代谢控制发酵

第一章：微生物代谢
小结：1、能量代谢是生物新陈代谢的核心
2、化能异养微生物的生物氧化必须经历脱氢、递氢和受氢3个阶段，依据受体的不
同将生物氧化分为三种：呼吸、无氧呼吸和发酵
3、化能自养微生物利用无机氧化获得ATP，产能少，生长得率极低
4、字样微生物通过光和磷酸化获得ATP，包括循环光合酸化、分循环光和磷酸化和
紫膜光合磷酸化三种
5、微生物具有固氮作用
复习题：
1、名词解释：
生物氧化：在生物体内，从代谢物脱下的氢及电子﹐通过一系列酶促反应与氧化合成水﹐并释放能量的过程。

有氧呼吸：微生物在降解底物过程中，将释放出电子传给NAD（P）+、FAD或FMN等电子载体，在经电子传递系统传给外源电子受体，以分子氧作为最终电子受体，从而生成水或其它还原型产物并释放出能量的过程
无氧呼吸：微生物在降解底物过程中，将释放出电子传给NAD（P）+、FAD或FMN等电子载体，在经电子传递系统传给外源电子受体，以氧化型化合物作为最终电子受体，从而生成水或其它还原型产物并释放出能量的过程
发酵：是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。

电子传递链（呼吸链）：多种递电子体或递氢体按次序排列的连接情况。

生物氧化过程中各物质氧化脱下的氢，大多由辅酶接受，这些还原性辅酶的氢在线粒体内膜上经一系列递电子体(或递氢体)形成的连锁链，逐步传送到氧分子而生成水。

此种连锁过程与细胞内呼吸过程密切相关。

植物的叶绿体中则存在光合电子传递链以传递电子，完成光合作用中水分解出氧，形成NADPH的过程。

光和磷酸化（循环/非循环）：一种存在于厌氧光合细菌中的利用光能产生ATP的磷酸化反应，由于它是一种在光驱动下通过电子的循环式传递而完成的磷酸化，故称循环光合磷酸化。

生物固氮：生物固氮是指分子氮通过固氮微生物固氮酶系的催化而形成氨的过程。

自生/共生/联合固氮菌：自生固氮菌：独立进行固氮，但并不将氨释放到环境中，而是合成氨基酸；固氮效率较低。

共生固氮菌：与其他生物形成共生体，在共生体内进行固氮；将固氮产物氨，通过根瘤细胞酶系统的作用，及时运送给植物体各部，直接为共生体提供氮源。

共生固氮菌：与其他生物形成共生体，在共生体内进行固氮；将固氮产物氨，通过根瘤细胞酶系统的作用，及时运送给植物体各部，直接为共生体提供氮源。

2、微生物代谢的特点是什么？
1)代谢旺盛；
2)代谢极为多样化；
3)代谢的严格调解和灵活性。

光能型微生物产能：光和磷酸作用产能；植物型（蓝细
菌）：放养性光合作用；化能异养微生物产能：氧化磷酸化作用；发酵型产能：（最终电子受体为有机物）；呼吸型产能：有氧呼吸和无氧呼吸；化能自养微生物产能：通过氧化物及氧化物（电子呼吸链产能）。

3、什么是发酵？什么是呼吸？两者有什么主要区别？
发酵是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。

呼吸作用为微生物在降解底物过程中，将释放出电子传给NAD（P）+、FAD或FMN等电子载体，在经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或其它还原型产物并释放出能量的过程。

主要区别：电子载体不是将电子直接传递给底物降解的中间产物，而是交给电子传递系统，逐步释放出能量后再交给最终电子受体。

4、葡萄糖降解主要有几条途径？
（1）EMP途径：糖酵解途径
（2）HMP途径：戊糖磷酸途径
（3）ED途径：2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）途径
（4）PK途径：磷酸解酮酶途径
6、化能自养菌的能量代谢有什么特点？
1)无机物底物上脱下的氢（电子）直接进入呼吸链，通过氧化磷酸化产能
2)由于电子可以从多处进入呼吸链，所以有多种多样的呼吸链
3)产能效率通常要比化能异养细菌的低，由于产能效率低，所以化能自养细菌生长缓
慢，细胞产率低
7、试述细菌固氮作用机理和必要条件。

生物固氮反应的6个条件：ATP、固氮酶、镁离子、底物N2、厌氧微环境、还原力
[H]及其载体
固氮反应的总式：N2 + 6H+ + 12ATP +6e→2NH3+12ADP+12Pi
8、在化能异养微生物的生物氧化中，底物脱氢和产能途径主要有哪几条？
1、EMP途径（糖酵解途径）
有氧时，与TCA连接，将丙酮酸彻底氧化成二氧化碳和水。

无氧时，丙酮酸进一步代谢成有关产物。

2、HMP途径（己糖-磷酸途径）
产生大量NADPH2和多种重要中间代谢物。

3、ED途径 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸裂解途径 KDPG
是少数缺乏完整EMP的微生物具有的一种替代途径，细菌酒精发酵经ED进行。

4、TCA循环（三羧酸循环）
真核在线粒体中，原核在细胞质中。

TCA在代谢中占有重要枢纽地位
9、试从狭义和广义两方面来说明发酵的概念
狭义的发酵是微生物生理学严格定义的“发酵”：是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。

广义的发酵是工业生产上定义的发酵：工业生产上笼统地把一切依靠微生物的生命活动而实现的工业利用秸秆发酵制成沼气生产均称为“发酵”。

这样定义的发酵就是“工业发酵”。

第二章微生物代谢的调节机制
1、反馈抑制的本质是什么？分支代谢途径中存在哪些主要的反馈抑制类型？
本质：在某代谢途径的末端产物（即终产物）过量时，这个产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性，促使整个反应过程减慢或停止，从而避免了末端产物的过多累积。

分支代谢途径中的反馈抑制
（1）同功酶调节
（2）协同反馈抑制（concerted feedback inhibiton）
（3）合作反馈抑制（cooperative feedback inhibiton）
（4）累积反馈抑制（cumulative feedback inhibiton）
（5）顺序反馈抑制（sequential feedback inhibiton）
（6）终产物抑制的补偿性逆转(compensatory reversal of end-product inhibition)
2、什么是同功酶？什么是变构酶？它们在反馈抑制中起着什么作用？
同功酶：是指能催化同一生化反应，但结构稍有不同，可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。

作用：
变构酶：具有变构作用的酶。

作用：每个变构酶的分子可以结合一个或多个配体（底物或效应物），理论上结合底物的最大数目与催化中心的数目相等。

结合效应物的最大数目应与调节中心的数目相等。

配体和酶蛋白的不同部位（或亚基）结合时，可在底物——底物，效应物——底物和效应物——效应物之间发生协同反应，此效应可以是促进（正协同）或阻抑的（负协同）
3、什么是诱导酶？酶的诱导有何特点？其意义如何？
诱导酶：只有在其底物，即有诱导物存在时才被合成的酶。

特点：
意义：
4
末端产物阻遏指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏.
分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种可利用底物（碳源或氮源）存在时，利用快的底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。

5、名词解释：
操纵子：操纵子（元）是指结构上、功能上协同作用的相关基因组成的一个片段（区域）。

调节基因：编码组成型调节蛋白的基因；
效应物：编码组成型调节蛋白的基因；
调节蛋白：
5、试图示并解释乳糖操纵子的诱导机制。

6、试图示并解释色氨酸操纵子的末端产物阻遏机制。

在没有末端产物的情况下，阻遏蛋白不能与辅阻遏物（如色氨酸）结合成完全阻遏物，因此操纵基因的“开关”是打开的，这时转录、转译可正常进行，诱导酶大量合成；反之，则阻遏物蛋白可与辅阻遏物结合成一个有活性的完全阻遏物，它与操纵基因相结合，使转录的“开关”关闭，从而无法进行转录和转译。

7、酶活性调节与酶合成调节有何不同，它们之间有何联系？
区别： A．从调节对象看：酶合成的调节是通过酶量的变化控制代谢速率，而酶活性的调节是对已存在的酶活性进行控制，它不涉及酶量变化。

B．从调节效果来看：酶活性调节快速而精细；
C．从调节机制看，酶合成调节是基因水平调节，它调节控制酶合成；酶活性调节是代谢调节，它调节酶活性。

联系：细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的正常进行
第三章代谢控制发酵的基本思想
1、分类比较微生物代谢途径的调节模式。

2、何为营养缺陷型突变株和渗漏突变株？各举一个实例说明其在代谢控制发酵中的用途。

营养缺陷型就是指原菌株由于发生了基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某种物质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。

例子：谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成
渗漏突变株就是指遗传性障碍不完全的缺陷型。

例子：
3、抗结构类似物突变株选育的机制是什么？
第19 个ppt
4、增加前体物合成的方法有哪些？
1、切断共同前体的分支途径
2、解除前体物合成的调节
3、增强前体代谢流
4、利用基因工程技术，将生物合成途径中的关键酶基因克隆到多拷贝载体上，使其大量
扩增，从而也就增加了目的产物的前体物的合成，这是最直接的提高目的产物产量的方法。

5、简述菌种改造的五字策略。

菌种改造：“进、通、节、堵、出”五字策略。

1、进：促进细胞对碳源等营养物质的吸收。

2、通：解除对途径中某些酶的反馈调节，或者诱导或激活这些酶，从而使来自各个分
支的碳架物质能畅通地疏向目的产物。

3、节：阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流
向目的产物。

4、堵：消除或消弱目的产物进一步代谢的途径。

5、出：促进目的产物向胞外空间分泌。

第四章代谢控制发酵育种的基本技术
1、什么是诱变育种，简述工业微生物诱变育种技术的一般操作步骤。

诱变育种：利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞中的遗传物质（DNA）的结构发生改变，从而引起微生物的遗传性状发生变化，然后通过目的选择标记设法从群体中筛选出少数性状优良的突变菌株的过程。

步骤：选择易于表现出基因发生改变的单倍体细胞。

选择纯种、单核或细胞核尽量少的细胞：在混有野生型和突变型的异核体中，可能出现分离性表型延迟现象；如在霉菌诱变育种中，多采用分生孢子或孢子囊孢子进行诱变处理。

选择出发菌株应考虑其稳定性。

大幅度提高产量是经过多次诱变、筛选的结果。

2、什么是转导、转化，分类比较转导和转化各自的特点。

转导作用就是利用转导噬菌体作为媒介而将供体菌的部分DNA导入受体菌中，从而使受体菌获得部分遗传性状的现象。

转化就是指相当大的游离的供体细胞的DNA片段被直接吸收到受体细胞中内，并整合于受体细胞的基因组中，从而使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。

3、试述筛选营养缺陷型菌株的方法，并说明营养缺陷型菌株在应用上的作用。

方法：一般是经诱变后，再经中间培养、浓缩缺陷型（淘汰野生型）、检出营养缺陷型（夹层培养法、限量补充培养法、逐个检出法、影印平板法）、确定生长谱鉴定
营养缺陷型。

应用：积累有用的中间代谢产物。

缺陷型菌株常常会使发生障碍的前一步的中间代谢产物得到累积，这就成为利用营养缺陷型菌株进行工业发酵来累积有用的中间代谢
产物的依据。

4、什么是原生质体融合，简述其步骤。

原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG)助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。

步骤：⑴标记菌株的筛选；
⑵原生质体的制备；
⑶原生质体的融合；
⑷原生质体的再生；
⑸融合子的选择；
⑹实用性菌株的筛选。

5、简述诱变时菌悬液的制备。

1)一般采用生理状态一致（用选择法或诱导法使微生物同步生长）的单细胞或孢子进
行处理。

2)处理前细胞尽可能达到同步生长状态，细胞悬浮液经玻璃珠振荡打散，并用脱脂棉
或滤纸过滤，以达到单细胞状态。

对于酵母等个体较大的细胞，可换用二层擦镜纸过滤，经此处理，分散度可达90%以上，供诱变处理较为合适。

3)霉菌和放线菌采用孢子悬浮液进行诱变。

根据选用的诱变剂不同，菌悬液可用生理盐水或缓冲液配制。

用物理诱变剂处理时，一般用生理盐水（NaCl 0.85%）配制悬浮液即可。

用化学诱变剂处理时，必须采用缓冲溶液。

6、掌握几个概念
营养缺陷型：营养缺陷型是属代谢障碍突变株，常由结构基因突变引起合成代谢中一个酶失活直接使某个生化反应发生遗传性障碍，使菌株丧失合成某种物质的能力，导致该菌株在培养基中不添加这种物质，就无法生长。

原养型：指auxo突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。

基本培养基：满足野生型菌株营养要求最低成分的组合。

完全培养基：满足一切auxo生长的天然或半组合培养基。

补充培养基：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应auxo生长的组合培养基。

7、试述抗性突变菌株的3种筛选方法。

1)一次性筛选法：就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变
异株
2)阶梯型筛选法：梯度平板法
3)纸片扩散法：用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，
经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般九厘米的培养皿中等距放置三片为宜。

经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。

第五章重组DNA技术
1. 概念：
（1）克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合，也就是获得遗传背景完全相同的分
子或个体的拷贝。

（2）转化：
（3）基因工程：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作，又称为重组DNA技术（4）限制性核酸内切酶：识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA
的一类内切酶。

是细菌内存在的保护性酶。

（5）载体：可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和定的自我复制的核酸分子。

（6）G文库：存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。

（7）质粒：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。

（8）c文库：用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后，建立的基因文库。

2. 简述基因工程的基本过程。

1)目的基因的获取：从供体细胞的DNA中直接分离基因或者人工合成基因
2)基因表达载体的选择和构建：
3)将目的基因与运载体结合，实现外源基因与载体的连接
4)将目的基因导入受体细胞
5)目的基因的检测和表达
3. 简述目的基因的主要来源或途径。

1)化学合成法：用于已知序列，或可推导出序列的基因
2)基因组DNA：基因组DNA文库（genomic DNA library）
3)cDNA：cDNA文库（cDNA library）
4)聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）
第六章糖代谢与调控
1、能荷是如何对微生物菌体细胞进行代谢调节的？
能荷（Energy charge）：[（ATP）+1/2（ADP）]/[（ATP）+（ADP）+（AMP）]
当生物体内生物合成或其它需能反应加强时，细胞内ATP分解生成ADP和AMP。

一旦ATP减少，ADP或AMP增加，即能荷降低，就会激活某些催化糖类分解的酶或解除ATP 对这些酶的抑制，并抑制糖原合成的酶，从而加速糖酵解，TCA循环产生的能量，通过氧化磷酸化作用生成ATP。

当能荷高时，即细胞内能量水平高时，AMP、ADP都转变成ATP，情况则相反。

2、根据D-核糖的生物合成途径及代谢调节机制，阐述D-核糖高产菌的育种思路。

调节机制：D-核糖发酵是切断HMP途径，使微生物改变酶系，积累阻断反应的前体物，进行代谢控制发酵的典型例子。

思路：要使微生物积累D-核糖，必须选育丧失转酮酶活力的突变株，由于缺少转酮酶，所以由转酮酶所催化的反应就会发生阻断，使D-核糖的前体物D-核糖-5-磷酸大量积累，再经酶的作用脱去磷酸便可合成D-核糖。

第七章脂类代谢与控制
1、简述脂肪酸分解与合成的根本性区别。

2、以γ-亚麻酸为例，试应用代谢调节控制理论论述γ-亚麻酸产生菌的育种思路。

根据上述育种思路，要选育γ-亚麻酸高产菌株，可以从以下几方面着手：
1）、出发菌株的选择：γ-亚麻酸产生菌多采用被孢霉（Mortierella）、毛霉（Mucor）、红酵母（Rhodotorula）、小克银汉霉（Cunninghamella）等产油脂较高的真菌作为出发菌株。

2）、切断或减弱支路代谢
3）、解除反馈调节
4）、强化能量代谢
5）、增加前体物的合成
6）、选育Δ6-脱氢酶活力强的突变株
7）、选育低温生长突变株
8）、选育耐高糖的突变株
9）、基因工程育种
第八章：氨基酸的代谢控制与发酵
1、简述黄色短杆菌赖氨酸生物合成的调节机制
2、简述赖氨酸生产菌的选育原则
赖氨酸的直接发酵法生产主要采用短杆菌属和棒杆菌属细菌的各种变异株。

与大肠杆菌相比，短杆菌属和棒杆菌的L-赖氨酸生物合成调节机制较为简单，适合作为出发菌株（如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌等）。

一般来说，L-赖氨酸产生菌由亚硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、紫外线（UV）等诱变选育而得。

第九章抗生素发酵的代谢与控制（无）
附加1：DNA的琼脂糖凝胶电泳技术（无）
附加2：质粒提取和电泳（无）。