基因工程方法用于抗生素增产的研究进展

基因工程方法用于抗生素增产的研究进展

摘要：本文结合国内外文献，综述了应用基因工程方法获得抗生素高产菌株，增加抗生素产量的理论方法和研究动向，总结了该领域的研究成果和研究进展。分别从广义基因工程范畴下的4种技术——改造代谢途径、改造抗生素生物合成基因簇、核糖体改造技术和原生质体融合技术具体阐述，并展望基因工程方法获得抗生素高产菌株的前景。

关键词：基因工程；抗生素；产量

野生型菌株产生的抗生素只能满足自身需求，难以用于工业化生产，无法满足市场需求，需要通过各种育种手段获得高产菌株，优化工程菌的性状。国内许多自主开发的新型抗生素仍停留在实验室或是小规模生产阶段，其中一个关键的原因就是新型抗生素的产量没能提高到工业化水平。21世纪是基因的时代，基因工程的手段已经成为时代的潮流，现已渗入到抗生素生产中，为解决微生物制药所面临的许多重大问题开辟了新途径。欧美很多生产商采用基因工程技术提高了抗生素的生产效率，对我国抗生素产业带来了不小的冲击。本文分别从改造代谢途径、改造抗生素生物合成基因簇、核糖体改造技术和原生质体融合技术讨论改造原始生产菌株，获得高产菌株的手段和研究进展。

1改造代谢途径

以基因工程为基础的代谢工程研究了各种抗生素产生菌的代谢途径，为定向改造菌株提供了丰富的理论基础和实践指导。现阶段对微生物生化途径、遗传特征和生物合成调节机制分析较为透彻，很多研究确定了微生物中抗生素生物合成基因在代谢中的功能，揭示了影响抗生素产量的其他代谢产物生物合成基因。通过定向突变的方法，可下调干扰目的抗生素产量的基因表达，改变菌株代谢情况，使目的抗生素富集增产。表1总结了近年来利用改造代谢途径增加抗生素产量的报道。

改造脂肪酸代谢合成途径依赖培养基的选择，因为脂代谢中酶的作用与培养基的种类密切相关。比如改造后红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)培养基的选择对其产物红霉素的产量影响很大。敲除红色糖多孢菌甲基丙二酰辅酶A变位酶基因mutB，在碳水化合物培养基中红霉素的产量提高到126%，在油性培养基中产量反而下降了66%[1]。

2改造抗生素生物合成基因簇

微生物控制次级代谢产物合成和调节的基因通常成簇存在于染色体上，称为生物合成基因簇。随着分子生物学的发展，β-内酰胺类抗生素、多聚酮类抗生素等和其变种的生物合成基因簇均已比较清楚。如纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)存在长92kb的Chivosazol生物合成基因簇[2]，它包含4个聚酮合成酶(PKS)基因和调控基因。利用生物合成基因簇序列和功能的理论基础，实现了人工改造生物合成基因簇的预想，达到增加基因簇表达的目的。改造抗生素生物合成基因簇具体的手段有改造调控基因、改造自身抗性基因、增加基因簇的拷贝数和异源表达等。但现在发现生物合成基因簇的抗生素数量有限，限制了该技术的发展推广。

2.1改造抗生素生物合成基因簇中调控基因

生物合成基因簇携带编码调控因子的调控基因。调控因子是一类在转录水平调节基因表达的蛋白质，它们能特异性地结合到该基因簇中的核酸调控元件，激活或阻碍抗生素结构基因的转录成mRNA。过量表达编码激动子基因和失活编码阻遏子的基因，是增加抗生素的产量最为直观的方法。

不同生物合成基因簇的调控基因同源性可能很高，如链霉菌(Streptomyces sp.)中DS M4137菌株中尼日利亚菌素的调控基因nigR，与莫能菌素的调控基因monR1的同源性达73%，与南昌菌素的调控基因nanR2的同源性也达70%[3]。建立了改造某个调控基因的方法后，可以利用调控基因的同源性，将该方法扩展到其他菌种中，扩大此法的适应范围。

最典型的激动子家族是链霉素调控蛋白家族(SARP)。SARP是N-端为翼性的螺旋-转角-螺旋结构的多效蛋白，可以向上调控某些次级代谢途径和形态分化[4]。过量表达SARP能增加抗生素的产生量。有众多研究分别利用上调SARP表达提高了克拉维酸[5]、放线菌紫素[6]、柔红霉素[6]、Novclobiocin122[7]、苦霉素[8]、泰乐菌素[9]、尼柯霉素X[10]和制霉菌素[11]的产量。表2总结了利用改造调控基因增加抗生素产量的研究进展。

2.2过表达自身抗性基因

抗生素生物合成基因簇内有一个或多个基因负责编码修饰抗生素靶点的酶系统，包括抗生素失活酶和转运酶等，使菌产生抗生素抗性，称为自身抗性基因(self-defense gene)。该抗性基因能够提高对自身抗性，保护自身免受产物的毒性作用。过表达自身抗性基因，能促进抗生素合成，比如过表达卡那霉素链霉菌(S.kanamyceticus)中编码氨基糖苷6'-N-乙酰转移酶的自身抗性基因，提高产生菌对氨基糖苷类的抗性，能达到增产氨基糖苷类抗生素的目的[4]。Y anai等[12]在卡那霉素链霉菌中复制整个卡那霉素基因簇，其中包含3个自身抗性基因，可使卡那霉素增产3.5倍。

2.3增加整个生物合成基因簇的拷贝数

生物合成基因簇及其合成机制有很高的相似性，利用基因工程技术人为插入抗生素生物合成基因，或增加限速酶基因的拷贝数，可提高抗生素的产量。Hung等[5]将克拉维酸链霉菌(S.clavuligerus)中cas2基因整合进染色体，增加cas2拷贝数，从而使克拉维酸增产1.6~5倍。

2.4异源表达

某些天然菌株，比如蓝细菌黏细菌和海洋微生物，能产生有价值的抗生素。但这些天然菌株生长缓慢，不适合工业化大规模培养和生产。为了开发天然菌株资源，可利用基因工程手段，将它们的抗生素的生物

合成基因克隆到适合的工程菌中，在异源菌表达目的产物，达到增产目的。异源表达另一优势是可基因修饰，表达人工设计新合成途径优化工程菌，以增加表达量。

2.4.1用同源的菌株异源表达

据报道[13]，稀有放线菌生产的抗生素可以用放线菌属异源表达，用变铅青链霉菌(S.lividans)或天蓝色链霉菌(S.coelicolor)表达。因为同源菌株亲缘关系很近，链霉菌中启动子和调控元件在宿主菌中同样有效，不用克隆原始的启动子和调控元件，减小了克隆片段长度。

通常将抗生素生物合成基因簇里的II型PKS合成系统克隆到黏粒或BAC上，再转化重组载体至亲缘相近的宿主菌中表达。有人将玫瑰孢链霉菌(S.roseosporus)中达托霉素整个生物合成基因簇利用BAC在外源表达，并将oriT和int FC31位点特异型整合到链霉菌染色体上[13]。Eustáquio等[14]在S.coelicolor M512中表达天蓝色链霉菌的全部新生霉素合成基因簇并引入调控基因novG，新生霉素产量提高300%。天蓝色链霉菌中的曼得尔霉素，变铅青链霉菌中的灰紫红菌素A(griseorhodin A)、aloesaponarin II、PD 116740、tetrangulol和四角霉素(tetrangomycin)以及BSM1和BSM3，醌那霉素(kinamycin)的前体物[13]均可采用该方法提高产量。

2.4.2利用逐步法在不同源的菌株中异源表达

当抗生素的生物合成基因簇的片段太大，用黏粒和BAC都不能携带它进入宿主菌中，可考虑用多个质粒分别携带生物合成基因簇的某一部分，再转化到同一个工程菌中表达。所有基因可连接上人工启动子和调控元件，可以实现在不同源的菌株中异源表达。通常用大肠埃希菌异源表达，可以减少发酵时间，设计最佳的密码子异源表达抗生素合成基因簇[15]。

Watanabe等[11]在大肠埃希菌表达拉沙里链霉菌(saliensis)中氯霉素全部合成基因簇,并用非核糖体肽合成酶进行翻译后修饰，氯霉素产量提高明显。V olchegursky等[16]将M.megalomicea中巨大霉素的合成基因簇导入糖多孢红霉菌中异源表达，巨大霉素产量提高340%。

2.4.3利用Red/ET技术在不同源的菌株中异源表达

上述“逐步法”可行，但引入了多个质粒，每个质粒都需要连接反应和转化操作，过程繁琐。现开发出一种较为简便的方法：用多个相同载体分别携带抗生素生物合成基因簇其中的一部分，利用噬菌体同源重组系统的Red/ET技术重新拼装，再导入到宿主菌内表达。该技术可简单、快速地对任意大的DNA分子进行各种修饰，并且整个过程都是在大肠埃希菌细胞内部完成。Rodrìguez等[17]通过attB-attP位点特异性重组，在糖多孢红霉菌(Sac.erythraea)的菌株K41-135中表达红霉素气微菌(Aeromicrobiumerythreum)的红霉素全部合成基因簇，并修饰PKSs，使红霉素产量提高明显。

3核糖体改造工程

链霉素等抗生素的靶点为核糖体组分，当抗生素生物合成基因簇发生突变，会编码某些突变的核糖体蛋白，抗生素无法作用于突变的核糖体蛋白或rRNA，使该菌种能够对外界抗生素等表现抗性，促进抗生