【CN109929800A】一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法【专利】
一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法及其应用[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811464169.7(22)申请日 2018.12.03(71)申请人 王岩松地址 150081 黑龙江省哈尔滨市保健路健康家园1号楼4单元701室(72)发明人 王岩松 梁敏 (51)Int.Cl.A61K 35/28(2015.01)A61P 19/10(2006.01)C12N 5/0775(2010.01)C12P 21/00(2006.01)(54)发明名称一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法及其应用(57)摘要一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法及其应用，所述提取方法包括：选取细胞活力较强的第三代人脐带间充质干细胞作为分泌因子来源，于培养瓶中培养第三代人脐带间充质干细胞；待细胞融合度达到80％以上时，吸去培养上清液，使用PBS液清洗两次，更换为无血清培养基；培养48小时后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，将上清液倒入90mm无菌培养皿中，放入冻干箱内预冻；当温度降至-40℃，培养液预冻完毕，抽真空使气压压强下降至100Pa以下，升高温度升至-36℃，开始冷冻干燥，持续约24h后收集冻干粉末，于-80℃保存。
权利要求书1页 说明书6页 附图5页CN 109602765 A 2019.04.12C N 109602765A1.一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤A，选取细胞活力较强的第三代人脐带间充质干细胞作为分泌因子来源，为了大量获得分泌因子，于75cm 2培养瓶中培养第三代人脐带间充质干细胞；步骤B，待细胞融合度达到80％以上时，吸去培养上清液，使用PBS液清洗两次，更换为无血清培养基；步骤C，培养48小时后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，将上清液倒入90mm无菌培养皿中，放入冻干箱内预冻；步骤D，当温度降至-40℃，培养液预冻完毕，抽真空使气压压强下降至100Pa以下，升高温度升至-36℃，开始冷冻干燥；步骤E，持续约24h后收集冻干粉末，于-80℃保存。
一种高效提取干细胞因子的方法[发明专利]
![一种高效提取干细胞因子的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3ce58d4c5bcfa1c7aa00b52acfc789eb172d9e8e.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810903864.2(22)申请日 2018.08.09(71)申请人 苏州迈斯特细胞生物技术有限公司地址 215000 江苏省苏州市常熟市常熟经济开发区研究院路3号(72)发明人 高飞 (51)Int.Cl.C07K 14/475(2006.01)C12N 5/074(2010.01)(54)发明名称一种高效提取干细胞因子的方法(57)摘要本发明涉及到一种细胞提取方法，尤其涉及到一种高效提取干细胞因子的方法。
该高效提取干细胞因子的方法使用1毫米长枪头将人工诱导多能性干细胞吸入接着吹出，反复吹吸后，在显微镜下观察，取大小合适的人工诱导多能性干细胞块，转移到预先准备好的含有基底细胞的培养皿中，完成人工诱导多能性干细胞的分割，可以进行传代。
高效提取干细胞因子的方法，需要的细胞培养基较少，能大大降低细胞传代过程中的成本；通过1毫米长枪头的吸吹气对人工诱导多能性干细胞，大大降低了，人工诱导多能性干细胞分割过程的难度，提高了提取干细胞因子的效率。
权利要求书1页 说明书3页CN 110818788 A 2020.02.21C N 110818788A1.一种高效提取干细胞因子的方法，其特征在于其步骤为：（1）、将人工诱导多能性干细胞放置在直经为8.55厘米的细胞培养皿内培养，使得人工诱导多能性干细胞覆盖掉细胞培养皿底面积的85%；（2）、将步骤（1）所述细胞培养皿中的培养基吸出，使用1-3毫升磷酸盐缓冲液（PBS ）对细胞培养皿进行清洗，然后将磷酸盐缓冲液吸出；（3）、向细胞培养皿中加入0.5-1毫升细胞分裂素（CTK）后摇均匀，常温下静止30-120秒，在此期间，至少拍打细胞培养皿一次；（4）、在显微镜下观察，待基底细胞剥离后，加入3毫升PBS进行清洗，然后将PBS吸出，重复上述加入PBS操作4次，在显微镜下观察，确保细胞剥离液完全被洗净，然后将PBS彻底吸出；（5）、向细胞培养皿中加入人工诱导多能性干细胞培养液2毫升，然后用细胞刷将人工诱导多能性干细胞刷离培养皿；（6）、使用1毫米长枪头将步骤（5）中制备出的人工诱导多能性干细胞吸入接着吹出，反复吹吸6次，在显微镜下观察，将大小在65微米内的人工诱导多能性干细胞块即完成了高效提取干细胞因子。
用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法[发明专利]
![用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/9b1794c5e2bd960591c677e1.png)
专利名称：用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法专利类型：发明专利
发明人：欧来良,李文忠
申请号：CN200910067634.8
申请日：20090107
公开号：CN101461772A
公开日：
20090624
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种可用于美容、护肤的干细胞分泌因子的制备方法。
包括细胞分离、干细胞的扩增、干细胞因子体系的获取和浓缩、贮存得到含有干细胞活性因子体系。
该体系包括目前已鉴定的各型干细胞所分泌的活性因子。
本发明所得的干细胞活性因子体系中不含外来的培养液成分，也不含有死细胞裂解成分。
并可以长期保存而维持组织和细胞修复活性。
使干细胞美容真正从理想走向了现实。
在生物医学的深度对传统美学观念进行了提升。
同时该发明简单易行，适宜于大规模生产，为干细胞服务于美丽事业提供了一条捷径。
申请人：天津欧瑞生物科技有限公司
地址：300192 天津市南开区华苑产业区物华道2号海泰火炬创业园B座5F080室
国籍：CN
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一种干细胞分离纯化方法[发明专利]
![一种干细胞分离纯化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/4b7040c80066f5335b81218a.png)
专利名称：一种干细胞分离纯化方法专利类型：发明专利
发明人：陈方,张胜利,周君梅
申请号：CN200910197877.3
申请日：20091029
公开号：CN101818126A
公开日：
20100901
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种干细胞分离纯化方法。
本发明提供了一种干细胞分离纯化方法，包括下列步骤：干细胞培养：将干细胞细胞悬液或含有干细胞的细胞悬液接种于培养容器中，加入培养液培养至出现干细胞克隆团；干细胞分离纯化：弃去培养液，加入平衡盐溶液洗去残余培养液，弃平衡盐溶液；加入平衡盐溶液，放置克隆杯圈住干细胞克隆团，一个克隆杯圈住单个干细胞克隆团；弃杯内的平衡盐溶液，加入酶液，将干细胞克隆团消化成细胞悬液；将杯内细胞悬液移植于新的培养容器里，加入培养液继续培养；其中所述克隆杯为一个两端开口、中空柱状物，其内径大小能够圈住干细胞克隆团。
本方法操作简捷，分离细胞纯度高，具有较高的经济效益。
申请人：上海市儿童医院
地址：200040 上海市静安区北京西路1400弄24号
国籍：CN
代理机构：上海天翔知识产权代理有限公司
代理人：王裕
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一种干细胞外分泌体的提纯浓缩制备方法[发明专利]
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专利名称：一种干细胞外分泌体的提纯浓缩制备方法专利类型：发明专利
发明人：朱瑜
申请号：CN201910469805.3
申请日：20190531
公开号：CN112011498A
公开日：
20201201
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种干细胞外分泌体的提纯浓缩制备方法，包括如下步骤：S1、快速地将细胞培养液用0.22μm的过滤筛过滤，分离完整地细胞和残渣，并用离心机以10000‑11500g的速度超速离心2小时；S2、用1mL常温的磷酸缓冲盐溶液重新悬浮和清洗小囊泡，再次用离心机以
10000‑11500g的速度超速离心2小时；S3、用100μL常温的磷酸缓冲盐溶液重新悬浮后转移到低粘附的管中，得到高浓度外分泌体，细胞培养液是来自无菌的80％‑90％的培植细胞。
本发明通过多次超速离心对外分泌体进行纯化，操作简单，获得的囊泡数量较多，不影响外分泌体的生物活性，可获得高纯度和高回收率的外分泌体，解决了现有技术提取过程中影响外分泌体的生物活性，且提取浓度低的问题。
申请人：广州北斗生物科技有限公司
地址：510700 广东省广州市黄埔区瑞和路39号G1座224至226、G2座224至226号
国籍：CN
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一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法[发明专利]
![一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/71ec822a2379168884868762caaedd3383c4b538.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911397431.5(22)申请日 2019.12.30(71)申请人 贵州泛特尔细胞生物技术有限公司地址 550000 贵州省贵阳市观山湖区金阳科技产业园(72)发明人 边曙光 张凤宁 汪国云 曾智芃 明凯 (74)专利代理机构 重庆强大凯创专利代理事务所(普通合伙) 50217代理人 刘永来(51)Int.Cl.C12N 5/0775(2010.01)(54)发明名称一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法(57)摘要本发明属于生物医药领域，涉及一种获取细胞分泌蛋白的方法，具体涉及一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法。
本法从脂肪组织中分离得到脂肪干细胞，对脂肪干细胞进行原代和传代培养，然后再对脂肪干细胞进行饥饿培养，从而获得了大量的脂肪干细胞分泌蛋白。
获得的分泌蛋白具有较高的生物活性，可以应用于对细胞损伤修复的微环境建立，化妆品，抗衰老，疾病治疗等诸多领域，具有广阔的应用前景。
权利要求书1页 说明书8页CN 110982785 A 2020.04.10C N 110982785A1.一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：获取脂肪干细胞；从脂肪组织中获取基质血管成分，并从基质血管成分中分离得到原代脂肪干细胞，对原代脂肪干细胞进行一次继代培养，获得脂肪干细胞；S2：脂肪干细胞预培养：将S1中获得的脂肪干细胞接种在无酚红完全培养基中，对脂肪干细胞进行预培养，获得活化脂肪干细胞；S3：脂肪干细胞饥饿培养：移除活化脂肪干细胞的无酚红完全培养基，并用生理盐水洗涤活化脂肪干细胞，然后使用复方电解质注射液对活化脂肪干细胞进行饥饿培养；饥饿培养结束后收集上清液Ⅰ。
2.根据权利要求1所述的一种获取脂肪干细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，在S1中，从脂肪组织中获取基质血管成分的方法如下：将脂肪组织清洗和剪碎，然后在脂肪组织中加入酶溶液，对脂肪组织进行酶解消化处理；酶解消化处理后用脂肪干细胞培养基终止酶解消化，脂肪干细胞培养基的体积为酶溶液的体积的5-10倍；再使用100μm细胞滤网过滤，获得基质血管成分。
一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011060053.4(22)申请日 2020.09.30(71)申请人 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司地址 100176 北京市大兴区北京经济技术开发区中和街14号(72)发明人 赵成 安文强 董白翔 (74)专利代理机构 山东舜天律师事务所 37226代理人 李新海(51)Int.Cl.C12N 5/0775(2010.01)C07K 14/52(2006.01)C07K 1/14(2006.01)(54)发明名称一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法(57)摘要本发明公开了一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法：取采集的脂肪样本，用生理盐水洗涤1～3次；加入适量脂肪细胞消化液进行消化；离心，重悬细胞沉淀，用无血清培养基原代培养；传代培养；扩大培养；用旁分泌因子提取液提取，纯化，得旁分泌因子；所述旁分泌因子提取液，是由PBS缓冲液、L ‑谷氨酰胺、D ‑葡萄糖和L ‑抗坏血酸组成的，L ‑谷氨酰胺、D ‑葡萄糖和L ‑抗坏血酸的浓度分别为：1～3mmol/L，10～20μmol/L，10～100μmol/L。
本发的方法可从脂肪组织中稳定的提取脂肪干细胞，并利用脂肪干细胞提取脂肪干细胞旁分泌因子，细胞质量和因子提取效率稳定，脂肪干细胞在GMP环境下分离并长期培养，不接触任何动物源性成分，可高效表达表达CD29、CD44、CD105等脂肪干细胞标志物。
权利要求书2页 说明书9页 附图5页CN 112080465 A 2020.12.15C N 112080465A1.一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：取采集的脂肪样本，用生理盐水洗涤1～3次；向洗涤后的脂肪组织中加入适量脂肪细胞消化液进行消化；消化后，离心，重悬细胞沉淀，用无血清培养基原代培养；传代培养；扩大培养；用旁分泌因子提取液提取，纯化，得旁分泌因子；所述旁分泌因子提取液，是由PBS缓冲液、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸组成的，其中，L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸的浓度分别为：1～3mmol/L，10～20μmol/L，10～100μmol/L。
基于干细胞分泌因子的培养基及其制备和使用方法[发明专利]
![基于干细胞分泌因子的培养基及其制备和使用方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/6efd9fe97cd184254a3535d4.png)
专利名称：基于干细胞分泌因子的培养基及其制备和使用方法专利类型：发明专利
发明人：武晓云,康会彦,刘学敏,吕岩,王云虹,王黎明,刘洁,高锦
申请号：CN201310114088.5
申请日：20130403
公开号：CN104099294A
公开日：
20141015
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种基于干细胞分泌生物活性因子培养基及其制备和使用方法。
其制备过程为：收集干细胞培养扩增过程中更换的废弃培养液；将其进行冻融、低温分离、超滤和浓缩，得到富含丰富生物活性因子的溶液；测定浓缩物所含的蛋白浓度，按照一定的比例添加到基础培养基中。
通过该方法制备的培养基可用于各种间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞、人正常肝细胞等细胞的培养。
申请人：北京京蒙高科干细胞技术有限公司
地址：100085 北京市海淀区上地东路5-2号京蒙高科大厦B座601
国籍：CN
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一种用于抗衰老的干细胞分泌素及其制备方法和应用[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710639267.9(22)申请日 2017.07.31(71)申请人 深圳中旭细胞再生医学研究有限公司地址 518109 广东省深圳市龙华区龙华街道清祥路1号宝能科技园9栋C座3楼M房(72)发明人 张锦芳 卓成柳 吴中泽 (51)Int.Cl.C12P 21/00(2006.01)C12N 5/0775(2010.01)A61K 35/28(2015.01)A61P 39/06(2006.01)(54)发明名称一种用于抗衰老的干细胞分泌素及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种用于抗衰老的干细胞分泌素及其制备方法和应用，制备时，采集间充质干细胞，培养2-5天，收集培养细胞，经PBS缓冲液洗涤后，加入水裂解得到裂解液；再将裂解液低温离心，收集上清液，加入上清液质量1-2％的人血白蛋白即得干细胞分泌素。
间充质干细胞包括骨髓、脐带、胎盘与脂肪。
本发明制得的干细胞分泌素能够具有抗衰老的效果，该干细胞分泌素来源于骨髓间充质干细胞。
本发明证明该分泌素，与未处理的相比，能延缓人的成体MSCs的衰老，所以有潜在延缓衰老的潜能。
本发明药物的使用方式可以是静脉注射或局部使用。
权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 107446974 A 2017.12.08C N 107446974A1.一种用于抗衰老的干细胞分泌素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采集间充质干细胞，培养2-5天，收集培养细胞，经PBS缓冲液洗涤后，加入水裂解得到裂解液；再将裂解液低温离心，收集上清液，加入上清液质量1-2％的人血白蛋白即得干细胞分泌素。
2.根据权利要求1所述的用于抗衰老的干细胞分泌素的制备方法，其特征在于，间充质干细胞培养前还包括经流式细胞仪鉴定步骤。
3.根据权利要求1所述的用于抗衰老的干细胞分泌素的制备方法，其特征在于，将裂解液经1-5℃、10000-14000r/min低温离心20-40min。
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910177635.1
(22)申请日 2019.03.09
(71)申请人 和携科技（北京）有限公司
地址 100176 北京市大兴区北京经济技术
开发区科创六街88号院6号楼1单元
502室
(72)发明人 赵进军 谷广其 杨桂花 赵宇飞
李张鹏
(51)Int.Cl.
C12N 5/0775(2010.01)
C12P 21/02(2006.01)
A01N 1/02(2006.01)
(54)发明名称
一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法
(57)摘要
本发明涉及一种干细胞分泌因子的获取与
纯化方法，其特征在于，包括脐带组织块的获取
步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培
养步骤和干细胞分泌因子的获取与纯化步骤；所
述干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P e
代人源脐带间充质干细胞达80-90%时，轻轻倾倒
培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗
液，加入无血清培养基，放置于37℃体积分数为
5%的CO 2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um
的过滤器过滤，得干细胞分泌因子。
本发明制得
的干细胞分泌因子与人原代真皮成纤维细胞共
培养，刺激培养人原代真皮成纤维细胞，从而使
人原代真皮成纤维细胞对Ⅰ型胶原纤维的表达增
加，
有助于皮肤创面伤口的修复。
权利要求书2页 说明书7页CN 109929800 A 2019.06.25
C N 109929800
A
权 利 要 求 书1/2页CN 109929800 A
1.一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞分泌因子的获取与纯化步骤；所述干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P e代人源脐带间充质干细胞达80-90%时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入无血清培养基，放置于37℃体积分数为5%的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得干细胞分泌因子；其中，e=3、4、5、6、7、8、9、10。
2.根据权利要求1所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。
3.根据权利要求1所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液。
4.根据权利要求1所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述干细胞的传代培养步骤包括待P n代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P n代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得P n代人源脐带间充质干细胞悬液，将P n代人源脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得P n+1代人源脐带间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，还包括干细胞的冻存步骤和干细胞的复苏与培养步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待P m代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P m代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将P m代人源脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。
6.根据权利要求5所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
7.根据权利要求5所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的P m代人源脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待P m代人源脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在无血清培养基中重悬得P m代人源脐带间充质干细胞悬液，将P m代人源脐带间
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