蛋白质的三维结构5

蛋白质的折叠
Folding－折叠 Unfolding－去折叠 Refolding－再折叠
过程、行为
Denaturation－变性 Renaturation－复性
现象、方法
Native state folded
unfoldin g
Denatured state unfolded
refolding
蛋白质的折叠
蛋白质的折叠
分子伴侣的作用 是防止蛋白质的错 误折叠和聚集，其 自身并不成为折叠 后的蛋白结构的一 部分。
Nascent peptide
Unfolded peptide chaperones
Unproductive misfolding
Degradation
intermediate
Recognition Biding
蛋白质的折叠
蛋
白
质
蛋白质折叠是一
折
个序变过程，蛋
叠
白质折叠要经历
的 途
中间状态。
径
蛋白质的折叠
（二）蛋白质折叠的中间体
蛋白质的折叠
蛋白质折叠过程中形成的中间体
蛋白质的折叠
Figure. Folding Pathway of Barnase the denatured state D to native state N via intermediate I and transition state TS , is shown in reverse.
蛋白质的折叠
疏水内核的形成是以疏水作用为基础的，疏水作用在本 质上是一种能量效应，是一个从高能态趋于低能态的自动 发生的过程。 可以说，驱动蛋白质折叠的主要动力是熵效应。
蛋白质的折叠
疏水内核还是推动以二级结构为基础的蛋白质分子骨架 形成的重要因素。
由于疏水侧链的内埋，必然带动其主链也随之进入分子 内部。主链是高度极性的，它们每个肽单位都带有一个氢 键给体N-H和一个氢键受体C=O。
蛋白质的折叠
（4）扩散-碰撞-粘合机制(Diffusion-Collision-Adhesion Model)：折叠起始于伸展肽链上的几个位点，这些位点上 能生成二级结构单元或者疏水簇，这些局部结构通过扩散、 碰撞、相互粘附，进一步折叠形成无活性的高度有序的中 间体，最后转变为有活力的完整天然态。
3：超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对 透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况， 且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
包涵体复性
4：柱上复性：包涵体蛋白变性后， 在层析柱上复性，大致可分成疏水 柱复性及凝胶柱复性两类。色谱柱 复性回收率高（高达90%以上）、 快速、易放大，样品稀释倍数小 （一般五倍左右）。 此外，吸附法、反胶束法和双水相 萃取法等都可用蛋白质的复性。
蛋白质的折叠
蛋白质的常用变性方法：
变性方法 高温
酸碱
有机溶剂 化学变性剂 表面活性剂
代表 作用原理
受影响结 构
/ 破坏氢键
二级以上
/ 影响盐键
二级以上
丙酮、乙醇
破坏氢键与疏 水作用、降低
介电常数 二级以上
盐酸胍
破坏主链氢 破坏疏水作
键、降低疏
用
水作用
二级以上 三级以上
蛋白质的折叠
蛋白质变性是具有协同性的过程 （cooperative process）
蛋白质的折叠
蛋白质的复性：当蛋白质的变 性因素除去后，变性蛋白质又 可回复到天然构象，称为复性 （renaturation）。 蛋白质的复性伴随着生物功能 的恢复，如胃蛋白酶加热至80 －90℃时，失去活性，降温至 37℃，又可恢复活力。
….-Gly-Ala-Glu-Phe-….
？
蛋白质的折叠
蛋白质三维结构的成因
蛋白质结构具有一个共同的特征：分子内都有一个 疏水内核，由紧密堆积的疏水侧链构成。
将疏水侧链堆积进入分子 内部，是蛋白质形成三维空间 结构（折叠）的主要驱动力。
蛋白质的折叠
蛋白质分子内核中的疏水侧链以高度协调的方式达到紧 密堆积的效果，它们的几何形貌是空间互补的。 蛋白质内核的疏水性同有机分子的油－水分离现象类似， 但其密堆积特性使之具有更大的能量稳定性。
折叠病
折叠病
Alzheimer’s disease (AD)
学名：阿尔茨海默氏病 临床症状：以遗忘为最早期、最突出的症状。继
而出现反应迟钝、判断力和理解力下降，重复语 言和无意义的重复动作等。随着疾病进展，最终 严重痴呆，卧床不起，出现并发症。
折叠病
Amyloid plaque: 淀粉样蛋白斑
refolding
蛋白质的折叠
蛋白质的变性： 蛋白质在物理（高温、高压）、化学（酸碱、变性剂） 作用下，高级结构遭到破坏，致使其理化性质和生物功 能发生改变，这种现象称为变性（denaturation）。
注意：变性过程中，蛋白质的高级结构被破坏，但其一级 结构保持完好；变性的实质是次级键被破坏，共价键保 持完好。
蛋白质的折叠
蛋白质的折叠规律
蛋白质的折叠不是随机尝试所有可 能的构象直到遇到最适构象。蛋白 质能在一个很短时间的范围内折叠, 一定是沿着某些确定的途径进行， 蛋白质的折叠有特定的规律。
蛋白质的折叠
蛋白质的折叠规律
1961年，Anfinsen提出了 “蛋白质折叠的信息包含在 氨基酸顺序中”， 即蛋白质 的一级结构决定高级结构的 著名假说。
蛋白质的折叠
1040
计算机模拟猴子敲击键盘写出“哈姆雷特”的台词
蛋白质的折叠
（三）能量谱理论
蛋白质折叠的“能量谱理论”是基于 一种热力学的观点，折叠过程可以被 看作是一种自由能漏斗。蛋白质的去 折叠状态具高构象熵和相对高的自由 能。在蛋白质折叠过程中，漏斗的向 下逐渐变窄表示一个自由能和熵减少 的过程。
Chapter 4 补充材料二 蛋白质的折叠
蛋白质的折叠
蛋白质的折叠
蛋白质的折叠： 肽链经过疏水塌缩、 空间盘曲、侧链叠 集等行为形成蛋白 质的天然构象，同 时获得生物活性。 折叠是蛋白质构象 变化的一种行为。
Native state folded
unfoldin g
Denatured state unfolded
的
途
径
结构域
三级结构
蛋白质的折叠
（2）疏水塌缩模型(Hydrophobic Collapse Model)：疏水作 用力是蛋白质折叠的决定性因素，在折叠初期，蛋白质首先 发生疏水塌缩，非极性侧链内埋于一个松散的压缩结构中。
（3）成核-凝聚-生长模型(Nucleation-Condensation-Growth Model)：肽链中某一区域可以形成“折叠晶核”，以此为核 心，整个肽链继续折叠成天然构象。
（一）蛋白质折叠途径的假说 （1）框架模型(Framework Model)：蛋白质折叠过程分为几 个阶段，相互之间独立存在的二级结构单元首先形成；随后 这些二级结构单元靠近、接触，形成稳定的超二级结构框架； 最后超二级结构框架相互拼接，形成蛋白质三级结构。
蛋白质的折叠
一级结构
蛋
白
质
二级结构
折
叠
超二级结构
在内核的疏水环境中，这些极性基团必须通过彼此形成 氢键来彼此中和。
- +
- +
－N－H ... O＝C－
蛋白质的折叠
正是在这种能量平衡中，蛋白质 主链的折叠产生由氢键维系的有规 则的构象，称为二级结构。
通过这种方式，90%的主链极性 基团彼此形成氢键，以二级结构为 基础形成相对刚性和稳定的蛋白质 分子骨架。
蛋白质的折叠
蛋白质变性的表现：
结构的改变：一些侧链基团暴露出来，分子结构更加伸展松散， 不对称程度增加。
物理化学性质的改变：溶解度降低，易形成沉淀；粘度升高， 扩散系数降低，旋光度和红外、紫外光谱均发生变化。
生物化学性质的改变：变性蛋白易被蛋白酶水解（熟食容易消 化）。
生物功能的变化：生物活性丧失， 例如酶失去活性，抗体失去结合抗原 的能力，血红蛋白失去载氧能力等等。
蛋白质的折叠
蛋白质的折叠规律
蛋白质的自发折叠令人惊奇，多肽链能够采取的构象 个数是一个天文数字，这个数字是如此之大以致于任何蛋 白质都不能在一个可行的时间范围内尝试所有的构象。
10100 10-13 1087 s 1077 years 10 -1 or 10 -3s
Levinthal's paradox
蛋白质的折叠
蛋白质的折叠规律
蛋白质折叠研究的理论核 心：揭示多肽链氨基酸排 列顺序与蛋白质分子的折 叠、组装、识别和相互作 用的内在关系，即“折叠 密码”或“空间密码”， 又称之为“第二遗传密码” （the second half of the genetic code）。
蛋白质的折叠
蛋白质的折叠研究进展
包涵体复性
包涵体的复性是将多余的变性剂除掉，使蛋白质复性的 方法，包括：
1：稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是 体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
2：透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液 浓度来控制变性剂去除速度，缺点是易形成无活性蛋白 质聚体，且不适合大规模操作。
蛋白质的折叠
新生肽链折叠并组装 成有功能的蛋白质并 非都是自行其事的， 相当多的情况下需要 其他蛋白质的帮助。 具有帮助折叠功能的 蛋白质分为两类：分 子伴侣和折叠酶。
蛋白质的折叠
分子伴侣（ molecular chaperon ）
分子伴侣是一类帮助新生肽链折叠和组装的蛋白质分子的 总称。
分子伴侣通过与其底物蛋白的结合与释放，参与它们在体 内的正确运作过程：折叠、寡聚体的装配、输送到特定的 亚细胞组分、在活性/非活性构象之间进行可控转换等。
合成后折叠 （Co-translational folding）
边合成边折叠 （Post-translational folding）
蛋白质的折叠
蛋白质的折叠
蛋白质的折叠－分子伴侣和折叠酶
在活体细胞内，生物分子 的浓度非常高，增加了蛋 白质折叠的困难度，蛋白 质也容易有聚合倾向。生 物的进化必然会创造一种 机制克服这个问题。
折叠病
PrPc
PrPSc
折叠病
错误折叠导致沉淀样物质
蛋白质折叠理论的实践应用－包涵体复性
大肠杆菌中重组蛋白的高表达常常导致 包涵体的产生。包涵体是无活性蛋白质的聚 沉物，使包涵体在体外成功复性是获取商业 利益的关键技术保障。
通常包涵体的复性包括三个主要步骤： 包涵体的分离与洗涤；蛋白质沉淀的溶解； 溶解蛋白的再折叠。由于错误折叠和聚沉的 影响，再折叠过程是整个工作的关键。
蛋白质的折叠
能谱中间诸多的亚稳态代表处于 亚稳定状态的中间体。随着蛋白 结构逐渐接近于天然态，多种中 间体结构的平均能量逐渐下降， 同时，不同构象的数目也逐渐减 少，故构象熵越来越低。在漏斗 的底部，所有的折叠中间体都归 结为单一的天然构象。
蛋白质的折叠
（四）新生肽链的体内折叠
蛋白质体内 折叠模型
SRP
Pro-sequences Lim蛋白 Rb蛋白
prions
作
用
核小体装配，去装配
肽折叠，转运
肽折叠，转运，寡聚体去装配
结合位点的识别
与Hsp及GrpE的相互作用 与Hsp70的相互作用 细菌多肽的转运
多肽的转运
蛋白质折叠
细菌脂酶的折叠
转录因子的结合
分子伴侣选择
蛋白质的折叠
分子伴侣GroEL/ES的寡聚体结构
蛋白质的折叠
GroEL/ES帮助蛋白质折叠
蛋白质的折叠
折叠酶 Foldase
蛋白质二硫键异构酶
PDI（protein disulfide isomerse）
CySH + CySH CyS–CyS
肽酰脯氨酰顺反异构酶
PPI（peptidyl prolyl isomerse）
蛋白质的折叠
肽酰脯氨酰顺反异构酶：在蛋白质折叠过程中催化 肽酰脯氨酰肽键（X-Pro）的顺反异构化反应。
蛋白质折叠理论的实践应用－折叠病
折叠病
由蛋白质错误折叠引起的疾病，通称蛋白质构象紊乱症 (protein conformational disorders, PCDs)。PCD病的最大 特点是正常蛋白的二级结构或三级结构的改变，而一级结构 不变。构象的变化使蛋白质具有毒性或丧失其天然态的功能 而产生病变。在多数PCD中，错误折叠的蛋白质分子自身聚 合并在机体中形成淀粉样聚沉物，导致组织损失和器官的功 能异常。
Release Refolding
Correct folding
Complex
Aggregates
Degraded product
Functional protein
蛋白质的折叠
分子伴侣的类别
名
称
核质素（nucleoplasmin）
Chaperonins(Hsp60)
Hsp70(DnaK)
Hsp90 DnaJ蛋白 GrpE蛋白 SecB蛋白