实验2-凝集反应-ELISA(双抗原夹心法)
elisa双抗夹心法实验原理
elisa双抗夹心法实验原理Elisa（Enzyme-linked immunosorbent assay）双抗夹心法是一种常用的免疫化学分析方法，用于检测特定抗原或抗体的存在。
该实验原理是以酶作用为基础，通过测量酶标记的抗体或抗原与待测抗原或抗体的结合来定量分析样品中目标物质的浓度。
以下是对Elisa双抗夹心法实验原理的详细说明。
一、实验目的：通过测量待测抗原或抗体与酶标记抗体或抗原的结合程度以及酶催化产物的生成量，来确定待测物质的浓度。
二、实验原理：Elisa双抗夹心法实验基于多步骤的反应，其中酶-抗体或酶-抗原复合物是关键步骤。
以下是实验的步骤及关键原理：1.固相吸附实验：在微孔板等固相载体上吸附检测抗体或抗原。
·固相载体：常用的载体有微孔板、管内涂层或其他固定化材料。
这些载体具有高吸附能力和较低的非特异性表面结合。
·检测抗体或抗原的固相吸附：根据实验需要选择合适的抗体或抗原偶联到固相载体上。
吸附过程通常发生在特定的pH和盐度条件下，以确保稳定的结合。
2.样品添加：将待测样品加入到微孔板中，使待测物与固相上的抗体或抗原结合。
·待测样品：可以是液体（如血清、尿液）或固体（如组织切片）。
·混合和孵育：样品与固相复合物一起在适当的条件下孵育，以保证充分的结合。
3.洗涤：洗涤步骤旨在去除未结合的和非特异性结合的物质。
·洗涤液：通常是缓冲盐水溶液，具有适当的pH和离子浓度，以最小化非特异性结合。
·洗涤过程：洗涤液会冲走未结合的物质，保留已结合的抗原-抗体复合物。
4.酶-抗体或酶-抗原标记：加入酶标记的抗体或抗原溶液，与待测抗原或抗体结合。
·酶标记抗体或抗原：酶通常是辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
酶在作用物质时具有催化能力，可用于信号放大。
·组合和孵育：酶标记抗体或抗原与待测样品中的目标物质结合，形成酶-抗体或酶-抗原复合物。
双抗体夹心法实验报告
双抗体夹心法实验报告引言双抗体夹心法是一种常用的实验技术，常用于检测特定的蛋白质、抗体或其他生物大分子。
本实验旨在介绍双抗体夹心法的基本原理、实验步骤和注意事项。
实验原理双抗体夹心法基于免疫学反应原理，利用两种不同的抗体，将待检测物夹在中间，形成“夹心”。
其中，第一层抗体能够与待检测物特异结合，第二层抗体能够与第一层抗体结合。
通过第二层抗体的信号转导，可以间接检测到待检测物的存在。
实验步骤1. 材料准备准备所需材料，包括待检测物、第一层抗体、第二层抗体、阻断剂、底物等。
2. 夹心法反应在实验板上依次加入第一层抗体、待检测物和第二层抗体，使它们夹在一起。
确保每一层抗体充分覆盖待检测物。
3. 清洗步骤进行洗涤步骤，以去除非特异部分的抗体或其他干扰物。
4. 信号转导加入底物，使其与第二层抗体发生反应，产生信号。
5. 信号检测使用合适的检测设备，如酶标仪或荧光显微镜等，检测底物反应产生的信号。
6. 数据分析根据实验结果，进行数据分析和统计处理，得出相应的结论。
实验注意事项以下是在进行双抗体夹心法实验时需要注意的一些事项：1.实验板的选择：根据实验需要选择合适的实验板，比如96孔板或384孔板等。
2.抗体的选择：选择特异性较高的抗体，以提高实验的准确性和灵敏性。
3.清洗步骤的控制：洗涤时要注意洗涤缓冲液的浓度和洗涤次数，以充分去除非特异性结合物。
4.底物的选择：根据需要选择合适的底物，如酶底物或荧光底物等。
5.数据分析的准确性：在进行数据分析时，要注意准确计算样本吸光度或荧光强度，并进行适当的统计处理。
结论双抗体夹心法是一种常用的实验技术，可以用于检测特定的蛋白质、抗体或其他生物大分子。
通过夹心法的信号转导，可以间接检测到待检测物的存在。
在进行实验时，需要注意实验步骤的顺序和注意事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。
参考文献[1] Smith A. et al. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for Detection of Potato viruses S and Y in Potato Leaf Extracts. J. Vis. Exp., 2016, (113),e54205.。
elisa实验报告夹心法
elisa实验报告夹心法夹心法（sandwich assay）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析特定分子的存在和浓度。
其中，ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是夹心法的一种常见应用方式。
本文将介绍ELISA实验报告夹心法的原理、步骤和应用。
一、原理ELISA实验报告夹心法基于抗原与抗体的特异性结合反应。
夹心法将待检测的抗原夹在两层抗体之间，形成“夹心”结构。
第一层抗体与抗原结合，将抗原固定在固体表面上，例如酶标板。
待检测样品中的抗原与固定抗体结合后，第二层抗体与抗原结合，形成夹心结构。
第二层抗体通常与酶标记有关，通过酶的催化作用，产生可检测的信号。
二、步骤1. 抗原固定：将待检测的抗原溶液加入酶标板孔中，使其与酶标板表面的第一层抗体结合。
孔中未结合的抗原将被洗去，以去除非特异性结合物质。
2. 样品孔：将待检测样品加入酶标板孔中，使其与抗原结合。
样品中的抗原与第一层抗体结合后，形成夹心结构。
3. 第二层抗体：加入与待检测抗原特异性结合的第二层抗体，使其与夹心结构中的抗原结合。
第二层抗体通常与酶标记有关，例如辣根过氧化物酶（HRP）。
4. 底物添加：加入适当的底物，使其与酶发生反应，产生可检测的信号。
常用的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基苯胺）和ABTS（2,2'-联氨基二乙基苯并噻唑-6-磺酸）等。
5. 信号检测：通过测量底物反应产生的颜色或荧光强度，可以定量分析待检测抗原的存在和浓度。
三、应用ELISA实验报告夹心法广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
以下是几个常见的应用领域：1. 检测疾病标志物：ELISA夹心法可以用于检测血液、尿液等样品中的特定蛋白质标志物，帮助早期诊断和监测疾病，如癌症、心血管疾病等。
2. 食品安全检测：ELISA夹心法可以用于检测食品中的污染物，如农药残留、毒素等，保障食品安全。
3. 免疫学研究：ELISA夹心法可以用于研究免疫系统中的分子相互作用，如抗体与抗原的结合，以及细胞因子的检测等。
免疫学实验ELISA双抗夹心法课件
小于判断值为阴性。 注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，
大于0.05按实际OD值计算判断值。
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注意事项：
1. 试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀， 弃去1～2滴垂直滴加；
2. 严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性； 3. 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
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思考题：
1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？。 2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？
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2009级医疗专科复习题
一、名词解释2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原决定基(表位)、异嗜性抗原、白细胞分 化抗原、TD-Ag、 TI-Ag、抗体、免疫球蛋白、单（多）克 隆抗体、补体、经典途径、旁路途径、细胞因子、IL、IFN、 CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式识别 受体（PRR）、抗原提呈细胞（ APC）、适应性免疫应答、 免疫耐受、免疫调节、超敏反应、人工主动免疫、人工被动 免疫、计划免疫 注：红色标记为要求掌握英文
实验原理：
酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底 物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术，可用于检测体 液中微量的特异性抗体或抗原。首先，抗原、抗体的特异性反应在一种 固相载体表面－聚苯乙烯微量反应板孔中进行，通过洗涤去除多余的游 离反应物；然后加入酶标记的抗体或酶标记的抗抗体，从而形成抗体－ 抗原－酶标抗体复合物（双抗体夹心法）或抗原－抗体－抗抗体复合物 （间接法）；此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体呈现显 色反应。液体显色的强弱与复合物中待测抗原或抗体的量呈正比，借此 可检测待测抗原或抗体的有无及含量。
ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原
ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原临床ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原对于含多个抗原决定簇的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。
具体测定方法如下：1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上。
3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。
4．加入酶底物，温育显色测定(图2—1)。
在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。
最初的双抗夹心ELISA试剂盒，均采用两步法。
后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。
目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HAg、。
FP和hCG等，基本上都采用一步法。
一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA测定结果有严重影响。
在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S形变化曲线。
而一步法双抗夹心ELISA的反应曲线则为钟形曲线。
也就是说测定显色随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(hook eHect)，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”(zonephen。
elisa双抗体夹心法原理
elisa双抗体夹心法原理Elisa双抗体夹心法原理引言：Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定分子。
其中，双抗体夹心法是Elisa的一种常见应用，它通过特定抗体的结合来检测目标分子的存在。
本文将详细介绍Elisa双抗体夹心法的原理和应用。
一、Elisa双抗体夹心法的原理Elisa双抗体夹心法是一种间接的免疫测定方法，它利用两种不同的抗体来夹持目标分子，从而实现对目标分子的检测和定量分析。
1. 抗原涂覆：首先，在试验板上涂覆含有目标分子的抗原。
这个抗原可以是蛋白质、多肽、病毒、细菌等。
涂覆后，将试验板放置在适当的条件下，使抗原与试验板表面结合。
2. 阻断：为了避免非特异性结合，需要在试验板上进行阻断步骤。
通常使用一种无关的蛋白质（如牛血清蛋白）来阻断未被抗原结合的表面。
3. 第一次抗体结合：将含有特异性抗体的溶液加入试验板中，使其与目标分子结合。
这种特异性抗体通常是由动物免疫产生的，可以识别并结合目标分子。
4. 第一次洗涤：为了去除未结合的第一次抗体，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以去除非特异性结合物，提高检测的特异性。
5. 第二次抗体结合：将与酶结合的第二次抗体加入试验板中，使其与第一次抗体结合。
这种第二次抗体通常是与酶（如辣根过氧化物酶）结合的抗体，可以通过酶的催化作用来放大信号。
6. 第二次洗涤：为了去除未结合的第二次抗体，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以去除非特异性结合物，提高检测的特异性。
7. 底物添加：将含有底物的溶液加入试验板中，底物与酶的催化作用产生可测量的信号。
常用的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等。
8. 反应停止：通过加入反应停止剂，停止底物的反应，并产生一个可测量的信号。
反应停止剂通常是酸性溶液，可以改变底物的颜色。
9. 信号检测：使用光谱仪或酶标仪等设备，测量底物反应产生的信号强度。
信号的强度与目标分子的浓度成正比，可以通过标准曲线来定量分析目标分子的浓度。
医学免疫学：实验2 凝集反应(ABO血型测定)
实验目的:
检测血清标本中有无HBsAb
材料:
48孔ELISA板
阳性对照血清（HBsAb） 阴性对照血清 酶标二抗
乙肝病毒表面抗体 诊断试剂盒
洗涤液
底物A和B
微量加样器，待测血清标本等
实验方法
微孔板已包被HBsAg
HBsAg
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
+ + — — ① ① ① ① ② ② ② ②A + + — — ③ ③ ③ ③ ④ ④ ④ ④B + + — — ⑤ ⑤ ⑤ ⑤ ⑥ ⑥ ⑥ ⑥C + + — — ⑦ ⑦ ⑦ ⑦ ⑧ ⑧ ⑧ ⑧D
实验结果
颜色变化或OD（吸光度）值
酶标板
酶标仪Βιβλιοθήκη 样+-1 2 3456
每孔加 50μl 不同的血清样本 Positive control (HBsAb) ：1 滴 Negative control (NS): 1 滴
加样
+
- sample
加酶结合物
enzyme
每孔加酶结合物1滴 混匀， 37 ℃ 30 min.
放射物标记技术 酶标技术
免疫荧光技术
酶联免疫吸附试验
酶免疫组化技术
双抗体夹心法
竞争法
双抗原夹心法
间接法
直接法
原理：间接ELISA法(酶联免疫吸附试验)
不显色
洗涤
洗涤
1.包被已知抗原 2.加入待测标本 （未知抗体？） 3.加入酶标二抗 （即抗抗体 ：抗人Ig的抗体） 4.加入底物
颜色改变 = 待测标本中存在抗体
实验结果
呈红色片状凝集颗粒为阳性 实验结束后，洗涤试管；
双抗原抗体夹心法的原理
双抗原抗体夹心法的原理
双抗原抗体夹心法（Sandwich ELISA）是一种常用的酶联免疫吸附试验方法，用于检测具有两个抗原表位的物质，如蛋白质。
该方法的原理是，在试验板上固定一种特异性抗体，使其与待测物质中的目标抗原结合。
然后，通过洗涤步骤去除非特异性结合物质。
接下来，在试验板上加入第二种特异性抗体，这种抗体与目标抗原的另一个表位结合，与第一种抗体形成"夹心"结构。
然后，再次进行洗涤步骤，以去除非特异性结合物质。
最后，加入带有酶标记的二抗，这种二抗能够与第二种抗体结合，形成夹心结构，并且带有酶标记的二抗能够与底物反应，产生可检测的信号。
通过测量底物的反应产物的颜色或发光强度，就可以确定目标抗原的存在量。
双抗原抗体夹心法的优势在于能够提高检测的灵敏度和特异性，因为需要两个特异性抗体结合目标抗原才能形成夹心结构，减少了非特异性结合的干扰。
这种方法广泛应用于生物医学研究和临床诊断中，用于检测各种蛋白质、肽、细胞因子等分子的含量。
免疫学实验二 ELISA(双抗夹心法)
ELISA的测定方法包括：
双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法
间接法：检测抗体最常用的方法
竞争法：既可检测抗原，亦可检测抗体 生物素－亲和素系统ELISA法：是在ELISA中引入生物素或亲和 素放大系统，检测极微量的抗原或抗体的方法。
第三页，共22页。
直接法
第四页，共22页。
间接法
7. 终止反应：各孔. 比色：将反应板以酶标仪450nm处用空白孔调零，测各孔OD值。
第十一页，共22页。
6.显色 各孔（包括空白对照）加底物A 液50μl（1滴），底物B液50μl （1滴），置37℃避光温育 15min
7.终止反应 各孔加终止液50μl
第十页，共22页。
4. 加酶标记的抗HBsAb抗体：除空白对照外各孔50μl，充分混匀。 将即时帖覆盖于反应板上，37℃孵育30min。
5. 弃去反应孔内液体，拍干，用洗涤液注满各孔、静置30秒、 再拍干，重复洗涤5 次。(操作同2)
6. 显色：各孔（包括空白对照）加底物A液50μl（1滴），底物B 液50μl（1滴），置37℃避光温育15min。
第十六页，共22页。
THANKS
第十七页，共22页。
2009级医疗专科复习题
一、名词解释2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原决定基(表位)、异嗜性抗原、白细胞分化抗 原、TD-Ag、 TI-Ag、抗体、免疫球蛋白、单（多）克隆抗体、 补体、经典途径、旁路途径、细胞因子、IL、IFN、CSF、TNF、 MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式识别受体（PRR）、抗 原提呈细胞（ APC）、适应性免疫应答、免疫耐受、免疫调节、 超敏反应、人工主动免疫、人工被动免疫、计划免疫 注：红色标记为要求掌握英文
第二次实验：凝集反应和ELISA
酶联免疫吸附试验) 检测HBs Ab) 一、ELISA(酶联免疫吸附试验 (检测 酶联免疫吸附试文金生 微生物与免疫学教研室， 微生物与免疫学教研室，7A208
免疫标记技术 放射物标记技术 酶标技术 免疫荧光技术
酶联免疫吸附试验
1. 设阴性对照和阳性对照各2孔(每孔加入阴性对照或阳性对照50 µl 或1滴), 空白对照2孔(不加), 其他孔加入待检标本50 µl; 2. 每孔加入酶结合物50µl(空白对照不加), 混匀, 37℃40min ； 3. 弃去每孔液体, 用洗涤液洗涤每孔5秒×5次, 拍干板 ； 4. 每孔加显色液A, B各50 µl或1滴, 混匀, 37 ℃15 min； 5. 每孔加入终止液50 µl或1滴, 混匀； 6. 酶标仪读OD值或肉眼观察颜色深浅。
一、酶联免疫吸附试验（ ELISA） ELISA）
(一)实验目的 一 实验目的 实验目的: 检测标本中有无HBsAb（乙肝病毒表面抗体）; 检测标本中有无 （乙肝病毒表面抗体） (二)实验原理 二 实验原理 ELISA（双抗原夹心法）; （双抗原夹心法） (三)材料 材料: 三 材料 乙肝病毒表面抗体诊断试剂盒, 微量加样器等; 乙肝病毒表面抗体诊断试剂盒 微量加样器等 (四)实验方法 四 实验方法
(五)实验结果 五 实验结果
颜色变化或OD（吸光度）值。黄色为阳性（定性）。 （吸光度） 黄色为阳性（定性）。 颜色变化或 酶标板 酶标仪
(六)讨论及结论 六 讨论及结论
1、待检标本孔为什么无色或有黄色？ 、待检标本孔为什么无色或有黄色？ 2、待检标本为 、待检标本为HBsAb阴性或阳性血清。 阴性或阳性血清。 阴性或阳性血清
二、凝集反应
原理:
颗粒性Ag与相应 以合适比例发生特异性结 颗粒性 与相应Ab以合适比例发生特异性结 与相应 形成肉眼可见的凝集物。 合，形成肉眼可见的凝集物。
ELISA-双抗夹心法检测抗原PPT课件
Standard 原液 ½ ¼
1/8 1/16 1/32
50ul
37℃避光孵育1h
•33
每组4位同学的加样顺序：
每孔加样100μl
待测抗原 100μl
待测抗原 100μl
结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，
既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈
色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
•15
实验材料
小鼠INF-γ检测试剂盒的组成：
• Capture Ab：purified anti-mouse IFN-γ • Detection Ab ：biotin-conjugate-anti-mouse IFN-γ • Avidin-conjugate-HRP • Standard：recombinant mouse IFN-γ （定量测定） • Coating buffer • 5×Assay diluent • TMB solution
• 抗原测定法
➢ 直接竞争法检测可溶性抗原 ➢ 双抗体夹心法检测可溶性抗原
（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） ➢ 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法
•4
间接法检测特异性抗体
包被已知抗原
与待测抗体孵育
与酶标抗体孵育
加入底物
显色
•5
优点:
• 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测 相应抗体的方法
• 终止反应，防止反应过度：
TMB受光照影响不大，经HRP作用后，40min达到高峰；终止液有多 种，叠氮钠或SDS等酶抑制剂可以维持蓝色12-24h不褪色；
elisa双抗夹心法实验原理
elisa双抗夹心法实验原理Elisa双抗夹心法是一种用于检测目标物质的方法，广泛应用于生物医学研究、医学诊断和药物开发等领域。
该方法的原理基于对特定抗原和抗体之间的特异性结合反应进行检测。
Elisa双抗夹心法的原理主要包括以下几个步骤：1.修饰固体基质：首先，需要将特定的抗原结合到固体基质（例如酶标板）。
这可以通过直接吸附、共价结合或通过间接的亲和结合等方法来实现。
2.样品处理：样品（例如血清、细胞上清液等）中的目标物质将通过特定操作被加入到修饰后的固体基质上。
3.加入第一抗体：在样品中加入特异性的第一抗体。
这个第一抗体具有与样品中目标物质结合的能力。
4.洗涤步骤：将未结合的物质（如非特定结合的蛋白质、细胞等）洗涤掉，以减少干扰因素。
5.加入第二抗体：在第一抗体识别的目标物质上加入与其结合的第二抗体。
这个第二抗体上标记有荧光素、酶素等可以用于检测的信号物质。
6.洗涤步骤：将未结合的第二抗体洗涤掉。
7.加入检测物质：将适当的荧光素、酶素底物等添加到样品中。
8.信号检测：通过荧光检测、色素反应观察、光谱读取等方法，确定目标物质的存在与否。
这种双抗夹心法的原理在于，目标物质被检测之前会首先与固体基质上的抗原结合，然后在样品中与第一抗体特异结合。
第一抗体与目标物质结合后，样品经过洗涤步骤，以移除非特异性结合的物质。
接下来加入与第一抗体特异结合的第二抗体，第二抗体可以标记有信号产生物质。
经过洗涤步骤，未与第二抗体结合的物质将被去除。
最后，通过观察标记的信号物质的产生（如荧光强度的变化或酶底物的反应），可以确定目标物质的存在与否。
Elisa双抗夹心法的优点是：检测灵敏度高，特异性好，可以同时测定多个样品。
并且，该方法适用于不同种类的目标物质，如蛋白质、抗体、病毒等。
但也需要注意的是，该方法具有较长的操作时间，且需要复杂的实验步骤和设备。
在实验过程中，对温度、洗涤缓冲液pH值、洗涤次数等条件要求严格，实验结果的准确性一定程度上取决于实验操作的细节。
elisa双抗体夹心法原理
elisa双抗体夹心法原理
Elisa双抗体夹心法是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断
中的免疫分析方法。
该方法基于酶标记抗体-抗原-抗体反应原理，能够检测并定量分析样品中特定抗原的存在和浓度。
在Elisa双抗体夹心法中，首先需要将待测样品加入到涂有特
定抗体的微孔板中，使抗原与抗体发生特异性结合。
然后加入酶标记的第二抗体，并进行孵育，使其与未结合的抗原发生特异性结合。
随后，通过洗涤步骤将未结合的物质去除，只留下结合了酶标记抗体的复合物。
在样品中加入底物后，酶标记的第二抗体会催化底物发生化学反应，产生可检测的信号。
通过测量反应产物的光强度，可以间接地评估待测样品中抗原的浓度。
Elisa双抗体夹心法的灵敏度高、特异性强，且操作相对简便。
它广泛应用于疾病的诊断、药物研发、生物学研究等领域。
ELISA双抗体夹心法检测癌胚抗原
操作步骤
（1）加样：依次加入6个标准品（0、5、10、20、 40、80ng/ml）、样品1、样品2，每孔100ul， 混匀；
★ OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高 吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。
癌胚抗原CEA
(1) CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。 CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓 样癌等。但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性 结肠炎等疾病，15%～53%的病人血清CEA也会升高，所以CEA 不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值。
包被
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。
蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质 分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种 物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影 响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更 易吸附到固相载体表面。
DEPARTMENT OF IMMUNOLOGY
ELISA双抗体夹心法检测癌胚抗原
操作步骤
（1）加样：依次加入6个标准品（0、5、10、20、 40、80ng/ml）、样品1、样品2，每孔100ul， 混匀；
（2）温育：37℃，30分钟； （3）洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，
静置10秒，甩干，重复4次后，拍干； （4）加酶：加入酶标抗体，每孔100ul，混匀； （5）温育：37℃，30分钟； （6）洗板：同步骤3 （7）显色：加入显色剂A、B，每孔各一滴，混匀，
ELISA的类型 ★ 双抗体夹心法 ★ 竞争法 ★ 间接法
双抗体夹心法
检测抗原最常用的方法
医学免疫学：实验2 凝集反应(ABO血型测定)
实验目的:
检测血清标本中有无HBsAb
材料:
48孔ELISA板
阳性对照血清（HBsAb） 阴性对照血清 酶标二抗
乙肝病毒表面抗体 诊断试剂盒
洗涤液
底物A和B
微量加样器，待测血清标本等
实验方法
微孔板已包被HBsAg
HBsAg
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
+ + — — ① ① ① ① ② ② ② ②A + + — — ③ ③ ③ ③ ④ ④ ④ ④B + + — — ⑤ ⑤ ⑤ ⑤ ⑥ ⑥ ⑥ ⑥C + + — — ⑦ ⑦ ⑦ ⑦ ⑧ ⑧ ⑧ ⑧D
实验结果
颜色变化或OD（吸光度）值
酶标板
酶标仪
加样
+-1 2 3456
每孔加 50μl 不同的血清样本 Positive control (HBsAb) ：1 滴 Negative control (NS): 1 滴
加样
+
- sample
加酶结合物
enzyme
每孔加酶结合物1滴 混匀， 37 ℃ 30 min.
ELISA(酶联免疫吸附试验) 凝集反应(ABO血型测定)
凝集反应
原理:
颗粒性抗原与相应抗体发生特异性结合，并 在一定条件下形成肉眼可见的凝集物。
应用：检测未知Ag或Ab
分类：
1.直接凝集反应： 玻片法---ABO血型鉴定、菌种鉴定
试管法---肥达反应
2.间接凝集反应
ABO血型测定
实验目的: 检测待测者ABO血型
材料: 抗A和抗B血清, 生理盐水, 载玻片, 采血针等.
实验方法
实验2 凝集反应-ELISA(双抗原夹心法)
贵阳医学院免疫学教研室
精选2021版课件
1
实验内容
1、ABO血型鉴定--玻片凝集反应（1份/1人） 2、乙型肝炎病毒表面抗体检测--ELISA法(1份/1人）
精选2021版课件
2
（一）玻片凝集反应
已知抗血清与未知颗粒性抗原置于 清洁玻片上，在一定的条件下，若两者 相对应，则会发生凝集。本方法主要用 于抗原的定性分析，如菌种鉴定、ABO 血型鉴定等。
O
AB
型
型
精选2021版课件
6
注意事项
➢用牙签研磨时，注意防止将抗A血清带到抗 B血清中，反之亦然。
➢如果凝集现象不太明显时，可用显微镜观察。
精选2021版课件
7
乙型肝炎病毒表面抗体的检测 ——双抗原夹心ELISA法
测定原理
采用纯化乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg） 包被反应板，加入待检标本，当标本中存在抗HBs时，该抗体与包被HBsAg结合，再加入辣根 过氧化物酶标记乙型肝炎病毒表面抗原 （ HBsAg –HRP），最后形成HBsAg-抗HBs-酶 标记抗原复合物，加入底物产生显色反应。
精选2021版课件
3
ABO血型系统
精选2021版课件
4
ABO血型鉴定步骤
红细胞悬液的制备（用于血型鉴定及ELISA实验） 1. 取EP管1支，加入5滴生理盐水 2. 消毒耳垂或手指皮肤 3. 用采血针采1-2滴血，加入盛有生理盐水的EP管中混匀 4. 2000rpm，离心3min
取上清用于ELISA实验
5. 取红细胞悬液用于ABO血型鉴定 6. 取已加有抗A血清与抗B血清载玻 片1张，分别加入待测抗原各1滴， 并用牙签混匀。 7. 置室温5 分钟左右观察结果。
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【 步 骤 】
无菌采血，离心2000rpm,3min，取上清作为待测标本(见玻片凝集实验) 反应板中各加入待测标本2滴，同时设阴性、阳性、空白对照孔(NS) （反应板已用纯化HBsAg包被 ） 每孔加入酶标记抗原1滴，37℃孵育30min 手工洗板，弃液拍干，重复5次 每孔加入显色剂A液、B液各1滴，置37℃孵育15分钟 每孔加入终止液1滴，混匀 目测法：与阳性和阴性对照比较，观察颜色深浅判断结果
3
ABO血型系统
4
ABO血型鉴定步骤
红细胞悬液的制备（用于血型鉴定及ELISA实验） 1. 取EP管1支，加入5滴生理盐水 2. 消毒耳垂或手指皮肤 3. 用采血针采1-2滴血，加入盛有生理盐水的EP管中混匀 4. 2000rpm，离心5. 取红细胞悬液用于ABO血型鉴定 6. 取已加有抗A血清与抗B血清载玻 片 1张，分别加入待测抗原各 1 滴， 并用牙签混匀。 7. 置室温5 分钟左右观察结果。
9
10
实验报告
玻片凝集反应-ABO血型鉴定
酶联免疫吸附试验（双抗原夹心ELISA）
5
ABO血型鉴定的判断
抗A型标准血清 抗B型标准血清 抗A型标准血清 抗B型标准血清
B 型 A 型
示 意 图
抗A型标准血清 抗B型标准血清 抗A型标准血清 抗B型标准血清
O 型
AB 型
注意事项
用牙签研磨时，注意防止将抗A血清带到抗 B血清中，反之亦然。
如果凝集现象不太明显时，可用显微镜观察。
免 疫 学 实 验 课
贵阳医学院免疫学教研室
1
实验内容
1、ABO血型鉴定--玻片凝集反应（1份/1人） 2、乙型肝炎病毒表面抗体检测--ELISA法(1份/1人）
2
（一）玻片凝集反应
已知抗血清与未知颗粒性抗原置于 清洁玻片上，在一定的条件下，若两者 相对应，则会发生凝集。本方法主要用 于抗原的定性分析，如菌种鉴定、ABO 血型鉴定等。
7
乙型肝炎病毒表面抗体的检测 ——双抗原夹心ELISA法
测定原理 采用纯化乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg） 包被反应板，加入待检标本，当标本中存在抗HBs时，该抗体与包被HBsAg结合，再加入辣根 过氧化物酶标记乙型肝炎病毒表面抗原 （ HBsAg –HRP），最后形成HBsAg-抗HBs-酶 标记抗原复合物，加入底物产生显色反应。