限制酶使用说明

限制酶使用说明

一、分类

目前，已被发现的限制酶，根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类：

类别反应必须因子切点酶例

I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同，切断部位不定Eco B、Eco K

II 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位Eco P I、Hin f III

应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同，其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同，并且其程度也根据酶的不同而千差万别。因而在使用限制酶时，必须对这些要素充分注意，确保目标序列的切断反应能顺利进行，下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。

二、注意事项

1. 甲基化的影响

从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：

在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。另外，动物由来的DNA，CG序列多为5m CG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。

2. Star活性

限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度

条件下进行反应。

3. 部分分解

如果使用预计的限制酶对底物DNA进行作用，而未能完全将其切断，其原因除了上述两点和酶失活之外，DNA的纯度、反应阻害物的影响、DNA的种类等也有关系。特别是由于DNA种类不同，它们的大小、切点数也不同，达到完全分解时，所需要的酶量也不同，从这些数据中计算出的[完全分解1 μg DNA所需要的限制酶预计量] 与[实际量]，也因限制酶的种类不同而有差别，这些差别被认为是酶同其识别位点周围的高级结构亲和程度而产生的。例如，限制酶Nae I 在切断pBR322 DNA时，就有着非常难以切断的部位。另外，因反应液组成变化(如添加精脒)，也可以使切断顺序发生变化。

4. DNA结合物质

限制酶切反应后进行电泳时, 有时会发生电泳带无法确认、电泳带扩散、电泳带移动距离异常等问题，这是由于酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起，使DNA没有进入电泳凝胶中，或DNA难以被溴乙锭染色而造成的。发生这些现象时，在试样中加入一些蛋白质变性剂(如SDS，终浓度0.1%左右)，便可改善电泳效果。

5. 其它

限制酶的保质期一般是在检定日以后的18~24个月内，但几乎所有的限制酶在超过保质期后都不会急剧失活, 因此购入后即使是经过长时间保存的酶，也完全可以使用。

三、活性定义

限制酶的一个活性单位(1 U)，原则上是在50 μl 的反应液中，37℃的温度条件下，经过1小时反应，将1 μg DNA完全分解所需要的酶量。关于测定活性用的底物DNA以及温度，在后面的资料中对每种酶都做了详细介绍。此外酶在其它通用缓冲液中的相对活性，在附表中也有总括记载。

四、纯度检定

每个批号的酶基本上都要进行下列项目的检测：

1. 过剩量酶反应检定

在1 μg底物DNA (通常用λDNA) 中加入过量的限制酶，反应15~18小时，然后进行琼脂糖电泳，根据电泳图谱，判断酶中是否夹杂有非特异性核酸酶。

2. 基因组DNA分析

对指定的限制酶(在酶的分项介绍中标明) 进行该项检测。在适当的细菌DNA底物中(琼脂糖凝胶块中的DNA浓度为0.5 μg/50 μl) 加入20～150 U的限制酶，反应24小时，然后进行琼脂糖电

泳，根据电泳图谱，确认酶中是否含有杂质。

3. 连接—再切检定

把底物DNA首先与2~50倍过量的酶反应，然后回收切断后的DNA，把它溶解于T4 DNA连接酶的缓冲液中[66 mM Tris-HCI (pH7.6)，6.6 mM MgCl2，10 mM DTT，0.4 mM ATP] 使其5’ 末端浓度成为0.1~1.0 μM，加入适量的T4 DNA连接酶，在16℃下反应1小时或16~18小时，再回收DNA 后，把它溶解于限制酶反应液中，用同样的限制酶再进行切断反应。通过以上的实验结果，可以判断是否存在连接酶抑制剂或磷酸酶以及核酸外切酶等杂质。

4. pKF3克隆检测

对于在强制克隆载体pKF3 DNA的多克隆位点上有一个切断点的限制酶，可以进行该项检测。用10倍过量的被检测的限制酶对pKF3 DNA进行作用，失活处理后，将已切断的DNA用DNA连接试剂盒在16℃、30 min的条件下进行反应，将该反应液的一部分转化到TH2感受态细胞中，用两种培养基(LB-Cm-Sm、LB-Cm) 在37℃的条件下培养两个晚上，根据LB-Cm-Sm培养基上是否出现菌落，来判断限制酶中是否含有极其微量的核酸外切酶。

五、甲基化的影响

如果限制酶识别序列中的碱基被甲基化，则根据被甲基化碱基的种类及位置的不同，有时会发生该DNA切不开的现象。

大多数大肠杆菌都带有2种具有特异性识别位点的甲基化酶，即dam methylase (G6m ATC) 和dcm methylase (C5m CWGG)，因此，从这些大肠杆菌中提取的DNA，该序列一般被甲基化。

另外，哺乳类由来的DNA，大多受CG methylase ( 5m CG) 的影响而被甲基化。

受dam methylase、dcm methylase、CG methylase影响的限制酶，在酶的单项介绍中都做了提示，希望在使用中加以注意。

六、Star活性

限制酶根据反应条件的不同，可能会切断与原来识别序列不同的位点，这种不同于原有的特异性的活性，称为Star活性，在各种酶的分项介绍中，我们将容易产生Star活性的酶，以及产生的条件做了注明。

七、双酶切反应

使用两种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion)，是实验操作中常用的手段之一。此时，使用Buffer非常重要。在"Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表 "