【CN109929800A】一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910177635.1

(22)申请日 2019.03.09

(71)申请人 和携科技（北京）有限公司

地址 100176 北京市大兴区北京经济技术

开发区科创六街88号院6号楼1单元

502室

(72)发明人 赵进军　谷广其　杨桂花　赵宇飞　

李张鹏　

(51)Int.Cl.

C12N 5/0775(2010.01)

C12P 21/02(2006.01)

A01N 1/02(2006.01)

(54)发明名称

一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法

(57)摘要

本发明涉及一种干细胞分泌因子的获取与

纯化方法，其特征在于，包括脐带组织块的获取

步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培

养步骤和干细胞分泌因子的获取与纯化步骤；所

述干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P e

代人源脐带间充质干细胞达80-90%时，轻轻倾倒

培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗

液，加入无血清培养基，放置于37℃体积分数为

5%的CO 2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um

的过滤器过滤，得干细胞分泌因子。本发明制得

的干细胞分泌因子与人原代真皮成纤维细胞共

培养，刺激培养人原代真皮成纤维细胞，从而使

人原代真皮成纤维细胞对Ⅰ型胶原纤维的表达增

加，

有助于皮肤创面伤口的修复。权利要求书2页 说明书7页CN 109929800 A 2019.06.25

C N 109929800

A

权　利　要　求　书1/2页CN 109929800 A

1.一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞分泌因子的获取与纯化步骤；所述干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P e代人源脐带间充质干细胞达80-90%时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入无血清培养基，放置于37℃体积分数为5%的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得干细胞分泌因子；其中，e=3、4、5、6、7、8、9、10。

2.根据权利要求1所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。

3.根据权利要求1所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液。

4.根据权利要求1所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述干细胞的传代培养步骤包括待P n代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P n代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得P n代人源脐带间充质干细胞悬液，将P n代人源脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得P n+1代人源脐带间充质干细胞。

5.根据权利要求1所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，还包括干细胞的冻存步骤和干细胞的复苏与培养步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待P m代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P m代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将P m代人源脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。

6.根据权利要求5所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。

7.根据权利要求5所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的P m代人源脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待P m代人源脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在无血清培养基中重悬得P m代人源脐带间充质干细胞悬液，将P m代人源脐带间

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