脐血间充质干细胞分离培养与鉴定-新桥医院

脐血间充质干细胞分离、培养与鉴定李启明1程天民1李宁2*粟永萍1冉新泽1(1.第三军医大学全军复合伤研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室2.第三军医大学新桥医院, 高压氧中心重庆400038)摘要：目的研究脐带血(HUCB)中含有的间允质干细胞(MSCs)体外分离、培养条件，探讨其作为种子细胞用于下一步实验研究的稳定性与实用性。

方法无菌条件下取正常足生产的脐带血，经CPDA-1复合抗凝剂抗凝，然后经过去红细胞处理，再用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，DMEM/F12培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层，采用定向诱导分化方法检测鉴定获得的MSCs 结果来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞，问充质样细胞为类似成纤维样的细胞形态，但偏向半月形弯曲状，经过成肌、成脂肪、成神经细胞诱导分化成功后确定为间充质干细胞。

结论脐血来源的间充质干细胞能够在体外分离、培养出有用的进一步实验所需要的种子细胞。

关键词：脐带血；间充质干细胞；细胞培养；诱导分化鉴定中图法分类号：文献标识码：THE ISOLATION CULTURE AND IDENTIFICATION OF HUCA MSCsLI Qi-ming, CHEN Tian-min LI ning, SU Yong-ping, RUAN xin-ze(1.State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Institute of Combined Injury,2. Hyperbaric oxygen Center Xinqiao Hospital,Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China)Abstract: Objective To investigate the isolation，cultivation, differentiation and identification of human umbilical cord blood(HUCB) mesenchymal stem cells(MSCs) in vitro，and to observe the feasibility of using MSCs as seed cells in experimental furthermore．Methods HUCB were collected from full term childbirth scheduled for Cesarean section and vagina deliveries, a11 specimens was obtained sterilely with Preservative-free CPDA-1 compound natrium citricum. After lyse red blood cell, the cord blood mononuclear cell was isolated by human lymphocyte separating medium. culture with dulbecco's modified eagle's medium(DMEM/F12) medium to produce adherent layer and identification with orientation differentiation results. Results The UCB-derived mononuclear cells，when set in culture，gave rise to adherent cells, which exhibited either a fibroblast-1ike but crescent-shaped or bending-shaped morphology or mesenchymal-like phenotype. It can be affirmed as the MSCs which characterized with multi-differentiating potentiality after the myogenic、lipogenic and neurogenic differentiation. Conclusion MSCs in HUCB can be isolated and cultivated in vitro，which could be regarded as an alternative source of MSCs for further experimental tests。

Key words: umbilical cord Blood；mesenchymal stem cells；culture in vitro；differentiation and identification*通信作者目前认为，成体干细胞实际上主要是指在不同组织中的间充质干细胞,(MSCs)，它是广泛存在生物体尤其骨髓内的一类干细胞，以前被称为基质干细胞，它最初是由Fnedemteinr 发现的易于贴附于塑料培养板表面的细胞，它可在体外培养条件下大量增殖，又能保持高度末分化状态，具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下可以定向分化为成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞等。

因为1.骨髓的来源受到很大限制，2.由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓MSCs，并可弥补其缺陷的间充质干细胞,同时也为了获得足够量的研究需要的种子细胞；因此，我们探讨了从人脐带血中分离、培养具有多向分化潜能的间充质干细胞的方法。

1材料与方法1.1 主要试剂和仪器：二氧化碳孵养箱(美国Queue产品Forma 3111型)，超净工作台(苏州净化设备厂SW-CJ-2FD)，倒置相差显微镜、荧光显微镜(日本Olympus产品)，高速冷冻离心机(Beckman)，超低温冰箱（SANYO日本），BA61型电子天平（Sartorius公司，德国）。

DMEM/F12培养基(Gibco BRL公司产品)，胎牛血清(Hyclone)，Percoll梯度分离液(Pharmacia)，人淋巴细胞分离液(1.077 g/ml，天津TBD公司)，牛血清白蛋白、地塞米松磷酸钠、吲哚美辛（Sigma美国）胰蛋白酶（Amersco美国）四环素（上海生工）；免疫组织化学染色试剂盒、骨骼肌肌球蛋白(myosin均为武汉博士德），D-Hank氏液（Hyclone美国），β-甘油磷酸钠、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、5-氮杂胞苷（5-Aza）和胰岛素均系Sigma美国产品。

1.2 主要试剂配制：红细胞溶解缓冲液：155mM NH4Cl; 10mM KHCO3和0.1mM EDTA. 并进行过滤、消毒。

完全培养基为：DMEM/F12培养基加10%胎牛血清，PH值调整为7.2±偏酸性。

油红O贮存液：油红O干粉0.5g加入100ml异丙醇中，60℃水浴，玻璃棒搅拌至完全溶解，封口4℃保存。

成脂肪诱导培养系统：常规传代细胞培养液＋10－6mol/L地塞米松＋0.5mmol/L IBMX＋10μg /ml胰岛素＋10-5mol/L吲哚美辛，pH7.2。

成肌诱导培养系统中5-氮杂胞苷(5-Aza)贮存液：5-Aza分子产品包装250mg即1.024mmol，将其完全溶解于102.4ml DMEM/低糖培养液中，配制成1.0×10-2mmol/L的贮存液，-20℃冻存。

成骨诱导培养系统：常规传代细胞培养液＋10－8mol/L地塞米松＋10 mmol/L β-甘油磷酸钠＋50mg/L维生素C，pH7.2。

1.3 脐带血的收集和单个核细胞的分离无菌条件下取正常足月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性孕妇的脐带血底50一80ml，放于含CPDA-1复合抗凝剂的采血袋中，4保存，所有样本均在采集后12h内进行分离；将一份脐血溶解于5～10倍的红细胞溶解缓冲液中，室温下孵育5分钟，20℃时，300⨯g ／mln离心10 min,弃去上清，再用缓冲液洗细胞2次，200⨯g／mln离心10 min,再弃去上清，沉淀用培养基稀释、混匀，细胞悬液沿管壁缓慢加入含Ficoll—Hypaque人淋巴细胞分离液上层，其相对密度为1．077g/L，进行梯度离心(2000r/min×20min)，然后缓慢吸取中间交界面细胞悬液至另一离心管，获得含hMSCs的单个核细胞悬液，用15ml DMEM/F12培养基洗涤1次(1500 r/min×5min)。

加入DMEM/F12完全培养基，吹打计数。

48h首次换液，以后每2～3d换液。

换液用DMEM/F12完全培养基。

1.4细胞的培养、纯化及扩增孵箱内培养条件：37℃、5%CO2的空气、饱和湿度；待细胞长至瓶底90%面积时，进行消化传代。

依据可贴壁筛选进行纯化，吸出培养液，D-Hank液洗涤2次，加入3ml 0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA，消化3～5min，加入3ml含血清培养液，离心后去上清液，加入DMEM/F12完全培养基吹打计数；调整细胞浓度，以1×104/cm2的密度接种于75cm2培养瓶，48h后全量换液，以后每3d换液。

换液用DMEM/F12完全培养基；待细胞长满至瓶底面积时，重复进行细胞消化、接种的传代培养。

1.5 脐血MSCs的诱导分化与鉴定成脂分化：将第4代细胞以5×104/ml浓度接种于预置有盖玻片的6孔板中；细胞贴壁后用1μmol/L胰岛素，0.5mmol/LIMBX，100mmol/L吲哚美辛，10mg/L地塞米松诱导3天，置于37℃，5%CO2，饱和湿度孵箱内孵育；吸取培养基，然后改用含10mg/L胰岛素的维持培养基继续培养15天，每周换液2次；吸去培养基，4%多聚甲醛固定，用油红O染色观察脂肪滴的形成；每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化至脂滴出现。

成肌分化：将细胞以5×104/ml浓度接种于预置有盖玻片的6孔板中；细胞贴壁后，置37℃，5%CO2，饱和湿度孵箱内孵育，以5-氮杂胞苷3μmol/L 诱导，24小时后换成常规完全培养基，以后每3天换一次液；约2周后，用4%多聚甲醛固定，用ABC免疫组化试剂盒检测骨骼肌肌球蛋白(myosin)的表达；每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化。