酵母单杂交系统
酵母杂交系统
BD和 AD 可以人为的分离,分离的DNABD和AD单独分别作用,并不能激活转录反应, 但当两者在空间上较为接近时, 则呈现完整的 转录因子的转录激活活性,将DNA-BD序列与 一已知的蛋白质X(常成为诱饵)的基因结合, 构建出 BD-X 融合表达载体, 将AD 序列与拟 研究的另蛋白Y-靶蛋白( prey) 的基因结合, 构 建出AD-Y表达载体。
六.酵母杂交系统的应用 酵母杂交系统的应用
The end thank you
酵母单杂交( yeast one) 系统是体外分析 DNA 与细胞内蛋白质相互作用的一种方法, 通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析, 来鉴别DNA 结合位点并发现潜在的结合蛋白 基因,或对DNA 结合位点进行分析。 运用此技术, 能筛选到与需复杂的蛋白质分离纯 化操作,故在蛋白研究中,具有一定的优势。
三.酵母三杂交系统
三杂交系统是 SenGupta等发展起来的,与双杂 交系统相似, 只是 2个杂交蛋白需通过第三个分子介 导。三杂交必须满足: 2个蛋白无直接作用,必须通过 第三个成分才能激活转录, 第三个分子具有2个蛋白 的位点。 许多细胞内信号传递过程中, 两蛋白间互相作 用涉及第三个分子。而这第三种分子可以是蛋白质, 小分子多肽和核酸。因此,此方法的发明大大扩展了 酵母双杂交系统的应用范围。
酵母杂交系统
广西民族大学：甘光华
一、酵母单杂系统
酵母单杂交手册(translated by mony)
酵母单杂交手册目录1简介2试剂盒包含的内容3缩写4 Y1H Gold 酵母菌株的相关信息5附加材料&酵母培养基A cDNA扩增、文库构建和筛选所需的附加材料B 相应的培养基要求6诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建A方法：合成、克隆p目的基因-AbAi质粒B方法：构建诱饵-受体酵母菌株7利用AbA r的表达检测诱饵菌株A方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度8 cDNA文库的构建A方法：利用SMART技术合成cDNA第一链B方法：利用Long Distance PCR (LD-PCR)扩增cDNA第一链C方法：利用CHROMA SPIN+TE-400 Columns技术纯化合成的双链DNA9单杂交的文库的构建和筛选A方法：单杂交cDNA的文库的构建和筛选10结果分析11阳性克隆检验和猎物（prey）质粒分离A方法：通过划板确认受体表型B方法：酵母菌落PCR以消除Duplicate Clones（假阳性克隆？多拷贝？）C分离和纯化文库中可靠的具有受体活性的质粒D方法：区分阳性克隆和假阳性克隆E分析阳性克隆的序列12问题排除指南13参考文献附录A：质粒信息附录B：酵母生长培养基的配置及所需营养物附录C：SMART技术原理图1 利用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选蛋白-DNA的相互作用图2 将相应的片段整合到Y1HGold菌株，构建诱饵受体菌株图3 利用SMART技术和酵母的特点构建和筛选你的文库图4 通过菌落PCR确认pBait-AbAi构建成功图5 利用SMART技术合成cDNA第一链并因此合成相应的粘性末端能够整合到pGADT7-Rec 图6 利用SMART技术进行扩增图7 利用CHROMA SPIN+TE-400技术并收集产物图8 说明受体基因表达阳性克隆和假阳性克隆之间的活性差异图9 通过共转化选择性培养基验证相互作用图10 pAbAi载体和做对照的p53-AbAi载体图谱图11 pGADT7-Rec载体图谱图12 pGADT7载体图谱表格表1 Y1HGold酵母菌株基因型表2 利用各种SD培养基验证Y1HGold酵母菌株的表型表3 AbA r本底表达的预期结果表4 RNA总量与最佳循环数直接的关系表5 Matchmaker Gold One-Hybrid问题排除指南表6 Set 1酵母培养基和Set 1 Plus酵母培养基的组分表7 Matchmaker Gold Protocols所包含的每一个内容A介绍Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System为建立酵母单杂交cDNA文库的建立提供了一个简单高效的方法。
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母单杂交[精华]
![酵母单杂交[精华]](https://img.taocdn.com/s3/m/baca7b99cd22bcd126fff705cc17552707225e67.png)
1.酵母单杂交的基本原理酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。
用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。
在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。
据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。
酵母单杂交原理示意图2.酵母单杂交技术的特点酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来，在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。
应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。
近来，已有应用酵母单杂交体系进行疾病诊断的研究报道。
随着酵母单杂交体系的不断发展和完善，它在科研、医疗等方面的应用将会越来越广泛。
采用酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中，识别与DNA特异结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列，而无需分离纯化蛋白，实验简单易行。
由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性。
目前，多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化，为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。
酵母单杂交系统在植物抗渗透胁迫转录因子研究中的应用
录激活功能等分析。
Ｆ ｉ ｇ １ Ｔ ｈ ｅ ｏ ｒ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ｂ ａ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｙ ｅ ａ ｓ ｔ ｏ ｎ ｅｈ ｙ ｂ ｒ ｉ ｄｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ
ｂ ｉ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇＤ ｏ ｍ ａ ｉ ｎ ， Ｂ Ｄ ） 和一个或多个调控蛋白相互作用 ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｄ ｏ ｍ ａ ｉ ｎ ， Ａ Ｄ ） 组成。用于酵母 的激活功能域（ 单杂交系统的酵母 Ｇ Ａ Ｌ ４蛋白是一种典型的转录因子， Ｇ Ａ Ｌ ４的 Ｄ Ｎ Ａ结合结构域（ Ｂ Ｄ ） 可激活酵母半乳糖苷 酶的上游激活位点 （ ｕ ｐ ｓ ｔ ｒ ｅ ａ ｍａ ｃ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｕ Ａ Ｓ ） ， 而转录激活结构域可提高 Ｒ Ｎ Ａ聚合酶的活性。 Ｄ Ｎ Ａ Ｂ Ｄ和 Ａ Ｄ对激活转录是必不可少的。理论上， 任 ? 何一个 Ａ Ｄ都可以与任何一个 Ｄ Ｎ Ａ Ｂ Ｄ结合并激活转 ? Ｎ Ａ Ｂ Ｄ和 Ａ Ｄ可以组成一个具有功能的 录， 即杂合的 Ｄ ? 转录激活蛋白。不仅如此， 只要 Ｄ Ｎ Ａ Ｂ Ｄ和 Ａ Ｄ能够通 ? 过一定的方式在空间上足够地靠近（ 例如借助其他蛋 白质的相互结合使其足够靠近） ， 那么即使它们之间没 有共价结合也可以激活转录。因此， 在酵母中表达的 两个相互作用的蛋白质分别与转录因子的 Ｄ Ｎ Ａ结合 Ｂ Ｄ ） 和转录激活结构域（ Ａ Ｄ ） 相融合， 形成两 结构域（ 个杂交体， 即Ｂ Ｄ Ｘ和 Ａ Ｄ Ｙ （ 图１ ， Ａ ， Ｂ ） 。单独的 Ｂ Ｄ ? ? ? Ｘ或 Ａ Ｄ Ｙ都不能启动下游报告基因的转录（ 图１ ， Ａ ， ? Ｂ ） ， 但Ｂ Ｄ Ｘ与 Ａ Ｄ Ｙ的相互作用可以在空间上拉近 ? ? Ｄ Ｎ Ａ Ｂ Ｄ和 Ａ Ｄ的距离， 从而重新形成有功能的转录因 ? 子， 激活启动子下游报告基因的表达（ 图１ ， Ｃ ） 。据此， 我们可将 Ｇ Ａ 的基因相互作用， 同 样可通过转录激活结构域激活 Ｒ Ｎ Ａ聚合酶， 启动下游 报告基因（ 通常使用 Ｌ ａ ｃ Ｚ ） 的转录
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上图显示了酵母三杂交系统的原理。在酵母三杂交 •系统，lexA启动子调控下游LacZ基因和His3基因 的表达，而lexA启动子的激活取决于DNA结合结构 域和转录激活结构域能否在空间上相互靠近。
其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为 能结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为 噬菌体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分 组成，一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构 域，另一部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
•
当从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-
LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，
并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因
在生物学功能上的联系。
•
另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基
化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白 是否有相互作用。
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这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生 GAL4，又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP，因 此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。 当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时， 功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的 报告基因ADE、 HIS、LACZ、MEL1，从而通过功 能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的 酵母菌株中的AD-LIBRAR能相关的主要方法。
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2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是 利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相 互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质 与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应 则可以通过酵母双杂交进行检测。
酵母单杂交技术
酵母单杂交技术1．酵母单杂交的基本原理酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA 结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。
用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。
在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。
据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。
酵母单杂交原理示意图2．酵母单杂交技术的特点酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来，在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。
应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。
近来，已有应用酵母单杂交体系进行疾病诊断的研究报道。
随着酵母单杂交体系的不断发展和完善，它在科研、医疗等方面的应用将会越来越广泛。
采用酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中，识别与DNA特异结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列，而无需分离纯化蛋白，实验简单易行。
由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性。
目前，多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化，为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。
酵母单杂交
酵母单杂交(yeast one hybrid)技术，是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析。
运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果，比其他体外技术获得的结果，更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。
1 酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术，最早是1993年由Li et al 从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。
目前认为真核生物的转录起始，需要转录因子的参与。
这些转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和转录激活结构域(activation domain, AD)。
用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。
研究表明GAL4的DNA结合结构域，靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域，可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。
在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。
据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要它能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。
正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2部分组成：(1)将文库蛋白片段，与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒； (2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒。
酵母单杂交的原理及应用
酵母单杂交的原理及应用1. 引言酵母单杂交是一种基因工程技术，通过将不同的酵母菌株进行杂交，实现基因的转移和重组。
这种技术在生物医药领域和食品工业等多个领域有广泛的应用。
本文将介绍酵母单杂交的原理，以及其在生物学研究和应用领域的具体应用。
2. 酵母单杂交的原理酵母单杂交是基于两个重要的生物学现象：酵母菌的性别和重组。
酵母菌是一种真核生物，有两种性别：雄性和雌性。
酵母菌的重组是指在有性生殖过程中，两个父本酵母菌的基因经过交换，重新组合成新的基因。
酵母单杂交的原理如下： - 首先，选择两个具有不同性别的酵母菌株。
- 将这两个株种分别培养在不同的培养基中，分别生成没有交配伴侣的单倍体细胞。
- 利用化学或物理方法将两种单倍体细胞融合在一起，形成杂交细胞。
- 将杂交细胞培养在适宜的培养基中，使其进行有性生殖。
- 在有性生殖的过程中，两个亲本酵母的基因进行交换和重组，形成新的基因组。
重组的结果可能是基因突变、基因删除、基因重复等。
- 通过筛选和鉴定，筛选出具有特定性状的酵母单杂交子代。
3. 酵母单杂交的应用3.1 用于基因功能研究酵母单杂交可以用于揭示基因的功能和相互作用关系。
通过将感兴趣的基因与其他酵母菌基因进行单杂交，可以确定该基因的功能和参与的生物过程。
此外，酵母单杂交也可以用于酵母基因组的大规模互作网络研究，帮助科学家理解复杂的生物调节网络。
3.2 用于疾病研究与药物筛选许多疾病与基因突变有关，通过酵母单杂交可以研究基因突变对蛋白质功能的影响，从而揭示疾病机制。
此外，酵母单杂交还可以用于药物筛选。
通过将药物与酵母菌基因进行单杂交，可以评估药物对基因的作用和效果，为新药的发现提供线索。
3.3 用于产酵母菌株的改良与优化酵母单杂交可以用于改良和优化产酵母菌株的特性。
通过筛选和鉴定具有特定性状的酵母单杂交子代，可以选择出高产酵母菌株或改良后的酵母菌株。
这对于酿酒、发酵食品和酶工程等产业具有重要意义。
酵母单杂交1
酵母单杂交序列，而无需分离、 纯化蛋白。 酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋 白质是处于自然构象，克服了体外研究时 蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而 具有很高的灵敏性。
将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选 表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录） 的阳性菌落。
酵母双杂交的原理
AD BD
UAS
GAL-LACZADຫໍສະໝຸດ Prey-ADBait-BD
BD
UAS
GAL-LACZ
双杂交系统的组成示意图
酵母杂交出现假阳性的原因：
1. 可能与酵母中其他蛋白质的作用有关； 2. 在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质 常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及 报告基因的表型； 3. 为了抑制背景表达而在培养基中添加的 3-AT（3-Aminotriazole，氨基三唑，一种 除草剂)或6-Azauracil（氮尿嘧啶）也对菌 株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相 互作用可能会因此而被掩盖 。
2、反转录生成cDNA: 反转录酶，oligo(dT) ,R6 3、与噬菌体载体分子连接 4、噬菌体的包装
mRNA
逆转录酶
cDNA
复制
双链cDNA
载体
重组DNA分子
有特殊碱基序 列的单链DNA 或RNA分子,可 以用放射性物 质或免疫性物 质标记,通过 杂交,DNA探针 常用于检测互 补的碱基序列。
酵母双杂交系统的局限性
该系统要求Bait蛋白能够被稳定地表达成融 合蛋白，且该融合蛋白必须能被转运到细 胞核内，因而不能被转运到细胞核内的蛋 白质如细胞浆蛋白、细胞膜蛋白的相互作 用的研究就不宜用该系统; 如果某些哺乳动物细胞蛋白质是经过翻译 后加工才能相互作用，则该系统也不适用， 因为酵母的后加工系统与哺乳动物细胞后 加工系统不尽相同.
酵母单杂交技术
酵母单杂交(yeast one hybrid)技术(2013-03-23 05:24:00)转载▼分类：分子生物学专业标签：酵母单杂交gal4蛋白酵母双杂交技术报告基因文化酵母单杂交(yeast one hybrid)技术，是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析。
运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果，比其他体外技术获得的结果，更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。
1 酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术，最早是1993年由Li et al从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。
目前认为真核生物的转录起始，需要转录因子的参与。
这些转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和转录激活结构域(activation domain, AD)。
用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。
研究表明GAL4的DNA结合结构域，靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域，可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。
在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。
据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要它能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。
酵母杂交系统
一、酵母单杂交系统酵母单杂交系统（yeast-one-hybrid system）：用酵母细胞检测蛋白质与DNA之间相互作用的一种系统。
酵母单杂交技术最早是1993年由Li等从酵母双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。
由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。
酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。
其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。
理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。
二、酵母双杂交系统酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）：将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域基因和GAL4激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。
酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。
反式转录激活因子，例如酵母转录因子 GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域（DNA binding domain,DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。
酵母杂交
具有核定位序列。
猎物表达载体
a. VP16 来自于单纯疱疹病毒，它的转录激活活性高于其他两个；
b. 酵母 Gal4 的转录激活域； c. B42 来自 E.coli，转录激活活性弱，可以缓和有毒性的基因表达对细
胞的影响，并且在 B42 后有流感病毒 HA 抗原，易于将蛋白分离纯化
针对非核内蛋白质
已知蛋白质识别的RNA序列。利用这 个系统成功地发现了许多RNA与蛋白 质之间的相互作用。包括铁离子调节 蛋白与铁反应元件的结合[12]；HIV
翻译激活因子Tat与Tar反应元件RNA
序列的结合等
酵母单杂交系统
酵母单杂交是根据 DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用 元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合 的转录因子基因 (cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真 核生物的转录激活子由物理和功能上独立的 DNA 结合区(DNAbinding domain BD) 和转录激活区 (Activation domain AD) 组成，因此可构建各种基因与 AD的融合表达载体，在酵母中 表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出 与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中， 任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。
酵母杂交系统
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酵母杂交系统是研究蛋白质间相互作 用的一种分子生物学方法。传统检测蛋
白质相互作用的方法，如蛋白质亲和系统在研究 蛋白质组学领域就有其重要地位和作用。
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基 因转录调控中建立c2 酵 诱饵质粒上连接有目标靶序 统 母 酵母单A连接，可以表达AD 系 反向杂交 杂合蛋白 统 酵母菌株：Y187 的 GAL4基因是缺失型的；基因组 酵母三杂交系统 分 中引入 额外的报告基因LEU、 类 TRP、 HIS
酵母单杂交系统原理
酵母单杂交系统原理宝子们！今天咱们来唠唠一个超有趣的生物技术——酵母单杂交系统。
这玩意儿可神奇啦，就像是生物技术里的一个小侦探，专门挖掘那些隐藏在基因里的小秘密。
酵母单杂交系统呢，主要是用来研究蛋白质和DNA之间的相互作用的。
咱都知道，细胞里那些DNA就像是一本超级复杂的密码本，而蛋白质呢，就像是一群能解读密码的小机灵鬼。
它们之间要是互相看对眼了，就会结合在一起，然后就会发生好多超级重要的事情。
那这个酵母单杂交系统是怎么做到的呢？咱先来说说酵母这小家伙。
酵母啊，它是一种特别好的实验小助手。
它就像一个小小的生物工厂，在里面我们可以搞好多神奇的实验。
在这个系统里，我们把酵母的基因组做了点小手脚。
我们把一段我们感兴趣的DNA序列，比如说某个基因的启动子序列，给它放到酵母的基因组里。
这个启动子就像是一个开关，它能决定后面的基因是不是开始工作。
然后呢，我们还有一个很重要的角色，就是我们要研究的那个蛋白质。
这个蛋白质可能来自各种生物，不管是植物的、动物的还是微生物的。
我们把这个蛋白质对应的基因给它改造一下，让它在酵母里能够表达出来，也就是让酵母这个小工厂能够生产出这个蛋白质。
当这个蛋白质在酵母里被生产出来之后呢，它就开始在酵母细胞里晃悠啦。
如果这个蛋白质和我们之前放进酵母基因组里的那个启动子序列有缘分，它们就会结合在一起。
这一结合可不得了，就像是打开了一个魔法的大门。
因为啊，在这个启动子后面，我们还偷偷地放了一个报告基因。
这个报告基因就像是一个小信号灯。
当蛋白质和启动子结合之后，这个报告基因就会被激活。
这个报告基因可以是让酵母细胞产生一种特殊的颜色，比如说蓝色，这样我们一眼就能看出来，哇塞，这个蛋白质和这个DNA序列是有相互作用的呢。
或者这个报告基因可以让酵母在一种特殊的培养基上生长，如果没有这种相互作用，酵母在这个培养基上就长不了，有了相互作用，酵母就能茁壮成长，就像得到了魔法的加持一样。
你看，酵母单杂交系统就这么巧妙地把蛋白质和DNA之间那种看不见摸不着的相互作用给我们展示出来了。
酵母单杂交1
酵母单杂交体系是1993年由Wang和Reed创立的
酵母单杂交体系是借鉴酵母双杂交体系的 基本原理，通过观察酵母细胞内报告基因 的表达状况，研究DNA一蛋白质之间的相 互作用。
酵母单杂交系统组成 (1)将基因片段与GAL4转录激活域融合报告基因的报告质 粒. （3）三缺型酵母受体：Leu- ，His-，Ura （Leu，His及尿嘧啶合成缺陷型 ）
酵母单杂交序列，而无需分离、 纯化蛋白。 酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋 白质是处于自然构象，克服了体外研究时 蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而 具有很高的灵敏性。
酵母单杂交体系的缺点:
假阳性结果 由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能 发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激 活因子就可以激活报告基因的转录 假阴性结果 如果酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性，或 融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达，或融 合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于酵母细 胞核内，以及融合的Ga14 AD封闭了蛋白上与 DNA相互作用的位点，则都可能干扰AD融合蛋 白结合于靶元件的能力
将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选 表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录） 的阳性菌落。
酵母双杂交的原理
AD BD
UAS
GAL-LACZ
AD
Prey-AD
Bait-BD
BD
UAS
GAL-LACZ
双杂交系统的组成示意图
酵母杂交出现假阳性的原因：
1. 可能与酵母中其他蛋白质的作用有关； 2. 在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质 常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及 报告基因的表型； 3. 为了抑制背景表达而在培养基中添加的 3-AT（3-Aminotriazole，氨基三唑，一种 除草剂)或6-Azauracil（氮尿嘧啶）也对菌 株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相 互作用可能会因此而被掩盖 。
酵母单杂交系统
酵母单杂交系统应用
1. 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，目前对于 酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面。 Chew et al （1999）应用酵母单杂交技术证实了在大鼠 脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质GRIK5基 因的内含子结合蛋白。 2. 对DNA结合结构域进行分析 如果能得到DNA结合结构域的 结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析. Mak et al （1996）运用此技术测试哺乳动物具有基本的 螺旋- 环- 螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子 4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性。
基本流程
5. 其他 得到的阳性酵母细行测序和序列比对等后续工作
cDNA插入片段
PADH1
GAL4-AD 转化
TADH1
LEU2
酵母转化体 DRE DRE DRE DRE Pmin LacZ URA3
筛选 测序，进一步验证结合活性 挑取阳性克隆
酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪9，省略了在酵母双杂交系统中采用 的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位 点
酵母单杂交系统原理
将已知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子（Pmin） 上游，把报告基因连接到Pmin下游 编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD） 融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用 原件结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达
将插入目标元件的pHIS2质粒转化Y187酵母后，在不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp平板进 行培养，获得能抑制组氨酸渗漏的最低3-AT浓度，一般不超过45mmol/L
基本流程2. 构建表达 将样品经过一定处理之后（如胁迫）后，提取mRNA， 经过反转录获得cDNA。
酵母单杂交1
酵母单杂交体系是借鉴酵母双杂交体系的 基本原理，通过观察酵母细胞内报告基因 的表达状况，研究DNA一蛋白质之间的相 互作用。
酵母单杂交系统组成 (1)将基因片段与GAL4转录激活域融合报告基因的报告质 粒. （3）三缺型酵母受体：Leu- ，His-，Ura （Leu，His及尿嘧啶合成缺陷型 ）
分子生物学技术1. cDNA cDNA(complementary DNA library)以 组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双 链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成 重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这mRNA制备：纯化试剂盒，生物 素
三杂交系统
两个蛋 白之间 通过第 三者发 生相互 作用
TF:介导蛋白质相互作用的第三种因子. 可以是蛋白质,DNA,RNA或小分子配体
适 用 范 围
蛋白质三杂交系统
a 蛋白Z稳定了蛋白A和B之间的作用; b 蛋白质A和B通过蛋白Z相互作用; c 蛋白Z改变了A的结构，使得B能与之作用
酵母单杂交
将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选 表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录） 的阳性菌落。
酵母双杂交的原理
AD BD
UAS
GAL-LACZ
AD
Prey-AD
Bait-BD
BD
UAS
GAL-LACZ
双杂交系统的组成示意图
酵母杂交出现假阳性的原因：
1. 可能与酵母中其他蛋白质的作用有关； 2. 在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质 常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及 报告基因的表型； 3. 为了抑制背景表达而在培养基中添加的 3-AT（3-Aminotriazole，氨基三唑，一种 除草剂)或6-Azauracil（氮尿嘧啶）也对菌 株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相 互作用可能会因此而被掩盖 。
酵母单杂交的原理与应用实例
酵母单杂交的原理与应用实例一、本文概述酵母单杂交（Yeast One-Hybrid）是一种强大的分子生物学技术，它利用酵母细胞的转录调控机制来研究DNA与蛋白质之间的相互作用。
这种技术基于酵母细胞的转录因子与DNA结合的特性，通过将感兴趣的蛋白质（如转录因子）与报告基因（如抗性基因或荧光蛋白基因）连接，可以在酵母细胞内筛选出与目标DNA结合的蛋白质。
酵母单杂交不仅具有高灵敏度和高通量筛选的优势，还可以用于研究基因表达调控、蛋白质与DNA相互作用机制、以及新药物和新材料的发现等领域。
本文将详细介绍酵母单杂交的原理、实验操作及应用实例，以期为相关领域的研究人员提供有益的参考。
二、酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术是一种基于酵母转录因子和DNA相互作用的遗传学方法，用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用，以及筛选和鉴定与特定DNA序列结合的蛋白质。
其基本原理是将待研究的DNA序列（如启动子、增强子等）与报告基因（如荧光素酶、抗性基因等）融合，构建成报告质粒。
然后，将报告质粒与表达特定转录因子的表达质粒共转化到酵母细胞中。
如果转录因子能够与报告质粒中的DNA序列结合，就会激活报告基因的表达，从而通过检测报告基因的表达情况来判断转录因子与DNA序列的相互作用。
酵母单杂交技术的关键在于利用了酵母细胞内的转录调控机制。
在酵母细胞中，转录因子的作用是通过与DNA序列结合，调控基因的转录水平。
当转录因子与DNA序列结合时，它会与RNA聚合酶II等转录相关蛋白形成转录起始复合物，从而启动基因的转录。
因此，通过构建包含特定DNA序列的报告质粒，并在酵母细胞中共表达转录因子，就可以观察到转录因子对报告基因表达的调控作用。
酵母单杂交技术具有灵敏度高、操作简便、高通量等优点，因此在基因表达调控、蛋白质与DNA相互作用研究等领域得到了广泛应用。
通过酵母单杂交技术，可以筛选出与特定DNA序列结合的转录因子，研究其调控机制，也可以用于基因功能注释、基因表达调控网络构建等方面。
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基本流程
5. 其他 得到的阳性酵母细行测序和序列比对等后续工作
cDNA插入片段
PADH1
GAL4-AD 转化
TADH1
LEU2
酵母转化体 DRE DRE DRE DRE Pmin LacZ URA3
筛选 测序，进一步验证结合活性 挑取阳性克隆
酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪9，省略了在酵母双杂交系统中采用 的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位 点
酵母单杂交系统原理
将已知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子（Pmin） 上游，把报告基因连接到Pmin下游 编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD） 融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用 原件结合，就能激活Pmin启动子，使报告基TD7-rec2质粒表达AD杂合蛋白，转化完毕后将 菌液均匀涂布于SD/-His/-Leu/-Trp+最低抑制本底HIS泄露浓 度3-AT平板上，30℃培养2-7天，获取阳性克隆
基本流程
4. 阳性克隆的鉴定 用3-AT抗性检测，即提高3-AT浓度，以排除假阳性，取 第3步获得的阳性克隆，充分悬浮于200µLTE溶液，涂布于 含60mmol/L3-AT +SD/-His/-Leu/-Trp选择性培养基上，只有 真正的阳性克隆才能在这种条件下生长
酵母单杂交系统
吉林大学 植物科学学院 2010级硕士
1993年，由Wang和Reed等创立发展出一种研究蛋白质和 DNA相互作用的实验体系。
Wang MM,Reed RR. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast. Nature,1993, 364(6433):121-126.
酵母菌株：Y187
GAL4基因是缺失型的；基因组中引入 额外的报告基因LEU、TRP、 HIS
报告基因
常用的酵母单杂交体系基本选用HIS3或者LacZ作为报告 基因，虽然有的体系将带有报告基因的载体直接整合与酵母 染色体上，在大部分实验中报告基因都位于质粒DNA上 LacZ reporter - Blue/White Screening HIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity)
基本流程
1. 筛选含有报道质粒的酵母细胞 具体过程为： 合成靶序列； 将靶序列插入pHIS2载体的多克隆位点；
一般为将0.1mg pHIS2质粒用EcoRⅠ和SacⅠ进行完全双酶切，T4连接酶连接，靶序 列： pHIS2质粒=5：1的比例进行
酵母转化；
选用乙酸锂法
消除报道基因在酵母细胞中的本底表达；
优点
简单易行，无需分离纯化蛋白，酵母菌属于真真核生物，杂 交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象克服了 体外研究时蛋白通常处于非自然构象的缺点，因而灵敏性很 高
缺点
有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发 生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激 活报道基因的转录，因而存在假阳性结果。 如果酵母表达的AD杂合蛋白对细胞有毒性或者融合蛋 白在宿主细胞内不能稳定的表达，或者融合蛋白发生错误折 叠，或者不能定位于细胞核内，以及融合的GAL4-AD封闭 了蛋白上与DNA作用的位点则都可能干扰AD杂合蛋白结合 于靶元件的能力，从而产生假阴性的结果。
谢谢！
将插入目标元件的pHIS2质粒转化Y187酵母后，在不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp平板进 行培养，获得能抑制组氨酸渗漏的最低3-AT浓度，一般不超过45mmol/取mRNA， 经过反转录获得cDNA。
一个获取水稻金属应答转录因子的引物： CDSⅢ：5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3’ SMARTⅢ ：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’
酵母ห้องสมุดไป่ตู้杂交系统应用
1. 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，目前对于 酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面。 Chew et al （1999）应用酵母单杂交技术证实了在大鼠 脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质GRIK5基 因的内含子结合蛋白。 2. 对DNA结合结构域进行分析 如果能得到DNA结合结构域的 结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析. Mak et al （1996）运用此技术测试哺乳动物具有基本的 螺旋- 环- 螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子 4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性。
转录因子 顺式元件 顺式元件
AD 顺式元件 Pmin 报告基因
转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使 报告基因表达，若连接如3个以上顺式作用元件，可增强转 录因子的识别和结合效率
质粒质粒上，可以表达AD杂合蛋白