分子标记—SNP
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➢ 一个SNP表示在基因组某个位点上有一个 核苷酸的变化，多个核苷酸的变化，即 SNPs
➢ 在描述SNPs时，当前的一致意见是用术语 haplotype（单体型）代替术语allele（等 位基因）
➢ 位于一条染色体上某一区域的一组相关 联的SNP等位位点，被称作单体型
对于所有那些在某一位点是A而不是G的人来说，该位点周围染色体区域 上的SNPs状况很可能是一致的。这些变异连锁的区域就是单体型
3. 根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位点
4. 对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得
技术路线图
☻ 该技术的优势
a. 分型准确：该技术也称小测序技术，其准确度仅 亚于直接测序。
b. 多位点同时检测：可以同时检测达12个位点，而 Taqman一次仅能检测一个
c. 不受SNP位点多态特性限制：不管该位点是G/C, A/T, G/A, C/T还是插入/缺失多态，都可以放在 一个体系中检测
技术路线图
Multiplex SNaPshot-多重单碱基延伸技 术
1. 在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP, 紧挨多 态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的 反应体系中，引物延伸一个碱基即终止
2. 经ABI测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入பைடு நூலகம்碱基 种类，从而确定该样本的基因型
➢ 遗传稳定性
与微卫星等重复序列多态标记相比, SNP 具有 更高的遗传稳定性，因为SNP 是基于单核苷酸的 突变，所以其突变率低
➢ 易实现分析的自动化
SNP 与传统分子标记方法存在明显不同， 不再以 DNA 长度差异作为检测手段，而是直接检测序列变化， 从而摆脱凝胶电泳的瓶颈限制，实现高效检测
SNP的分类
基因间SNP (iSNP）
SNP的检测
SNP 检测技术按研究对象主要分为两大类
➢ 未知单核苷酸突变位点的检测技术
温度梯度凝胶电泳（TGGE）
通过温度的变化，使点突变或正常的DNA片段 由于氢键不稳定，造成TM值不同而表现出不同的 解链行为。作为一种常用的检测SNP的强有力的 工具，TGGE可分析长度在200~900bp内的双链DNA 片段，但如果在GC富集区，则SNP检出率则大大 下降
非同义cSNP
碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变从而产 生蛋白质序列的改变,可能最终影响到蛋白质的功能
➢ 基因非编码区SNP
大多数SNP 位于基因组的非编码区，它们对个体表现 型是无意义的，但对群体而言，这些SNP 作为遗传标记 在群体遗传和生物进化中却有很大作用
基因周边SNP (pSNP）
分子标记
SNP
什么是SNP SNP的特点 SNP的分类 SNP的检测 SNP的应用
什么是SNP
➢ SNP = Single Nucleotide Polymorphism 单核苷酸多态性
➢ 基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A, T, C, G) 的变异而引起的多态性
➢ 一般而言, SNP在群体中发生频率不小于 1%
➢ 已知单核苷酸突变位点的检测技术
限制性内切酶酶切片断长度多态分析（RFLP）
┕ 有些SNP多态位点正好处于限制性内切酶的识别 位点处，其中一种多态对应的PCR扩增片断能够 被相应的内切酶切动，而另一种却不能，因此 通过对酶切后的PCR产物电泳后的片断长度分析 可知检测样本在该位点处的基因型
┕ 如果检测SNP位点不存在合适的酶切位点，往往 可以通过在PCR引物3’端改变个别碱基引入限 制性内切酶酶切位点，通过这种引物修饰法可 以实现绝大多数SNP位点的分型都能用RFLP分析 来实现
3. 特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’ 到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’ 端淬灭荧光基团的淬灭作用 (quench)，从而发出荧光
4. 两个探针的5’端标有不同的荧光 (FAM或VIC)，3’端标 有MGB 淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以 判断相应的样本的SNP 等位基因型
SNP的特点
➢ 位点丰富
SNP是基因组中分布最广泛而稳定的点突变，在人 类基因组中大概每1000 个碱基就至少有一个SNP,人类 基因组上的SNP总量可达300万个甚至更多
➢ 具有代表性
某些位于基因内部的SNP 有可能直接影响蛋白质结构 或表达水平, 因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些 作用因素
根据SNP在基因组分布的位置可分为
➢ 基因编码区SNP (cSNP)
总的来说, cSNP比较少,因为在外显子内的变异率 仅占周围序列的1/5, 但它在遗传病和育种的研究中 却具重要意义,因此倍受关注
根据对遗传性状的影响,cSNP又可分为两种
同义cSNP
即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨 基酸序列,突变碱基与未突变碱基的“含义”相同
Taqman技术
1. PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针 来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为 报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团 (quencher)
2. PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互 补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于 能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光
➢ 从理论上来看每一个SNP位点都可以有4 种不同的变异形式, 包括转换、颠换、插 入和缺失，但通常发生的只有两种, 即转 换和颠换,二者之比为2 :1
AGGCTAGAATTCCATTCGAGTC
AGGCTAGAATTGCATTCGAGTC
➢ 在人类基因组中，CpG二核苷酸的胞嘧 啶是最易发生突变的位点, 其中大多数 是甲基化的,可自发地脱去氨基而形成 胸腺嘧啶（C → T）
d. 不受样本量的限制：而Taqman对少量样本不适合
e. 可以检测出受污染的样本：如果一个样本的分型 峰谱偏离正常的分布，它可以提示该样本可能受 到污染或浓度过低，而其它分型方法则不能做到 这一点
变性梯度凝胶电泳（DGGE） 单链构象多态性（SSCP） 变性的高效液相色谱法（DHPLC） 毛细管电泳（CE） 基因芯片技术(Gene chip）
➢ 在描述SNPs时，当前的一致意见是用术语 haplotype（单体型）代替术语allele（等 位基因）
➢ 位于一条染色体上某一区域的一组相关 联的SNP等位位点，被称作单体型
对于所有那些在某一位点是A而不是G的人来说，该位点周围染色体区域 上的SNPs状况很可能是一致的。这些变异连锁的区域就是单体型
3. 根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位点
4. 对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得
技术路线图
☻ 该技术的优势
a. 分型准确：该技术也称小测序技术，其准确度仅 亚于直接测序。
b. 多位点同时检测：可以同时检测达12个位点，而 Taqman一次仅能检测一个
c. 不受SNP位点多态特性限制：不管该位点是G/C, A/T, G/A, C/T还是插入/缺失多态，都可以放在 一个体系中检测
技术路线图
Multiplex SNaPshot-多重单碱基延伸技 术
1. 在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP, 紧挨多 态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的 反应体系中，引物延伸一个碱基即终止
2. 经ABI测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入பைடு நூலகம்碱基 种类，从而确定该样本的基因型
➢ 遗传稳定性
与微卫星等重复序列多态标记相比, SNP 具有 更高的遗传稳定性，因为SNP 是基于单核苷酸的 突变，所以其突变率低
➢ 易实现分析的自动化
SNP 与传统分子标记方法存在明显不同， 不再以 DNA 长度差异作为检测手段，而是直接检测序列变化， 从而摆脱凝胶电泳的瓶颈限制，实现高效检测
SNP的分类
基因间SNP (iSNP）
SNP的检测
SNP 检测技术按研究对象主要分为两大类
➢ 未知单核苷酸突变位点的检测技术
温度梯度凝胶电泳（TGGE）
通过温度的变化，使点突变或正常的DNA片段 由于氢键不稳定，造成TM值不同而表现出不同的 解链行为。作为一种常用的检测SNP的强有力的 工具，TGGE可分析长度在200~900bp内的双链DNA 片段，但如果在GC富集区，则SNP检出率则大大 下降
非同义cSNP
碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变从而产 生蛋白质序列的改变,可能最终影响到蛋白质的功能
➢ 基因非编码区SNP
大多数SNP 位于基因组的非编码区，它们对个体表现 型是无意义的，但对群体而言，这些SNP 作为遗传标记 在群体遗传和生物进化中却有很大作用
基因周边SNP (pSNP）
分子标记
SNP
什么是SNP SNP的特点 SNP的分类 SNP的检测 SNP的应用
什么是SNP
➢ SNP = Single Nucleotide Polymorphism 单核苷酸多态性
➢ 基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A, T, C, G) 的变异而引起的多态性
➢ 一般而言, SNP在群体中发生频率不小于 1%
➢ 已知单核苷酸突变位点的检测技术
限制性内切酶酶切片断长度多态分析（RFLP）
┕ 有些SNP多态位点正好处于限制性内切酶的识别 位点处，其中一种多态对应的PCR扩增片断能够 被相应的内切酶切动，而另一种却不能，因此 通过对酶切后的PCR产物电泳后的片断长度分析 可知检测样本在该位点处的基因型
┕ 如果检测SNP位点不存在合适的酶切位点，往往 可以通过在PCR引物3’端改变个别碱基引入限 制性内切酶酶切位点，通过这种引物修饰法可 以实现绝大多数SNP位点的分型都能用RFLP分析 来实现
3. 特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’ 到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’ 端淬灭荧光基团的淬灭作用 (quench)，从而发出荧光
4. 两个探针的5’端标有不同的荧光 (FAM或VIC)，3’端标 有MGB 淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以 判断相应的样本的SNP 等位基因型
SNP的特点
➢ 位点丰富
SNP是基因组中分布最广泛而稳定的点突变，在人 类基因组中大概每1000 个碱基就至少有一个SNP,人类 基因组上的SNP总量可达300万个甚至更多
➢ 具有代表性
某些位于基因内部的SNP 有可能直接影响蛋白质结构 或表达水平, 因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些 作用因素
根据SNP在基因组分布的位置可分为
➢ 基因编码区SNP (cSNP)
总的来说, cSNP比较少,因为在外显子内的变异率 仅占周围序列的1/5, 但它在遗传病和育种的研究中 却具重要意义,因此倍受关注
根据对遗传性状的影响,cSNP又可分为两种
同义cSNP
即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨 基酸序列,突变碱基与未突变碱基的“含义”相同
Taqman技术
1. PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针 来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为 报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团 (quencher)
2. PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互 补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于 能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光
➢ 从理论上来看每一个SNP位点都可以有4 种不同的变异形式, 包括转换、颠换、插 入和缺失，但通常发生的只有两种, 即转 换和颠换,二者之比为2 :1
AGGCTAGAATTCCATTCGAGTC
AGGCTAGAATTGCATTCGAGTC
➢ 在人类基因组中，CpG二核苷酸的胞嘧 啶是最易发生突变的位点, 其中大多数 是甲基化的,可自发地脱去氨基而形成 胸腺嘧啶（C → T）
d. 不受样本量的限制：而Taqman对少量样本不适合
e. 可以检测出受污染的样本：如果一个样本的分型 峰谱偏离正常的分布，它可以提示该样本可能受 到污染或浓度过低，而其它分型方法则不能做到 这一点
变性梯度凝胶电泳（DGGE） 单链构象多态性（SSCP） 变性的高效液相色谱法（DHPLC） 毛细管电泳（CE） 基因芯片技术(Gene chip）