pcr说明及注意事项

然后用一个含有部分接头序列的通用引物 UPM(universal primer,UPM)作为上游引物，用 一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物，以第一链cDNA为 模板，进行PCR循环，
3‘Race
1，(dt)17接头引物引导cDNA第一链 合成 2，特异性引物引导合成cDNA第二链 3，特异性引物和与接头引物互补的 引物做PCR 4，克隆至质粒载体做序列分析
要将两段100多个碱基的片段连起来 用PCR可以吗？？没有酶切位点！各位 高手可否介绍一下经验？？连接PCR要 注意些什么？？多谢！！！ (丁香园某求助帖）
可以。我就这样做过。 1. 针对这两个片段设计两对引物。第一对引 物的下游引物和第二对引物的上游引物各长 40bp左右，并有20bp左右的同源性配对序 列（象骨折打的石板）。 2. 分别PCR这两段序列，并分别回收纯化这 两个PCR片段。 3. 将上述两个PCR片段加入一PCR体系中， 只不加引物，其他同普通的PCR，做PCR。 4. 回收200多bp的PCR目的片段。放入测序 载体，测序证实。 (丁香园某回答贴）
DNA聚合酶的选择
本实验室经常使用宝生物的Taq酶
rTaq： 普通Taq酶，1kb以下片断使用比较 合适
EX－Taq 具有一定的保真性，2kb以下片断使 用比较合适 LA－Taq 保真性比EX－Taq要好，适用于2kb 以上的片断
关于高保真DNA聚合酶（pfu）
1，具有3‘－5’核酸外切酶活性，所以具 有保真性 2，PCR产物末端没有T 3, 扩增效率往往不如普通Taq酶，可以 用普通Taq酶和pfu按20：1混合使用
(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探 针(4) 生成大量DNA以进行序列测定； (5) 突变的分析；
我们可以利用PCR做些什么工作 克隆基因，构建质粒 扩增核酸，用于检验 质粒点突变 连接(overlap PCR)
不出现扩增条带
不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有 ①模板核酸的制备， ②引物的质量与特异性， ③酶的质量， ④PCR循环条件。 寻找原因亦应针对上述环节进行分析 研究。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或 小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非 特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全 互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、 退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的 质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来 源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩 增。
模板： ①模板中含有杂蛋白质， ②模板中含有Taq酶抑制剂， ③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组 蛋白， ④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。 ⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出 现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提 取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理 液，其程序亦应固定不宜随意更改。
PCR技术的基本原理
1, 变性：一般93～95度
pcr.swf.swf
2, 退火：一般55度左右，根据具体 的情况决定
3，延伸：一般72度,PCR产物每kb一 分钟
常用的PCR技术
普通PCR RT-PCR Race PCR 巢式PCR Real-time PCR
通常，PCR在分子克隆和DNA分析 中有着以下多种用途：
PCR技术浅淡
微生物教研室：曹康
PCR技术产生的背景：
DNA双螺旋结构于1953年发现，自此确立了它就是细 胞里携带遗传信息的分子。 第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶polymerase， 即PCR之P），也早在1956年分离成功。 几十年来，在试管内复制DNA已是许多实验室的例行 工作。
PCR的发明人，一 般公认是穆里斯（K. Mullis），他于1983 年发明了PCR技术， 这是分子生物学上 的一次革命，他也 因此获得了1993年 的诺贝尔化学奖。
5. 尽量避免引物二聚体特别是3‘端引物二聚 体
6，尽量避免错配，特别是3‘端错配
7，尽量避免3‘端最后一个碱基是A。 8，上下游Tm值相差最好不要超过5°C
9， Tm值的计算： Tm＝4×（G＋C） ＋2×（A＋T）(本公式适用于20个碱 基以下，20个碱基以上推荐使用软件计 算） 10,根据需要可在引物5‘端加入酶切位 点和保护碱基
关于PCR引物设计的思考 1，任何引物设计软件都不能代替人性
化的思考。2,核酸结构是三维的，而一般的 引物设计软件很难考虑到核酸的三维结构。 3，理论与实践并不一定完全一致
关于PCR试验结果的思考
影响PCR的主要因素
怎样理解 PCR技术？ 1，模板 模板在PCR反应中起至关重要的作用， 常见的模板性质： A 质粒DNA B 基因组DNA C RNA(RT-PCR)
hot start PCR
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR 特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合 酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然 有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中， 以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度 时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物 一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计 的位点因为遗传元件的定位而受限时，热启动 PCR尤为有效。
overlap PC物之前应当明确PCR试验的目 的以及各种资料和信息 1. 引物长度一般为18-35bp,以保证特异性.当 然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特 异性
2，上下游引物长度相差一般不超过3个碱基
3. 引物GC含量尽量是40％－60％
4. 尽量避免发卡结构，特别是3‘端发卡结构
2，引物 引物的特异性很重要 3，引物浓度 0.1~1pmol/ul 引物浓度太低PCR产量低， 引物浓度太高容易引发非特异性扩增。
Mg离子浓度
Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸 骨架相互作用 并能影响Polymerase的活 性，一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM 之间调整，同样要记住的是在调整了 dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的 浓度。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓 度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～ 2.0mmol/L为宜
11,引物设计的最后一项：Genebank网 比对/Blast
使用软件帮助设计引物
目前常用的引物设计软件有Primer Primier 5.0和Oligo以及其他各种软件和一些 网上在线设计，其中以Primer Primer 5.0功 能最全最为常用。 Primer Primer 5.0的主要功能有：分析 限制性内切酶位点，自动搜索，手动设计 等功能。
Real-time PCR
real-time PCR flash.swf
PCR究竟能扩多长的片段？
RNA模板： 使用一般的试剂，RT-PCR一般只 能扩到2kb左右 质粒模板：5kb一般不成问题 基因组DNA模板：使用特殊的酶和缓冲液原理 上讲可以扩出10～25kb (长距离PCR）
RT-PCR
一步法和二步法
各有优缺点。比较如下： 二步法: 可使用oligo(dT)，随机六聚体引物或基因特异 性引物进行第一链合成。高灵活性：可选用不 同的酶系统。可优化困难的RT-PCR反应。可实 现长模板mRNA的转录扩赠(使用ELONG ASE Enzyme Mix) 。 最适用于克隆产物(使用高确限 度酶或混合酶) 。
一步法: 第一链合成时只能使用基因特异性引物。 高 灵敏度：使用预混合的SUPETSCRIPT H和 Taq聚合酶，可检测到低至0．1pg的mRNA。 高便利性：所使用的酶已经预混合。移液步 骤少，减少污染机会。最适于大量样品的分 析。
PCR反应条件的摸索
总的原则：
1，做任何实验要有对照 2，做任何实验要变通，走多条路，不要 在一棵树上吊死。
5‘ Race技术
利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为 一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作 为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反 转录合成标准第一链cDNA。 利用该反转录酶具有的末端转移酶活性， 在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上 3一5个(dC)残基
含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头 引物与cDNA第一链配对后，转换为以SMART 序列为模板继续延伸而连上通用接头。
对策有： ①必要时，重新设计引物。 ②减低酶的量或调换另一来源的酶。 ③降低引物量，适当增加模板量，减少循 环次数。 ④适当提高退火温度或采用二温度点法 (93℃变性，65℃左右退火与延伸，也叫两步 法)。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原 因往往由于酶的量过大或酶的质量差，dNTP浓度过高， Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。 其对策有： ①减少酶的量，或调换另一来源的酶。 ②减少dNTP的浓度。 ③适当降低Mg2+浓 度。 ④增加模板量，减少循环次数。
Mg离子浓度升高则PCR特异性增加， Mg 离子降低则有可能出现非特异性扩增
退火温度
升高退火温度PCR产量低，降低退火温度 则有可能出现非特异性扩增
关于酶切位点与保护碱基
保护碱基的个数：(NEB) BamHⅠ 1 EcoR Ⅰ 1 Hind Ⅲ 2 Xho Ⅰ 1 PstⅠ 3 Xba Ⅰ 1 保护碱基的性质：灵活处理