C H 3 O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S i O O O S O iO H O S O iO
N：受平均颗粒度及颗粒度分布的影响,颗 粒度越小,N越高
a：受填料表面化学性质对色谱柱的影响, 不同键合相对不同种类样品分离不同
K’：受键合相表面含碳量的影响,含碳量高 时保留时间长
在同样情况下保留行为也有差异
因此：
需要对色谱化学品(色谱柱)有更多的了解 需要不同品牌，即各个因素有较大差异的色 谱柱，以得到更多种选择性
Waters不同品牌的色谱柱
Resolve
平均孔径90Å，5/10 mm低活性硅胶 非常高的疏水性, 无端基封口 有利于低保留的中性及酸性化合物分离
Delta-Pak
有100Å和300Å两种孔径，5/15 mm硅胶 中到高的疏水性，端基封口 适合于多肽、蛋白的分离及制备色谱
新一代硅胶基质的色谱柱
高含碳量
有利于不易保留的化合物的分离 水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善
低含碳量
有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗
不同色谱柱的含碳量
色谱柱
C%
Symmetry C18 19
Zorbax ODS
17
LiChrosorb RP-18 15
Symmetry C8
12
Resolve C-18
色谱柱相关知识详解演示文稿
优选色谱柱相关知识
对HPLC柱填料的了解（二）
平均孔径/孔体积 孔径/孔体积分布
大的孔径可分析高分 子量的分子
对HPLC柱填料的了解（三）
键合相化学
影响化合物的分离度：a
不同键合相对不同种类的化合物分离不同 可能导致色谱的分离机理不同 如：C18、C8、CN
硅胶表面及键合相
Symmetry
高纯度硅胶：Fe, Al, Mg等均<10ppm 孔径100Å，5m球形颗粒，端基封口 超高含碳量：C18/19%，C8/12% 表面积：300 m2/g 孔体积：1mL/g 特点
12
Ultrasphere ODS 11
Partisil ODS-3
11
mBondpak C-18 10
Nova-Pak C-18 7
k'苊 (50/50的乙腈/水)
17 15.7 10.3 12.5 12.4 11.3 12.0 7.9 5.5
对HPLC柱填料的了解(五)
填料的端基封口
封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%）
Waters拥有众多不同品牌的色谱柱，目的 就是：供不同应用的要求 用不同品牌的色谱柱时，色谱方法有时可 能需要重新开发
Waters各种硅胶基质的色谱柱
C1 C4 C6 C8 C18 Phenyl CN NH2
mBandaPak
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ✓✓
Resolve
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Nova-Pak
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Delta-Pak
Waters色谱柱的内径
分析柱：Waters Spherisorb及其它公司品牌的 色谱柱多为4.6mm内径。Waters传统品牌的分 析柱以3.9mm内径为主，比一般分析柱(4.6mm) 细，因此：
相对灵敏度高 省溶剂，可用相对较低的流速 同样的流速下，柱压较高(高效柱尤为明显) 注意在用文献方法时转换流速,即:降低流速,以 保持线速度相同。
H 3 C
H 3 C
H 3 C H 3 C
C H 2
C H 2
C H 2 C H 2
H 2 C
H 2 C
H 2 C H 2 C
C H 2
C H 2
C H 2 C H 2
H 2 C
H 2 C
H 2 C H 2 C
C H 2 H 2 C
H 2 C C H 2 H 2 C C H 2 H 2 C C H 2