PCR原理及注意事项
PCR原理与操作
PCR原理与操作PCR（Polymerase Chain Reaction），也称为聚合酶链反应，是一种重要的分子生物学技术。
它是通过体外复制DNA分子来产生大量DNA分子的方法。
PCR技术在基因工程、医学诊断、犯罪现场调查等领域有广泛应用。
PCR技术依赖于DNA分子的核酸扩增过程。
其基本原理可分为三个步骤：变性、引物的结合和延伸。
1.变性：PCR反应开始时，DNA样本被加热至95℃到98℃的高温。
这个高温的作用是将DNA的两个螺旋链分离，使之成为单链DNA。
2.引物的结合：PCR反应中，引物是一段由合成的DNA片段。
引物的序列与待扩增的DNA序列的两端互补。
引物的加入使得单链DNA在较低的温度下重新连成双链结构。
引物被限制性核酸酶进行体外合成。
这个链合成过程是在一个低于变性温度的温度下进行的。
3.延伸：在第二步引物的结合后，加入了一定浓度的DNA聚合酶。
DNA聚合酶能够扩增引物，使得新的DNA链得以合成。
而且PCR反应中还加入了一定浓度的dNTPs（核苷酸三磷酸聚合物），它们是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液。
通过这些反应物，DNA聚合酶能够与引物进行大量的扩增。
PCR操作步骤及注意事项：1.样品准备：a.提取待扩增的DNA，保证DNA纯度和浓度。
b.使用无细菌污染的试剂和消毒的实验室设备。
2.PCR体系准备：a.准备PCR反应液，包括模板DNA、引物、酶、缓冲液、dNTP和盐。
b.根据所需扩增的目标序列和引物设计合适的引物。
c.确保PCR反应液没有污染，防止产生假阳性或假阴性结果。
3.PCR反应设置：a.取合适的PCR管，加入PCR反应液。
b.打开PCR仪，将PCR管放入合适的位置，设置温度和时间参数。
c.检查PCR仪的热盖是否正常工作，以确保反应条件的稳定性。
4.PCR反应：a.将PCR管放入预热PCR仪中，并启动程序。
b.进行PCR循环扩增反应，根据需要进行不同数目的循环。
PCR原理及注意事项
PCR一、PCR的原理PCR;Polymerase Chain Reaction;聚合酶链式反应;由Kary Mullis博士在1985年于美国的PE-Cetus公司工作期间发明..该技术基本原理如下：在模板DNA、primers和4种dNTPs存在下;依赖于DNA polymerase的酶促合成反应..DNA polymerase以单链DNA为模板;借助一小段双链DNA来启动合成;通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合;形成部分双链..在适宜的温度和环境下;DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端退火;并以此为起始点;沿模板5´→3´方向延伸;合成一条新的DNA互补链的过程并依次循环..1.PCR反应的基本成分包括：Templates DNA待扩增DNA、Primers、4种脱氧核苷酸dNTPs、DNA聚合酶和适宜的Buffer对于高GC含量的模板有时加入3% DMSO..类似于DNA的天然复制过程;其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物..2.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后;使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离;成为单链;以便它与引物结合;为下轮反应做准备；②.模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后;温度降至55℃或60℃左右;引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶或Phusion DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶的作用下;以dNTPs为原料;靶序列为模板;按碱基互补配对半保留复制原理;合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;新链又可成为下次循环的模板..3.PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行;使DNA扩增量呈指数上升..反应最终的DNA 扩增量可用Y＝1＋X n计算..Y代表DNA片段扩增后的拷贝数;X表示实际扩增效率;平均约为75%;n 代表循环次数..平均扩增效率的理论值为100%;但在实际反应中平均效率达不到理论值..如果进行30个Cycles;实际扩增倍数往往为106-107理论上以Y=2n计算;为109..反应初期;靶序列DNA片段的增加呈指数形式;随着PCR产物的逐渐积累;被扩增的DNA 片段不再呈指数增加;而进入线性增长期或静止期;即出现“停滞效应”;这种效应称平台期..PCR 扩增效率及DNA聚合酶、PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素与之都有关..大多数情况下;平台期的产生不可避免..二、PCR的种类1.常规PCR2.反转录PCRreverse transcription;RT- PCR先在逆转录酶的作用下;以mRNA为模板;Primer 1常用OligodT引物为引物合成与其互补的cDNAcomplementary DNA;再以cDNA为模板;Primer 2为引物进行PCR反应..常用逆转录酶有AMVavian myeloblastosis virus;酶活最适温度42℃和MMLVmoloney murine leukemia virus; 酶活最适温度37℃..RT-PCR是一种快速简便敏感度极高的检测mRNA转录量或蛋白表达水平的方法..半定量RT-PCR以组织中普遍表达且表达量恒定的管家基因的mRNA表达为对照;将目的基因mRNA 与之一起逆转录成各自cDNA;最后计算它们的比值来达到对mRNA表达半定量的目的..3.实时荧光定量PCRQuantitative Real-time PCR;Q-RT-PCR在PCR反应体系中加入荧光基团SYBP Green 1或Taqman或分子信标等;利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程;最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法..利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化;通过Ct值C 代表Cycle;T代表threshold和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析..Ct值：扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数..荧光阈值是前3-15个循环荧光信号的标准偏差的10倍..用途：绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数;通常用到标准曲线；相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间或不同基因之间的基因表达差异；基因型/等位基因分析;例如SNP检测；转基因生物监测等4.重组PCR又称重叠PCR;overlap PCR：制备杂合基因5.多重PCR又称复合PCR;multiplex PCR两对或两对以上引物在一个反应体系中扩增多条目的基因片段6.不对称PCR：使用浓度相差100倍的正反引物;得到单链DNA7.反向PCR：扩增引物相反方向DNA 序列目的基因之外的序列;从而研究未知序列8.巢式PCRNest PCR：高特异性扩增;一对引物扩全长;一对引物扩内部部分序列此外;还有Touchdown PCR、锚定PCRA-PCR、Allele- specific PCRAS-PCR、单链构型多态性PCRSSCP-PCR和低严格单链特异性引物PCRLSSP- PCR等..。
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。
1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。
随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。
通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。
2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。
探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。
SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。
3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。
反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。
4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。
例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。
在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。
例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。
总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
PCR Protocol
聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，通过特定的引物和DNA聚合酶，将特定的DNA片段在体外进行快速、特异的扩增。
以下是PCR的原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、PCR的原理PCR技术的基本原理是通过对DNA的双链进行特异性解旋，然后在DNA聚合酶的作用下，以解开的每一条单链为模板，将特定的引物与单链的5’端和3’端结合，形成起始复合物。
在适宜的温度和条件下，DNA聚合酶将从引物3’端开始延伸DNA链，并通过反复变性-延伸循环，实现DNA片段指数级扩增。
二、所需试剂和耗材1.引物：用于与模板DNA结合，指示DNA聚合酶从何位置开始延伸。
引物可以是人工合成的寡核苷酸，也可以是从RNA或天然DNA中提取的。
2.DNA模板：被扩增的DNA片段的原始双链分子。
3.DNA聚合酶：催化DNA复制的酶，如Taq DNA聚合酶。
4.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
5.缓冲液：调节反应液的pH值，一般含有Mg2+离子以及其他辅助因子。
6.耐高温的DNA分离酶抑制剂：防止在高温下DNA被破坏。
7.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
三、实验仪器1.基因扩增仪（PCR仪）：用于完成PCR的变性-延伸循环。
2.微量移液器：用于精确添加PCR反应液。
3.离心管：用于混合和离心PCR反应液。
4.水浴锅：用于PCR反应液保温。
5.电泳仪和电泳槽：用于分析扩增的DNA片段。
6.显微镜：观察细胞和组织样品。
7.分光光度计：用于测量DNA和RNA的浓度。
四、准备工作1.了解PCR的基本原理和步骤。
2.设计和制备引物：根据目的基因序列设计特异性引物。
3.准备基因组DNA或cDNA：从细胞或组织中提取基因组DNA或通过反转录制备cDNA。
4.缓冲液和其他试剂的准备：根据PCR试剂清单准备所有必需的试剂。
聚合酶链式反应(PCR)基本原理
四、PCR实验中应注意的事项
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采取以下措施有助于防止污染和结果的假阳性： 1、隔离不同操作区； 2、分装试剂； 3、严格实验操作； 4、严格按无菌操作的原则进行PCR所有操作等。
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聚合酶链反应（PCR）
• • • • 一、PCR的概念； 二、PCR的基本原理； 三、PCR反应条件的优化； 四、PCR操作的注意事项。
• 一、概念：
• 聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）扩增技术，即体外试管内DNA的扩增， 以高特异性、高灵敏度、高效率及忠实性等特 点，在生命科学研究领域产生着巨大的影响。
• 引物设计遵循下列原则：
• ①引物长度一般为15～30个核苷酸。
• ②引物中碱基的分布尽可能随机，尽量避免多 聚嘌呤或多聚嘧啶。
• ③引物内避免存在互补序列，以免折叠形成发 夹结构。
• ④两引物间不应存在互补序列，尤其是避免3′ 端的互补重叠。 • ⑤引物与非特异扩增序列的同源性<70%。 • ⑥引物的3′端碱基一定要与模板互补配对；而 5′则可相对不严，甚至还可做一些修饰。
1、变性 • 通过加热至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键 断裂，形成单链DNA，作为反应的模板。
• 2、退火 • 将温度降至引物的 Tm 值左右或以下（比 Tm 低 5℃，通常为 55 ～ 65℃），引物与 DNA 模 板互补结合，形成杂交链。
• 3、延伸 • 在DNA聚合酶（一种耐热的DNA聚合酶）的 作用下，于70～74℃以引物3′端为起始 点按5′→3′方向使DNA新链延伸。
• 上述三步为一个循环，每一循环的产物作 为下一个循环的模板，如此经过 25 － 30 个 循环，可使新生的DNA片段得以扩增。
组织脱氧核酸聚合酶链反应检测
组织脱氧核酸聚合酶链反应检测在当前医疗领域，组织脱氧核酸聚合酶链反应检测（PCR）作为一种重要的诊断手段，广泛应用于各种疾病的诊断和研究中。
本文将为您介绍组织脱氧核酸聚合酶链反应检测的相关知识，包括其原理、应用领域以及注意事项。
一、组织脱氧核酸聚合酶链反应检测（PCR）原理组织脱氧核酸聚合酶链反应检测是一种在体外将特定DNA序列扩增的技术。
其基本原理如下：1.脱链：将双链DNA加热至高温（通常94-96摄氏度）使其分解成单链DNA。
2.导向：冷却至适当温度（通常50-65摄氏度），使寡核苷酸引物与单链DNA互补配对，形成RNA-DNA杂交双链。
3.延伸：加热至适当温度（通常72摄氏度），DNA聚合酶在引物处开始催化合成互补的DNA链，完成新的DNA双链的复制。
4.重复：重复以上三个步骤，直至达到所需扩增倍数。
二、组织脱氧核酸聚合酶链反应检测（PCR）的应用领域组织脱氧核酸聚合酶链反应检测技术在医学、生物学等领域具有广泛应用，主要包括：1.病原体检测：如新冠病毒、结核分枝杆菌等。
2.基因突变检测：如肿瘤基因、遗传病基因等。
3.基因表达分析：如实时荧光定量PCR（qPCR）。
4.分子生物学研究：如基因克隆、基因编辑等。
三、组织脱氧核酸聚合酶链反应检测（PCR）注意事项1.实验操作过程中应严格遵循无菌操作，避免外部污染。
2.引物的设计和筛选至关重要，合适的引物可以提高检测灵敏度和特异性。
3.操作过程中应严格控制温度和时间，确保扩增效果。
4.注意PCR产物的后处理，避免扩增产物的污染。
5.多次重复实验以验证结果，减少实验误差。
总之，组织脱氧核酸聚合酶链反应检测技术在疾病诊断、研究等领域具有重要价值。
正确掌握其原理、应用和注意事项，将有助于更好地利用这一技术为医学发展和人类健康服务。
简述PCR的基本原理和步骤及步骤要点
简述PCR的基本原理和步骤及步骤要点PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，它能够快速而准确地扩增DNA片段。
本文将对PCR的基本原理、步骤以及步骤要点进行简述。
基本原理PCR基于DNA的复制原理，通过不断重复三个基本步骤（变性、退火和延伸）来扩增特定DNA片段。
具体而言，PCR需要以下三种主要成分：DNA模板、引物和聚合酶。
1.DNA模板：PCR需要从中复制目标DNA片段的DNA模板。
该DNA可以是从细胞中提取的总DNA、cDNA或已知序列的DNA片段。
2.引物：引物是两个短的DNA片段，其中一个与目标DNA片段的起始位置互补，另一个与目标DNA片段的末端互补。
引物的作用是提供了PCR反应的起始点。
3.聚合酶：聚合酶是PCR反应中的关键组分，它能够在退火温度下从引物的起始点开始，沿着DNA模板链合成新的DNA链。
PCR的基本原理是通过不断重复以下三个步骤来扩增目标DNA片段。
步骤及步骤要点1.变性：在PCR反应的第一步，反应混合液中的DNA模板被加热到高温（通常为94-98℃），使DNA双链解开成两条单链（变性）。
•高温变性有助于断开DNA双链的氢键，使之成为两条单链。
2.退火：在PCR反应的第二步，反应混合液被冷却到较低的温度（通常为50-65℃），使引物与目标DNA片段互补结合。
•引物与目标DNA片段的互补配对使得引物能够定位在目标DNA片段的特定位置。
3.延伸：在PCR反应的第三步，反应混合液被加热到适合聚合酶活性的温度（通常为72℃），使聚合酶从引物的起始点开始合成新的DNA链。
聚合酶能够识别引物，在引物的3’端添加互补的核苷酸，从而合成新的DNA 链。
这三个步骤组成了一次循环，形成一个PCR循环。
每个PCR循环都会使目标DNA 片段的数量成倍增加。
通常，进行20-35个PCR循环，即可扩增到足够的DNA量以进行后续分析。
需要注意的是，PCR反应需要针对具体的目标DNA片段选择合适的引物，在设定的PCR温度条件下进行。
pcr纯化试剂盒的基本原理
pcr纯化试剂盒的基本原理PCR（聚合酶链式反应）的研究和应用越来越广泛，而纯化PCR产物是进行后续实验和分析的必要步骤。
PCR纯化试剂盒是一种常用的纯化PCR产物的工具。
那么，它的基本原理是什么呢？本文将从试剂盒组成及原理、试剂盒使用注意事项等方面展开介绍。
一、试剂盒组成及原理PCR纯化试剂盒一般包括PCR产品纯化试剂（Buffer），醚类萃取试剂，吸附柱和洗脱缓冲液。
它的原理基于DNA特异性的吸附和洗脱过程，以下是具体步骤：1. 首先将PCR反应混合物加入醚类萃取试剂中，并充分混合离心，离心过程中，胶体、蛋白质和其他杂质会被醚类萃取试剂带走，而PCR产物则会与细胞外膜纤维蛋白（PEI）相结合，形成PEI-DNA复合物。
2. PEI-DNA复合物被加入吸附柱内，其中吸附柱内有一定比例的硅胶，这可以保证PEI-DNA复合物牢固地吸附在硅胶上。
3. 加入洗脱缓冲液后，硅胶上的PEI-DNA复合物便会被洗脱，从而获得高纯度的PCR产物。
二、试剂盒使用注意事项1. 在试剂盒操作时需要注意使用手套等个人防护设备，严格遵守规定的步骤和试剂使用比例。
2. 在制备PCR反应混合物时，需要遵循浓度和质量的要求，以避免在后续操作中对产物的影响。
3. 充分离心试剂混合物可以更好地去除杂质，提高产物的纯度。
4. 注意试剂盒保存条件，尤其是醚类萃取试剂，应在阴凉处保存，以免受热或阳光照射导致失去活性。
5. 吸附柱在使用前需要事先激活，以提高其吸附效率。
三、总结综上所述，PCR纯化试剂盒基于DNA特异性的吸附和洗脱过程，具有操作简单、产物纯度高等优点，是进行PCR产物纯化的主要工具之一。
在使用时需要注意操作规范和使用说明，以确保产物的纯度和实验数据的准确性。
PCR技术
一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。 近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
PCR技术：1985年由美国 Cetus 公司的Kary Mullis 首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万 倍以上。
降低反应体系的温度使寡核苷酸引物与DNA模板 互补区域按碱基配对原则结合，形成杂交链。55 ℃
也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高 浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引 物之间。
3. 延伸 (Extension):
升高反应体系温度至72 ℃ ，以4种dNTP为原
料，在DNA聚合酶作用下，从引物的3′-OH 端延伸，
√ √ √
√ √ √ √
2.操作人员必须进行上岗培训：
卫生部临床检验中心或由省级卫生行政部门 指定并经卫生部临床检验中心认定的机构 3.分装试剂： 在超净工作台内分装，然后低温保存 4.实验操作注意事项： 做好个人防护 避免反应液飞溅
4.实验操作注意事项：
应有完整、有效的去污措施
实验前：实验耗材（反应管、加样器吸头） 必须经高压消毒 实验后：反应管、加样器吸头用10%次氯酸 钠溶液消毒处理；实验台面和其他表面用 10%次氯酸钠溶液或紫外线近距离照射
以变性后的单链DNA为模板，合成出5′→ 3′的互补
链。
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中 的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一 轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
PCR 的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
PCR技术
随机引物PCR技术一．实验原理聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ）简称PCR ，它是一种DNA 体外扩增技术。
1985 年美国的Mullis 等人发明了PCR 技术，在体外利用模板DNA 、特定的寡聚核苷酸引物和DNA 聚合酶，通过DNA 变性、复性和延伸过程合成一条互补的DNA 链。
反复重复这一过程，模板DNA 就可得到大量扩增。
在PCR 过程中，DNA 的延伸起初是用大肠杆菌的DNA 聚合酶I （Klenow 片段）来完成的。
由于大肠杆菌的聚合酶不耐热，每次加热变性DNA 后都要补加新的聚合酶。
这不仅增加了实验成本，而且当同时扩增多个样品时极易出错。
在耐热DNA 聚合酶（Taq 酶）发现后，才使PCR 技术的广泛应用成为可能。
特别是自动热循环仪（又叫DNA 扩增仪）的发明，使PCR 反应过程可以电脑控制，实现了自动化。
PCR 技术的发明虽然只有10 多年的时间，但目前这一技术及其衍生的其他实验技术在生物学的许多领域已得到了广泛的应用。
随机引物PCR （Arbitrary - primer PCR ，缩写为AP-PCR ）又称随机扩增多态性DNA （Random amplified polimophic DNA ，缩写为RAPD ），是Williams 和Welsh 等1990 年在PCR 的基础上发展起来的一种实验技术。
在RAPD 扩增中，仅用一个8-10 碱基的寡核苷酸引物，引物的序列是随机的。
RAPD 反应的条件与普通PCR 基本相同。
但由于引物较短，一般退火所需温度较低。
RAPD 与普通PCR 的另一个明显的不同是前者不需知道模板DNA 的序列，扩增出来的片段也是非特异性的；而后者则必须知道待扩增目的片段的序列，根据这一序列设计一对相应的引物。
RAPD 技术一出现，便以它的简便、快捷和多态性捡出率高而引起科学工作者的极大兴趣。
目前这一技术已被广泛用于遗传图谱构建、群体遗传结构分析、DNA 指纹分析和基因定位等不同研究领域。
PCR技术基本原理及相关知识
PCR技术基本原理及相关知识PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学和遗传学研究中常用的基因扩增技术，其基本原理是利用体外体内的DNA聚合酶（通常是热稳定聚合酶）在DNA模板上进行逐渐增加的连续DNA合成过程。
1. 变性（Denaturation）：将DNA双链融解成两条单链。
通常使用高温（约94-98℃）使DNA的双链结构分离，使得DNA模板变为两个单链，以便后续的反应。
2. 退火（Annealing）：在较低的温度下，引物（primers）与DNA模板结合。
引物是一段长度为15-30个核苷酸的短DNA或RNA分子，能与目标DNA序列的两端互补碱基对结合。
这些引物在PCR反应中起到限制DNA合成的作用。
3. 扩增（Extension）：在适温下，DNA聚合酶利用引物开始在目标DNA序列作为模板上进行DNA合成，不断扩增目标序列。
常用的DNA聚合酶是热稳定的聚合酶，常见的是来自热液单纯病毒Taq聚合酶。
PCR反应通常进行30-40个循环，每个循环包括上述三个步骤。
每个循环的时间和温度取决于目标DNA序列和反应条件。
除了基本的PCR技术原理，以下是一些相关知识：1. 反向转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）：可以在RNA模板上合成相应的DNA序列，通过引物合成cDNA，然后进行PCR。
RT-PCR常用于分析转录水平、检测RNA病毒和研究基因表达调控。
3. 嵌段PCR（Nested PCR）：在传统的PCR反应后，再次进行PCR，使用内部引物扩增上一次PCR反应获得的产物。
嵌段PCR提高了灵敏度和特异性。
4. 随机引物PCR（Random Primed PCR）：使用随机引物作为引物，能扩增DNA模板上的所有可能的序列，常用于建立基因文库和DNA指纹。
PCR技术在许多领域应用广泛，如医学诊断、遗传学研究、基因工程等。
其快速、高效、灵敏和特异性的特点使其成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
pcr实验原理及注意事项
pcr实验原理及注意事项PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：将PCR反应的试管与反应板紧贴。
当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在的PCR管中不能均匀传热。
不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。
对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。
没有扩增产物：在提供MgCl2缓冲液中，以L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。
泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR 反应中可能缺少游离的Mg2+。
检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。
检查模板和引物的用量。
增加循环次数和/或模板DNA的用量。
泳道中出现模糊条带：减少循环次数或模板DNA的用量。
提高退火温度，但不要超过68℃。
重新设计引物或设计更长的引物。
其他值得注意的条件：建议使用薄壁管。
厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。
最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。
大多数反应中，（~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。
建议使用L MgCl2∶350mmol/L dNTP或L MgCl2∶500mmol/L dNTP组合的混合物。
然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。
基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。
因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。
DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。
要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。
请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。
降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。
进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是指在聚合酶链反应（PCR）中使用的引物的设计过程。
PCR引物起到了在PCR扩增过程中特异性识别和引导DNA复制反应的作用。
因此，PCR引物的设计直接影响PCR反应的成功与否。
以下是PCR引物设计的原理及原则。
一、PCR引物设计的原理1.引物长度：引物的长度通常为18-25个碱基对。
引物过短可能导致非特异性引物结合，引物过长可能导致反应条件不佳。
较长引物（20-25个碱基对）通常用于扩增目标DNA较长的片段，而较短引物（18-20个碱基对）通常用于扩增较短的目标DNA片段。
2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与模板DNA的特异性结合。
引物序列应尽量避免重复序列或序列中的碱基。
此外，引物序列的催化部位（3'端）应该具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。
3.引物的Tm值：引物的Tm值是指反应温度下引物和目标DNA序列的熔解温度。
引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以保证引物与目标DNA序列结合的特异性和稳定性。
4.引物的GC含量：引物的GC含量对PCR反应的效率和特异性有重要影响。
引物的GC含量应控制在40-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物结合能力不佳。
二、PCR引物设计的原则1.引物特异性：引物应与目标DNA序列的特异区域互补，以确保特异性扩增。
在设计引物时，应避免引物与非目标序列互补或有任何交叉杂交现象。
2.引物长度：引物长度通常为18-25个碱基对，过短或过长的引物可能导致PCR反应效果不佳。
3.引物序列中避免重复序列：引物序列中避免过多的重复序列，以免引发非特异性引物结合。
4.引物催化部位特异性：引物的催化部位（3'端）应具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。
5.引物的Tm值匹配：引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以确保引物在反应温度下与模板DNA序列结合的稳定性。
PCR基本原理及注意事项
靶序列或扩增产 物的交叉污染
选择的扩增序列 与非目的扩增序
列有同源性
靶序列太 短或引物
太短
整个基因组或 大片段的交叉
污染
空气中的 小片段核 酸污染
巢式 PCR
高压消 毒
耗材一 次性使
用
污染解决 方法
操作时应 小心轻柔
紫外照射
引物与靶序列不完 全互补、 或引
物聚合形成二聚体
Mg2+离子浓度过高 退火温度过低
G C含量以40-60%为宜 ATGC随机分布
避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补
引物 设计
引物3’端的碱基严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基
有或能加上合适的酶切位点 与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性
酶及其浓度
栖热水生杆菌 天然酶
大肠菌合成基 因工程酶
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)
反应体系
10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶
Mg2 加双或三蒸水至
10ul 200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L 100ul
PCR反应
引物
Mg2
酶
五要素
模板
dNTP
扩增跨度 以200-500bp为宜
15-30bp
dNTP呈颗粒 状，-20°C 保存
小量分装 -20℃冰冻 保存
反应中，dNTP 应为50～200umol/L
1M NaOH或 1M Tris.HCL 将PH调节 到7.0～7.5
dNTP质量 与浓度
DNA 纯化
模板 核酸
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增的原理和操作步骤PCR 扩增，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，它能够在体外快速大量地扩增特定的 DNA 片段。
这一技术的出现，极大地推动了生物学、医学、遗传学等多个领域的发展。
PCR 扩增的原理其实并不复杂，我们可以把它想象成一个复制工厂。
在这个工厂里，有我们想要复制的“原材料”——DNA 模板，还有负责复制的“工人”——DNA 聚合酶，以及指导复制的“图纸”——引物。
首先，DNA 是由两条互补的链组成的双螺旋结构。
在 PCR 反应开始时，第一步是“变性”。
这就像是把双螺旋结构的 DNA 拉开，变成两条单独的链。
这个过程通过加热来实现，通常加热到 90 95 摄氏度，使得 DNA 双链之间的氢键断裂，两条链分开。
接下来是“退火”步骤。
当温度降低到 50 65 摄氏度时，加入的引物会与单链 DNA 上的特定区域结合。
引物就像是一把钥匙，只能打开特定的锁，也就是与特定的 DNA 序列互补配对。
然后是“延伸”阶段。
温度升高到 70 75 摄氏度，DNA 聚合酶开始发挥作用。
它会从引物结合的位置开始，按照碱基互补配对的原则，将游离的脱氧核苷酸逐个添加到新合成的 DNA 链上，不断延伸这条链。
经过一轮这样的变性、退火和延伸，DNA 模板被复制了一次。
但这还不够，通常 PCR 反应会进行 20 40 个循环，每经过一个循环，DNA 片段的数量就会翻倍。
经过多次循环，就可以得到大量的特定DNA 片段。
了解了 PCR 扩增的原理，接下来我们看看具体的操作步骤。
第一步，准备反应体系。
这包括 DNA 模板、引物、四种脱氧核苷酸（dNTPs）、DNA 聚合酶、缓冲液以及适量的镁离子等。
DNA 模板可以是从细胞、组织或者其他生物样本中提取的基因组DNA，也可以是经过反转录得到的 cDNA。
引物是根据我们想要扩增的目标 DNA 序列设计的短链 DNA，一般长度在 18 25 个碱基左右。
pcr技术的原理和操作的注意事项包括
pcr技术的原理和操作的注意事项包括一、PCR技术的原理PCR技术，全称为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在分子生物学领域广泛应用的技术方法。
其原理是通过DNA的体外扩增，将目标DNA序列放大成大量可检测的数量。
PCR技术主要基于DNA的复制原理，采用DNA聚合酶在特定条件下的循环反应。
具体而言，PCR由三个关键步骤组成：变性、引物结合和延伸。
首先，在高温下进行变性，将待扩增的DNA双链解开成单链，得到两条DNA链。
然后，下调温度至引物结合温度，引物与目标DNA的两端互补结合。
这两个引物将DNA序列固定住，从而起到引导复制的作用。
最后，在适宜的温度下，DNA聚合酶开始复制目标DNA片段。
此过程是循环进行的，每个循环会使DNA数量成倍增加，从而实现特定DNA片段的扩增。
二、PCR技术的操作注意事项在进行PCR技术操作时，需要注意以下几个方面：1. 实验前准备在进行PCR实验前，应根据实验需要准备好所需试剂和设备，确保实验过程的顺利进行。
这包括核酸提取试剂、引物、模板DNA及PCR反应管等。
2. 周期条件设定PCR技术中，周期温度设定是非常重要的。
需根据所扩增的目标DNA序列的长度和GC含量等因素来设定最佳的循环条件。
通常情况下，标准的PCR循环包括变性、引物结合和延伸三个步骤，每个步骤所需的时间和温度应细致调节。
3. 引物设计引物的设计是PCR技术成功的关键之一。
好的引物设计可以提高PCR技术的灵敏性和特异性。
设计引物时，通常选择20-25个碱基长的寡核苷酸，确保其互补结合到目标DNA序列的两端。
同时还需考虑引物之间的互补配对和配对温度。
4. 模板DNA的处理模板DNA是进行PCR的重要材料之一。
在使用模板DNA时，需要严格避免交叉污染。
同时，需合理保存模板DNA，避免其降解或污染。
5. 反应管的选择选择合适的PCR反应管对PCR试验结果也有一定的影响。
PCR的原理、操作步
PCR循环 第二步 － 退火 （３７～６５℃）
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
PCR循环 第三步 － 延伸 （７０～７５℃）
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留
标本的运送
• 标本采集后，密闭、标（贴）姓名，应尽 可能快的送至检测实验室，如运送时间需2 小时以上，必须用冰盒送至实验室。
• 标本中如加入了适当的稳定剂，如用于 RNA测定加入4mol/L异硫氰酸胍盐（GITC） 的血清（浆）标本和用于DNA测定的EDTA 抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄。
2.标本的验收
丙型肝炎病毒（RNA血清）
• a）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将化验单和试管依次编号后， 弃去手套。
• b）双手换上新手套，用镊子(夹取灭菌物品专用)取出0.5ml灭菌离心 管，对应标本编号，置于离心管架上。
• c）先用移液器混匀RNA提取液A，然后吸取10µl加入到编好号的离心 管中，再用移液器吸取50µl 血清加入，最后用移液器加入200 µlRNA 提取液B，在震荡器上震荡混匀，放置5分钟，然后6000转1分钟离心。
我科开展的PCR检验项目
• 乙 肝 病 毒（HBV－DNA） • 丙 肝 病 毒（HCV－RNA） • 结 核 杆 菌（TB－DNA） • 肺 炎 支 原 体（MP-DNA） • 梅毒螺旋体（TP－DNA） • 淋 球 菌（NG－DNA） • 沙 眼 衣 原 体（CT－DNA） • 解 脲 支 原 体（UU-DNA） • 幽门螺杆菌(HP—DNA)
pcr仪的使用方法和注意事项
pcr仪的使用方法和注意事项PCR仪是一种广泛应用于分子生物学实验室的仪器，其主要用于DNA的扩增和复制。
PCR技术的发展对于生物学研究和医学诊断有着重要的意义。
在使用PCR仪时，必须遵守一定的使用方法和注意事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。
一、PCR仪的基本原理PCR仪是基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）原理而设计制造的。
聚合酶链式反应是一种体外体系中DNA复制技术，能够在短时间内扩增特定DNA片段。
其基本原理是通过不断重复三个步骤：变性、退火和延伸，使目标DNA片段得以扩增。
二、PCR仪的使用方法1. 准备实验材料：包括目标DNA样本、引物、聚合酶、缓冲液等。
2. 设置反应体系：根据实验需求，在试管中加入适量目标DNA样本、引物和其他试剂，并保持反应体系中各组分浓度适当。
3. 设置PCR程序：根据目标DNA片段长度和引物特性等因素，在PCR 仪上设置相应程序。
主要包括变性温度、退火温度、延伸温度和延伸时间等参数。
4. 开始PCR反应：将试管放入PCR仪中，启动反应程序，使PCR仪按照预设的温度和时间变化进行反应。
5. 结果分析：根据实验目的，选择适当的方法对PCR产物进行分析和检测，如凝胶电泳、测序等。
三、PCR仪的注意事项1. 严格控制实验环境：PCR反应对环境要求较高，要保持实验室干净整洁，并严格控制空气中的污染物。
避免使用含有DNA污染的试剂和器皿。
2. 避免交叉污染：在每次操作前，使用漂白剂或紫外线照射等方法对操作台面、试管架等进行消毒。
每次使用新工具或器皿前都要进行彻底清洗，并避免交叉使用。
3. 严格控制反应体系中各组分浓度：各组分浓度过高或过低都会影响PCR反应的效果。
在设置反应体系时要根据实验需求选择适当浓度，并保持稳定性。
4. 避免样本污染：在提取DNA样本过程中，要避免外源DNA的污染，使用无菌技术操作，并在操作过程中避免接触皮肤和呼吸道。
PCR技术操作流程及注意事项
PCR技术操作流程及注意事项⼀、PCR 的基本原理类似于DNA 的体内复制。
⼀先待扩增DNA 模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却⼀某⼀温度，这⼀温度可使引物与它的靶序列发⼀退⼀，再将温度升⼀使退⼀引物在DNA 聚合酶作⼀下得以延伸。
这种热变性- 复性- 延伸的过程就是⼀个PCR 循环，PCR 就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
⼀、PCR 反应体系1. 缓冲液标准的缓冲液含1pmol/ml Tris ·HCl，其pH 为8.3-9.0（室温），⼀在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近7.2 。
缓冲液中含有⼀种⼀价阳离⼀，⼀于激活DNA 聚合酶的活性中⼀，⼀般使⼀Mg 2+ 。
2.dNTP脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP 等在内的统称，即合成新的DNA 链的材料。
4 种dNTP 的浓度相等，总浓度⼀般为200pmol/ml （即饱和浓度）。
dNTP 可与Mg 2+ 结合，使游离的Mg 2+ 浓度下降，影响DNA 聚合酶的活性。
3. 引物引物是⼀段短的单链DNA ⼀段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作⼀的起始点，DNA 聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。
引物长度⼀般以18～30bp 为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退⼀⼀影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。
引物的碱基顺序不能与⼀扩增区有同源性。
4. 模板模板是⼀段单链或者双链DNA，提供⼀于进⼀PCR 扩增的原始信息。
对模板的纯度要求低，但不能混有蛋⼀酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋⼀等。
模板DNA 应该尽量保持低温保存。
5.Taq DNA 聚合酶Taq DNA 聚合酶以DNA 为复制模板，从将DNA 由5' 端点开始复制到3' 端的酶。
DNA 聚合酶的主要活性是催化DNA 的合成（在具备模板、引物、dNTP 等的情况下）及其相辅的活性。
PCR原理及注意事项
PCR原理及注意事项PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种在分子生物学领域中广泛使用的技术，用于扩增目标DNA片段或基因。
PCR技术通过不断重复一系列的温度循环，结合特定的引物和DNA聚合酶来实现DNA的扩增。
以下是PCR原理和注意事项的详细介绍。
PCR是一种体外的DNA扩增技术，可以从极少量的DNA样本中扩增出大量的DNA片段，从而方便进行进一步研究。
PCR反应通常涉及三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性（Denaturation）：将DNA样本加热至94-98°C，以断开双链DNA，使其形成两条单链。
2. 退火（Annealing）：将反应温度降至50-65°C，使引物与目标DNA序列特异性结合。
引物是短DNA片段，可以绑定到目标DNA序列的两端。
3. 延伸（Extension）：在60-75°C条件下，DNA聚合酶（例如Taq聚合酶）在引物的引导下，在目标DNA上合成新的DNA链，形成两个新的DNA双链。
通过不断重复这个PCR循环，每个循环将目标DNA段扩增一倍，扩增的DNA量呈指数增长，最终得到大量目标DNA。
PCR注意事项：1.基本操作规范：为了防止DNA污染和混合，实施PCR反应时，需要使用无菌试剂和工作区域，并避免接触空气中的DNA。
2.设计引物：合适的引物是PCR成功的关键。
引物应具有良好的特异性，并且序列不应内部重叠或与其他非目标DNA序列互补。
引物的长度通常在18到30个碱基对之间。
3.防止污染：特别注意防止污染的问题，尤其是在引物制备和样本准备过程中。
使用无菌技术并采取防污染措施，例如使用不同的实验室器皿和耗材，避免交叉污染。
4.合适的PCR缓冲液和酶：选择适合实验需求的PCR缓冲液和酶。
不同的PCR缓冲液和酶在反应条件和扩增效率上可能有所不同。
确保合适的成分浓度和酶的稳定性。
5.DNA模板的纯度：为了提高PCR反应的效率和特异性，DNA模板的纯度至关重要。
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PCR
一、PCR的原理
PCR，Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应，由Kary Mullis博士在1985年于美国的PE-Cetus公司工作期间发明。
该技术基本原理如下：
在模板DNA、primers和4种dNTPs存在下，依赖于DNA polymerase的酶促合成反应。
DNA polymerase以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。
在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端(退火),并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链的过程并依次循环。
1.PCR反应的基本成分
包括：Templates DNA(待扩增DNA)、Primers、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的Buffer(对于高GC含量的模板有时加入3% DMSO)。
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
2.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
②.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃或60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶或Phusion DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，新链又可成为下次循环的模板。
3.PCR的反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示实际扩增效率，平均约为75%，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
如果进行30个Cycles，实际扩增倍数往往为106-107（理论上以Y=2n计算，为109）。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。
PCR 扩增效率及DNA聚合酶、PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素与之都有
关。
大多数情况下，平台期的产生不可避免。
二、PCR的种类
1.常规PCR
2.反转录PCR（reverse transcription，RT- PCR）
先在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板，Primer 1（常用Oligo(dT)引物）为引物合成与其互补的cDNA（complementary DNA），再以cDNA为模板，Primer 2为引物进行PCR反应。
常用逆转录酶有AMV（avian myeloblastosis virus，酶活最适温度42℃）和MMLV（moloney murine leukemia virus，酶活最适温度37℃）。
RT-PCR是一种快速简便敏感度极高的检测mRNA转录量或蛋白表达水平的方法。
半定量RT-PCR
以组织中普遍表达且表达量恒定的管家基因的mRNA表达为对照，将目的基因mRNA 与之一起逆转录成各自cDNA，最后计算它们的比值来达到对mRNA表达半定量的目的。
3.实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，Q-RT-PCR）
在PCR反应体系中加入荧光基团（SYBP Green 1或Taqman或分子信标等），利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值（C 代表Cycle，T代表threshold）和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
Ct值：扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
荧光阈值是前3-15个循环荧光信号的标准偏差的10倍。
用途：绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线；相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间或不同基因之间的基因表达差异；基因型/等位基因分析，例如SNP检测；转基因生物监测等
4.重组PCR（又称重叠PCR，overlap PCR）：制备杂合基因
5.多重PCR(又称复合PCR，multiplex PCR)
两对或两对以上引物在一个反应体系中扩增多条目的基因片段
6.不对称PCR：使用浓度相差100倍的正反引物，得到单链DNA
7.反向PCR：扩增引物相反方向DNA序列（目的基因之外的序列），从而研究未知序列
8.巢式PCR（Nest PCR）：高特异性扩增，一对引物扩全长，一对引物扩内部部分序列
此外，还有Touchdown PCR、锚定PCR（A-PCR）、Allele- specific PCR（AS-PCR）、单
链构型多态性PCR（SSCP-PCR）和低严格单链特异性引物PCR（LSSP- PCR）等。