微生物实验7 酵母菌

微生物实验报告

酵母菌的培养及观察实验

刘欣怡201100140057

生物科学基地班

组别：周一下午三组

同组者：曹平平，周楠，

刘艺，刘希伟

实验完成时间：2012年11月19号

一、实验目的

1、了解酵母菌的形态及出芽方式

2、学习区分酵母菌的死细胞和活细胞

3、掌握酵母菌子囊孢子的观察方法

4、巩固显微镜操作技术和无菌操作技术

二、实验器材

1．菌种：

酿酒酵母7d麦氏培琼脂（产孢培养基）斜面培养物，酿酒酵母2d YPD（酵母合成培养基）液体培养物。

2. 培养基：

酵母合成培养基，麦氏琼脂斜面

3、试剂：

0.01%美蓝水溶液，5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，蒸馏水、香柏油、去离子水等。

4. 仪器

试管，锥形瓶，酒精灯，显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，盖玻片，双层瓶，接种环，滴管，滤纸，镊子、培养皿等。

三、实验原理

1、培养基：

酵母菌的能源主要是糖，一般用麦芽汁琼脂培养基培养。但实验要求不是很严格时，可以用由酵母膏、蛋白胨、葡萄糖配置的培养基来培养；但酵母菌子囊孢子的观察要用麦氏培养基，其有利于子囊孢子的形成。

2、酵母菌：

酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。

3、酵母菌的形态、大小、结构：

酵母菌是单细胞真菌，并非系统演化分类的单元；

酵母菌细胞的形态通常为圆形、卵圆形或椭圆形。也有特殊形态，如柠檬形、三角形、藕节状、腊肠形，假菌丝等；

比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1-5微米×5-20微米；

酵母菌无鞭毛，不能游动；

酵母菌具有典型的真核细胞结构，有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。

4、美蓝染色液：

美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色，而还原型为无色。用它对酵母菌染色时，由于活细胞的新陈代谢作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。

5、水-碘液染色液：

该染液将革兰氏染液用碘液用水稀释4倍后得到的，亦可用于酵母形态和出芽生殖的观察。

6、子囊孢子的观察：

酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件。麦氏培养基有利于酿酒酵母子囊孢子的形成，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。

孢子染色原理：孢子壁厚不易着色，但是一旦着色就很难被脱色。因此先用强染色剂（孔雀绿）下染色，使染料进入菌体和孢子，水洗时菌体中染色被洗脱而孢子中染料保留。在用对比度大的复染色剂染色后，菌体染上复染色剂的颜色而孢子保留原来颜色，这样可将两者区别开来。

酵母菌子囊孢子的形成过程为：

两营养细胞各伸出一个小突起而相接触，使两个细胞结合起来，而后接触处的细胞溶解，经质配和核配后，形成双倍体核，原来的细胞形成合子。此双倍体细胞可以进行芽殖。在适宜条件下，合子减数分裂，双倍体核分裂成4-8个单倍体核，核外再围以原生质逐渐形成子囊孢子，子囊孢子包含在由母细胞壁演变而来的子囊(即原来的二倍体细胞)中。子囊孢子的形成与否及其数量和形状，是鉴定酵母菌的依据之一。

将酿酒酵母从营养丰富的培养基上移植到含有醋酸钠和葡萄糖(或棉籽糖)的产孢培养基上，于适温下培养，即可诱导其子囊孢子的形成。本实验即以酿酒酵母为材料观察酵母菌的子囊孢子。

7、酵母菌是少数能在缺氧环境里生存较长时间的一种微生物，它属于兼性菌类。在一般情况下进行有氧呼吸。如环境中有丰富的糖类，它进行缺氧呼吸。其过程如下：

（1）C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O+2.87×103兆焦（有氧呼吸）（ 2 ）.C6H12O6→2CO2+2C2H5OH+109×103兆焦（缺氧呼吸）

四、实验内容

用酵母合成培养基（液体状）培养酵母菌后，进行制片并用美兰染色，进行酵母菌出芽及细胞死活的观察；用麦氏培养基（固体斜面）培养酵母菌一周后，涂片制片，然后依次用孔雀绿、番红水进行染色并水洗，用油镜进行镜检，观察子囊孢子。

五、实验步骤

1、两种培养基的配置

分别配置100ml麦氏培养基和120ml酵母合成培养基，其成分配比详见附录。其中，麦氏培养基在将称量好的成分都加入后，放在加热器上加热至琼脂完全溶解，稍稍冷却，用漏斗胶管装置分别向十只试管中加入麦氏培养基各不超过10ml，加塞并用牛皮纸包扎好；对于120ml的酵母合成培养基，用两个300ml锥形瓶各盛60ml，称量好各自的成分后，分别加入两个瓶中，轻轻摇晃匀，加塞并用牛皮纸包扎好。

2、灭菌

将需要灭菌的培养基（装在锥形瓶或试管中）和培养皿放入高压灭菌锅中进

行灭菌。灭菌结束后，取出。

3、制备斜面培养基

将灭菌的试管的牛皮纸解开，将十只试管分开来，均垫在一个试管上，静置冷却凝固，便形成了斜面。

4、准备无菌操作台

打开无菌操作台的电源开关，开始通入无菌风，打开紫外线灯照射20分钟，期间，玻璃门紧闭。操作开始前，关闭紫外线灯。

5、接种酵母菌

在无菌操作台上，酒精灯旁无菌操作用灼烧好的接种环稍稍冷却，在酵母菌培养液中轻轻蘸几下，然后分别在十支斜面划线接种，

6、培养

将接种的十只试管重新用牛皮纸包扎好，放置于27℃下培养7d。将灭菌的两个各装有60ml酵母合成培养基的锥形瓶放置在摇床上。

7、美蓝浸片法观察死、活菌体及出芽

A。取液：先用滴管取一滴美兰染液滴在载玻片中央，再无菌操作从液体的酵母合成培养基中取菌。

B。盖片：用镊子取一块盖玻片，将其一端与菌液接触并倾斜相切，缓慢将盖玻片继续倾斜并覆盖在菌液上，避免有气泡产生。

C。镜检：制片成功后，即可放置在显微镜上观察，先低倍镜后高倍镜观察，但是40倍镜最适宜，观察酵母菌形态和出芽情况，而且根据细胞颜色区分死活细胞并大致判断死细胞和活细胞的比率；然后将制片放置5min，再进行观察，大致判断此时死细胞和活细胞的比率。

D。长时间放置观察：载玻片放置30min后再次进行观察，注意此时死活细胞比例的变化。

8、子囊孢子染色观察

A。制片：在干净的载玻片中央滴一滴蒸馏水，取在28℃培养7d斜面培养物，涂片，并干燥固定（可以稍稍加热固定，但是以温度不烫手背为原则）。

B。染色：在载玻片片上的有菌处滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖有菌部位。开始计算时间约1.5min-2min。