酵母单杂交系统

酵母菌株：Y187
GAL4基因是缺失型的；基因组中引入 额外的报告基因LEU、TRP、 HIS
报告基因
常用的酵母单杂交体系基本选用HIS3或者LacZ作为报告 基因，虽然有的体系将带有报告基因的载体直接整合与酵母 染色体上，在大部分实验中报告基因都位于质粒DNA上 LacZ reporter - Blue/White Screening HIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity)
基本流程
1. 筛选含有报道质粒的酵母细胞 具体过程为： 合成靶序列； 将靶序列插入pHIS2载体的多克隆位点；
一般为将0.1mg pHIS2质粒用EcoRⅠ和SacⅠ进行完全双酶切，T4连接酶连接，靶序 列： pHIS2质粒=5：1的比例进行
酵母转化；
选用乙酸锂法
消除报道基因在酵母细胞中的本底表达；
酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪90年年代中 期又发展起来的--用于核酸和文库蛋白之间的研究
在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用 的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位 点
酵母单杂交系统原理
将已知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子（Pmin） 上游，把报告基因连接到Pmin下游 编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD） 融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用 原件结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达
谢谢！
基本流程
3. 文库质粒、诱饵质粒共转化酵母细胞 重组pGATD7-rec2质粒表达AD杂合蛋白，转化完毕后将 菌液均匀涂布于SD/-His/-Leu/-Trp+最低抑制本底HIS泄露浓 度3-AT平板上，30℃培养2-7天，获取阳性克隆
基本流程
4. 阳性克隆的鉴定 用3-AT抗性检测，即提高3-AT浓度，以排除假阳性，取 第3步获得的阳性克隆，充分悬浮于200µLTE溶液，涂布于 含60mmol/L3-AT +SD/-His/-Leu/-Trp选择性培养基上，只有 真正的阳性克隆才能在这种条件下生长
转录因子 顺式元件 顺式元件
AD 顺式元件 Pmin 报告基因
转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使 报告基因表达，若连接如3个以上顺式作用元件，可增强转 录因子的识别和结合效率
质粒和菌株
质粒：诱饵质粒pHIS2，文库质粒为pGATD7-rec2
诱饵质粒上连接有目标靶序列，最小启动子和报告基因 文库质粒则和反转录得到的真核生物cDNA连接，可以表达AD杂合蛋白
优点
简单易行，无需分离纯化蛋白，酵母菌属于真真核生物，杂 交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象克服了 体外研究时蛋白通常处于非自然构象的缺点，因而灵敏性很 高
缺点
有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发 生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激 活报道基因的转录，因而存在假阳性结果。 如果酵母表达的AD杂合蛋白对细胞有毒性或者融合蛋 白在宿主细胞内不能稳定的表达，或者融合蛋白发生错误折 叠，或者不能定位于细胞核内，以及融合的GAL4-AD封闭 了蛋白上与DNA作用的位点则都可能干扰AD杂合蛋白结合 于靶元件的能力，从而产生假阴性的结果。
酵母单杂交系统
吉林大学 植物科学学院 2010级硕士
1993年，由Wang和Reed等创立发展出一种研究蛋白质和 DNA相互作用的实验体系。
Wang MM,Reed RR. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast. Nature,1993, 364(6433):121-126.
基本流程
5. 其他 得到的阳性酵母细胞都应当注意保存； 从阳性克隆酵母中抽提文库质粒，转化大肠杆菌进行大量克 隆，最后进行测序和序列比对等后续工作
cDNAபைடு நூலகம்入片段
PADH1
GAL4-AD 转化
TADH1
LEU2
酵母转化体 DRE DRE DRE DRE Pmin LacZ URA3
筛选 测序，进一步验证结合活性 挑取阳性克隆
酵母单杂交系统应用
1. 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，目前对于 酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面。 Chew et al （1999）应用酵母单杂交技术证实了在大鼠 脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质GRIK5基 因的内含子结合蛋白。 2. 对DNA结合结构域进行分析 如果能得到DNA结合结构域的 结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析. Mak et al （1996）运用此技术测试哺乳动物具有基本的 螺旋- 环- 螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子 4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性。
将插入目标元件的pHIS2质粒转化Y187酵母后，在不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp平板进 行培养，获得能抑制组氨酸渗漏的最低3-AT浓度，一般不超过45mmol/L
基本流程
2. 构建表达文库 将样品经过一定处理之后（如胁迫）后，提取mRNA， 经过反转录获得cDNA。
一个获取水稻金属应答转录因子的引物： CDSⅢ：5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3’ SMARTⅢ ：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’