实验五 凝集反应—医学免疫学实验指导
免疫学实验-凝集试验
实验一凝集试验颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。
参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。
细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。
抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。
根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。
凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。
[目的要求]1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。
2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。
3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。
[材料与试剂]1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。
2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。
3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。
4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]（一）试管凝集试验以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。
1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。
如被检血清有多份，对照只需做1份。
2. 被检血清稀释：第1管加入2.3ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5 ml弃之，再吸取0.5 ml加入第2管中，混匀后吸取0.5 ml加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml（见表1-1）。
免疫学实验-凝集试验
实验一凝集试验颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。
参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。
细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。
抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。
根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。
凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。
[目的要求]1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。
2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。
3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。
[材料与试剂]1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。
2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。
3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。
4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]（一）试管凝集试验以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。
1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。
如被检血清有多份，对照只需做1份。
2. 被检血清稀释：第1管加入2.3ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5 ml弃之，再吸取0.5 ml加入第2管中，混匀后吸取0.5 ml加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml（见表1-1）。
实验五凝集反应-医学免疫学实验指导
医学免疫学实验指导实验五凝集反应由长沙达尔锋生物科技有限公司整理【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。
BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。
BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。
BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。
【实验目的】1.了解凝集反应的原理、基本类型及其用途。
2.熟悉玻片凝集试验、试管凝集试验、间接凝集试验的实验方法和结果分析。
【实验用品】1. 材料试剂：伤寒杆菌、大肠杆菌18～24小时琼脂斜面培养物、伤寒杆菌H血清、伤寒杆菌H菌液、待测孕妇尿液、HCG阳性孕妇尿液、1:10稀释伤寒杆菌诊断血清、ABO血型标准血清、类风湿免疫诊断试验（用变性IgG致敏的乳胶颗粒）、HCG致敏乳胶试剂、兔抗HCG诊断血清、待测血清、生理盐水。
2.器材：洁净载玻片、巴氏吸管、乳胶皮头、接种环、酒精灯、特种铅笔（或记号笔）、小试管、牙签、采血针、75%酒精棉球、无菌干棉球、试管架；1ml、5ml刻度吸管、37℃恒温箱（或37℃/56℃水浴箱）、显微镜。
【内容和方法】一、玻片凝集试验(slide agglutination)1.原理玻片凝集试验(slide agglutination)是将已知的抗体直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌、立克次体、钩端螺旋体等)混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。
此法属定性试验，主要用于检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定和分型等。
皖南医学院：医学免疫学(实验指导)
医学免疫学实验指导皖南医学院微生物学免疫学教研室2004年12月实验室规则实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段，为保证实验效果，同时避免病原微生物的实验室内传染，保障实验操作者的安全，特制定如下规则：一、尽量不带个人生活、学习用品入实验室，必要的用具带入后，应放在远离操作的位置。
二、进入实验室后穿上工作衣，离室时脱下反叠带走。
在实验室内应保持安静、整洁、有秩序，不得高声谈笑，随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。
三、实验室内严禁吸烟、进食、饮水，严禁用嘴吸移液及润湿标签，尽量不要用手触摸头面部及身体其他暴露部位。
四、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情况，应立即报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。
五、被污染过且需要回收的吸管、滴管、试管、玻片等物应用完后立即投入已准备的消毒液中，不得放在桌面上或水槽内。
六、爱护公物，节约试剂材料，不得将实验室任何物品私自带走。
如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。
七、实验完毕，整理桌面，值日生打扫室内卫生，最后离开的同学应注意关好水电、门窗，洗手后离室。
第一单元体外抗原抗体反应实验目的掌握体外抗原抗体反应的特点和影响因素；掌握经典的体外抗原抗体反应的原理、方法和应用。
凝集反应基本原理颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合而出现肉眼可见的凝集现象。
实验一直接凝集反应一、玻片凝集试验（一）血型鉴定目的掌握玻片凝集反应的原理和应用；熟悉ABO血型的鉴定方法。
原理将已知标准抗A和抗B血型抗体分别与待测红细胞混合。
如果抗原与抗体相对应，则引起红细胞凝集，反之则不凝集，据其凝集现象可判断血型。
材料1、标准的抗A和抗B单克隆抗体（抗A为蓝色，抗B为黄色）2、酒精棉球、采血针、生理盐水、试管、滴管、载玻片、蜡笔。
方法1、酒精棉球消毒耳垂或手指末端后，用采血针刺破皮肤，取1—2滴血放入盛有0.5ml生理盐水的试管中，混匀制成红细胞悬液。
凝集反应实验报告
凝集反应实验报告凝集反应实验报告一、实验目的：1.学习和掌握凝集反应的原理和方法；2.通过实验观察和比较不同试剂对凝集反应的影响，了解其机理；3.为其他相关实验提供基础。
二、实验原理：凝集反应是在液相中两种相互斥的被测物质发生反应后聚集在一起的反应，其中一种物质是不溶于水的，通常用细胞、凝集素、血清球蛋白等代表。
凝集反应有两种类型，一种是相对化学反应速度较慢的胶体颗粒偶联，如奶与醋的反应；另一种是相对生物体速度较快的免疫凝集反应，如抗原与抗体的反应。
三、实验过程：1.准备6个试管，分别标注为A、B、C、D、E、F；2.取相同量的胶体悬液分别加入到试管A、B、C；3.向试管A中加入适量的盐溶液，轻轻摇匀并观察结果；4.向试管B中加入适量的碱溶液，轻轻摇匀并观察结果；5.向试管C中加入适量的酸溶液，轻轻摇匀并观察结果；6.在试管D中加入胶体悬液和盐溶液，轻轻摇匀并观察结果；7.在试管E中加入胶体悬液和碱溶液，轻轻摇匀并观察结果；8.在试管F中加入胶体悬液和酸溶液，轻轻摇匀并观察结果；9.记录观察到的现象。
四、实验结果：1.试管A中加入盐溶液后，观察到胶体悬液凝结成块；2.试管B中加入碱溶液后，观察到胶体悬液保持原样，并无明显变化；3.试管C中加入酸溶液后，观察到胶体悬液分散更加均匀；4.试管D中同时加入胶体悬液和盐溶液后，观察到胶体悬液凝结，但形成的块状较小；5.试管E中同时加入胶体悬液和碱溶液后，观察到胶体悬液分散更加均匀；6.试管F中同时加入胶体悬液和酸溶液后，观察到胶体悬液分散更加均匀。
五、实验讨论：1.根据实验结果可知，盐溶液能够引起胶体悬液凝结，而碱溶液则几乎不产生明显作用，酸溶液则能够使胶体悬液分散更加均匀；2.在试管D中同时加入胶体悬液和盐溶液后，观察到凝结的块状较小，可能是因为盐溶液的存在使凝结速度变慢，导致形成的凝结块较小；3.在试管E中同时加入胶体悬液和碱溶液后，观察到胶体悬液分散更加均匀，可能是因为碱溶液的存在使胶体颗粒电荷减少，从而增加了排斥力，使胶体悬液更加分散；4.在试管F中同时加入胶体悬液和酸溶液后，观察到胶体悬液分散更加均匀，可能是因为酸溶液的存在使胶体颗粒电荷增加，从而增加了排斥力，使胶体悬液更加分散。
医学免疫学检验-凝集反应PPT优选课件
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一、凝集反应的概念及特点
定义：细菌，螺旋体，红细胞等颗粒性 抗 原,或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合 成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原） 发生特异结合，在适当电解质存在下，形成 肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应 （agglutination)。 反应的两个阶段：1）抗原抗体的特异性结合 阶段，2）出现肉眼可见的凝集现象。
直接Coombs试验 检测红细胞上的不完全抗体
间接Coombs试验 检测游离在血清中的不完全抗体
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特点：抗原抗体反应既可以在体内作为 体液免疫应答的效应机制自然发生，也 可以在体外作为免疫学试验的结果而出 现，体外实验的抗原抗体反应称为血清 学反应（serological reaction).
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二.直接凝集反应
定义：细菌、红细胞等颗粒性抗原在适量电解 质的参与下，直接与相应抗体结合，出现肉眼 可见的凝集现象，该反应中的抗原称为凝集原 （agglutinatinogen)，抗体称为凝集素 （ agglutinin)。 一）玻片凝集试验（ABO血型鉴定）；二） 试管凝集试验（肥达试验）。
缘皱缩成花边状
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自身红细胞凝集试验
医学免疫学：第五章(2) 凝集反应
第五章（2）凝集反应Chapter 15 Agglutination Test第一部分教学内容和要求一、目的要求·掌握：凝集反应的原理、类型及临床应用；熟悉：凝集反应的技术要点、实验影响因素、方法评价、间接凝集常用的载体；了解：凝集反应各阶段的特征。
二、教学内容1。
凝集反应的特点与类型。
2。
直接凝集反应：玻片凝集试验，试管凝集试验。
3。
间接凝集反应：间接凝集反应的类型，间接血凝试验，胶乳凝集试验，间接凝集试验的临床应用。
4．自身红细胞凝集试验。
5．抗球蛋白试验。
第二部分测试题一、选择题（一）单项选择题（A型题）1．直接抗球蛋白实验用于检测A．血清中结合的抗体B．血清中游离的不完全抗体C．红细胞表面结合的不完全抗体D．红细胞表面结合的完全抗体E．血清中游离的完全抗体2．玻片凝集实验A．只能检测抗原，不能检测抗体B．既能检测抗原，又能检测抗体C．只能检测抗体，不能检测抗原D．为半定量实验E．不能用于ABO血型鉴定3。
下列哪一项不属于玻片凝集试验A。
菌种鉴定 B。
血清学分型 C。
人类ABO血型鉴定D．定量检测前筛选试验 E。
血清抗体效价测定4.试管凝集试验的效价判断标准是依据出现肉眼可见的如下凝集现象A．“+”B．“+或++”C．“++”D．“+++”E．“++++”5．间接抗球蛋白实验用于检测A．血清中结合的抗体B．血清中游离的不完全抗体C．红细胞表面结合的不完全抗体D．红细胞表面结合的完全抗体E．血清中游离的完全抗体6．协同凝集试验所用的载体是A．新鲜红细胞B．洗涤红细胞C．醛化红细胞D．聚苯乙烯颗粒E．金黄色葡萄球菌7．自身红细胞凝集试验红细胞是A．标准新鲜红细胞B．标准洗涤红细胞C．标准醛化红细胞D．受检者未致敏红细胞E．受检者致敏红细胞（二）多项选择题（X型题）1．实验中,促进凝集现象的措施有A．低温离心 B．增加电解质或蛋白质 C．加入右旋糖酐或葡聚糖D．用胰酶处理 E．加入抗原2。
免疫学实验凝集试验
+＋＋＋：１0０％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底,振荡时,沉淀物呈片状、块状或颗粒状。
＋＋＋:75％抗原凝集,上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与１00％凝集时相同,只是上清液稍浑浊)。
细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向,在电解质（如生理盐水)参与下，由于离子的作用,中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。
凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。
[目的要求]
１. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。
2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。
３． 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。
[材料与试剂]
１. 玻板,载玻片,试管(1cｍx8cm）,试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。
(二)布氏杆菌病平板凝集试验
1． 加血清:取洁净玻板一块,用蜡笔划成方格（4cｍ2)，并注明被检血清号码，以１00L微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内,第l格8０Ｌ、第2格40Ｌ、第3格20L、第4格1０L。血清用前需放室温,使其温度达2０℃左右。每一份检样需换一个ｔiｐ头。
临床免疫学检验-第五章凝集反应和沉淀反应
Radial Immunodiffusion (RID)
Two methodologies of RID
Fahey method A linear relationship
exists between the log of the protein concentration and the diameter of the precipitin ring prior to equivalence (or completion)
FIGURE 6-5 Diagrammatic representation of radial & double immunodiffusion. : precipitation reactions in gels yield visible precipitin lines; no visible
Ability of a test to correctly identify individuals who HAVE a given disease/condition
How likely is the test to detect the presence of a characteristic in someone with the characteristic?
简单易行 特异性好 灵敏度低(10µg/ml) 时间长
免疫电泳技术
免疫电泳技术（immunoelectrophoresis technique）是可溶性抗原和抗体在直流电场 的作用下，在凝胶内加速定向运动，彼此相 遇结合，在比例合适处形成可见的沉淀物。
免疫电泳技术
实验五 凝集反应—医学免疫学实验指导
医学免疫学实验指导实验五凝集反应由长沙达尔锋生物科技有限公司整理【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。
BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。
BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。
BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。
【实验目的】1.了解凝集反应的原理、基本类型及其用途。
2.熟悉玻片凝集试验、试管凝集试验、间接凝集试验的实验方法和结果分析。
【实验用品】1. 材料试剂：伤寒杆菌、大肠杆菌18～24小时琼脂斜面培养物、伤寒杆菌H血清、伤寒杆菌H菌液、待测孕妇尿液、HCG阳性孕妇尿液、1:10稀释伤寒杆菌诊断血清、ABO血型标准血清、类风湿免疫诊断试验（用变性IgG致敏的乳胶颗粒）、HCG致敏乳胶试剂、兔抗HCG诊断血清、待测血清、生理盐水。
2.器材：洁净载玻片、巴氏吸管、乳胶皮头、接种环、酒精灯、特种铅笔（或记号笔）、小试管、牙签、采血针、75%酒精棉球、无菌干棉球、试管架；1ml、5ml刻度吸管、37℃恒温箱（或37℃/56℃水浴箱）、显微镜。
【内容和方法】一、玻片凝集试验(slide agglutination)1.原理玻片凝集试验(slide agglutination)是将已知的抗体直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌、立克次体、钩端螺旋体等)混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。
此法属定性试验，主要用于检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定和分型等。
临床免疫学和免疫检验第五章凝集反应讲义
临床免疫学和免疫检验第五章凝集反应讲义第五章凝集反应细菌、红细胞等颗粒抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。
第一节凝集反应的特点凝集试验是一个定性的检测方法，即根据凝集现象的出现与否判定结果阴性或阳性；也可进行半定量检测，即将抗体作一系列稀释，与抗原结合产生凝集的最高稀释倍数作为其效价或滴度。
凝集反应分为两个阶段：①抗原抗体的特异性结合；②出现可见的颗粒凝聚。
第二节直接凝集反应一、原理细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。
参加凝集反应的抗原称凝集原，抗体则称为凝集素。
二、方法有玻片法和试管法两类。
（一）玻片凝集试验主要用于抗原的定性分析，短时间便能观察结果。
一般用来鉴定菌种或分型；也用于人类ABO血型的测定。
（二）试管凝集试验是用定量抗原悬液与一系列梯度倍比稀释的待检血清混合，保温静置后，根据每管内颗粒凝集的程度，以判断待检血清中有无相应抗体及其效价。
可以用来协助临床诊断或流行病原调查研究。
例如肥达试验、外斐试验、输血时也常用于受体和供体两者间的交叉配血试验。
第三节间接凝集反应一、原理间接凝集反应是将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象。
二、间接凝集反应的类型（一）正向间接凝集反应可溶性抗原致敏载体，用以检测标本中待测抗体的凝集反应，称为正向间接凝集反应。
（二）反向间接凝集反应特异性抗体致敏载体，用以检测标本中待测抗原的凝集反应，称为反向间接凝集反应。
（三）间接凝集抑制反应先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）混合，然后再加入抗原（或抗体）致敏的载体颗粒，则能抑制原先的凝集现象，称为正向（或反向）间接凝集抑制试验。
间接凝集抑制试验可用于检测抗体、自身抗体、变态反应性抗体，也可测定抗原。
免疫学基础--项目实训：凝集反应
十一、凝集反应
4 实验步骤--试管凝集反应 ➢ 试管凝集反应（以布氏杆菌为例) 第六步：结果记录法 ✔++++:液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底,振荡时，沉淀物呈片状 、 块状或颗粒状（即 100%的菌体被凝集)； ✔+++:液体略浑浊,菌休大部分被凝集于管底,振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗 粒 状(75%菌体被凝集)； ✔++:液体不透明，管底有明显凝集片，振荡时有块状或小片絮状物（50%菌体 被 凝集)。 ✔+:液体不透明,仅管底有少许凝集,其余无显著的凝集块(25%菌体被凝集)； ✔-:液体浑浊,管底无凝集,菌体不被凝集,但由于菌体自然下沉，在管底中央可见圆 点状沉淀,振荡后立即散开呈均匀浑浊；
十一、凝集反应
4 实验步骤--试管凝集反应 ➢ 试管凝集反应注意事项：
✔当每份待检血清仅用2个稀释度进行试验时，无论任何一个稀释度发生凝集现象,该 血清都应该用四个稀释度重检；
✔ 判定血清凝集价:出现“++”以上凝集现象的最高血清稀释度为凝集价。牛、马 和骆驼血清凝集价1:100 以上为阳性,1:50为可疑。猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价为1:50 以上为阳性,1:25可疑。
十一、凝集反应
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实训用品
药品：菌悬液、相对应的血清、生理盐水、PBS液（磷酸缓冲盐溶液）；
➢ 仪器及其它用具：试管、滴管、吸管、试管架、水浴锅。
十一、凝集反应
３ 实验步骤--平板凝集反应 ➢ 平板凝集反应（以布氏杆菌为例) 第一步：取洁净玻片一块,用玻璃铅笔划成五行小格,并标明待检血清的号码； 第二步：按下表滴加待检血清、抗原（将牛、羊、猪三型布氏杆菌悬浮于甘油浓盐水中， 加入煌绿及结晶紫制成)和生理盐水（检查绵羊、山羊血清时，用12%浓盐水)。 血清用前需放室温,使其温度达20℃左右；
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医学免疫学实验指导实验五凝集反应由长沙达尔锋生物科技有限公司整理【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。
BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。
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【实验目的】1.了解凝集反应的原理、基本类型及其用途。
2.熟悉玻片凝集试验、试管凝集试验、间接凝集试验的实验方法和结果分析。
【实验用品】1. 材料试剂：伤寒杆菌、大肠杆菌18～24小时琼脂斜面培养物、伤寒杆菌H血清、伤寒杆菌H菌液、待测孕妇尿液、HCG阳性孕妇尿液、1:10稀释伤寒杆菌诊断血清、ABO血型标准血清、类风湿免疫诊断试验（用变性IgG致敏的乳胶颗粒）、HCG致敏乳胶试剂、兔抗HCG诊断血清、待测血清、生理盐水。
2.器材：洁净载玻片、巴氏吸管、乳胶皮头、接种环、酒精灯、特种铅笔（或记号笔）、小试管、牙签、采血针、75%酒精棉球、无菌干棉球、试管架；1ml、5ml刻度吸管、37℃恒温箱（或37℃/56℃水浴箱）、显微镜。
【内容和方法】一、玻片凝集试验(slide agglutination)1.原理玻片凝集试验(slide agglutination)是将已知的抗体直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌、立克次体、钩端螺旋体等)混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。
此法属定性试验，主要用于检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定和分型等。
2.方法（1）取载玻片一张（平置实验台上），用特种铅笔或记号笔划分为3格，并标明1、2、3。
（2）取巴氏吸管一支，套上乳胶皮头后，吸取1:10 稀释的伤寒杆菌诊断血清1～2 滴于第1、2 格内，另取巴氏吸管一支，吸取生理盐水1～2 滴于第3格内。
（3）将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌，冷却后取少许伤寒杆菌菌培养物与第1、3格内的诊断血清、生理盐水混合并涂抹成均匀悬液。
然后用同样方法取少许大肠杆菌培养物与第2格内的的诊断血清混合并涂抹成均匀悬液。
静置数分钟后观察结果。
3.结果观察与判定如上述混合悬液由均匀混浊状变为澄清透明，并出现大小不等的乳白色凝集块者即为阳性（＋）；如混合物仍呈均匀混浊状则为阴性（－）。
如肉眼观察不够清楚，可将玻片置于显微镜下用低倍镜观察。
本次实验结果第1 格内应出现大小不等的乳白色凝集物（阳性），第2、3格内无凝集物，混合液仍呈均匀混浊状（阴性）。
【注意事项】（1）伤寒杆菌为肠道致病菌，在实验中务必严格无菌操作，遵守实验规则，用后的载玻片应立即投入指定的容器中，接种环必须做灭菌处理。
（2）取细菌培养物时，不宜过多，与抗血清混合涂抹时，必须将细菌涂散，涂均匀，但不宜涂得太宽，以免很快干涸而影响结果观察。
二、人类ABO 血型鉴定试验（玻片法）1.原理人类ABO血型抗原有A和B两种。
A型红细胞膜上有A抗原，B型红细胞上有B抗原，AB型有A和B两种抗原，而O型则不含有A和B抗原。
据此，如分别将抗A和抗B血清与待测红细胞混合，抗A和／或抗B血清与红细胞表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝集，根据其凝集状况便可判定受试者的血型（见表5-1）。
表5-1 血型鉴定试验结果与判定2.方法（1）用酒精棉球消毒无名指指端皮肤或耳垂，待酒精干后用无菌采血针刺破表皮，用毛细吸管取血1～2滴，放入含1m1 生理盐水的小试管中，混匀，即成待检红细胞悬液(约2％)。
取血后，应立即用无菌干棉球压迫针眼止血。
（2）取凹玻片或载玻片一张，用记号笔分为两格，并注明A、B字样。
（3）用巴氏吸管吸取抗A血清、抗B血清各一滴分别滴于A、B格内（也可用2ml的一次性注射器代替巴氏吸管）。
（4）另用巴氏吸管取待测5%红细胞悬液，于A格和B格内各加一滴。
然后分别用牙签将抗血清与红细胞搅拌均匀(也可轻轻晃动载玻片以促其充分混匀)，以加速其反应。
将玻片放置于实验台上静置数分钟后，在白色背景下观察凝集情况。
3.结果观察与判定如混合液由均匀红色混浊状逐渐变为澄清，并出现大小不等的红色凝集块者即为红细胞凝集；若混合液仍呈均匀混浊状，则表明红细胞未发生凝集。
如肉眼观察不够清楚，可将玻片置于显微镜下用低倍镜观察。
不凝集（-）凝集（+）4.注意事项（1）试验用凹玻片或载玻片要清洁，注明A 和B 字佯。
（2）所用抗A、抗B血清必须在有效期内(注意试剂包装说明的有效期限)使用。
（3）待检红细胞悬液不宜过稀或过浓。
（4）要及时观察结果，以防时间过长使标本干涸而影响结果观察和判定。
三、试管凝集反应1.原理试管凝集反应是一种定量试验，常用已知颗粒性抗原来检测未知抗体及其含量。
方法是用生理盐水将待测血清在试管中进行连续倍比稀释，然后于各管中加入等量已知抗原悬液，37℃过夜或56℃水浴2小时后，观察有无凝集并根据凝集程度，判定待检血清抗体的效价。
本法主要用于某些传染病的辅助诊断及流行病学调查，如伤寒、副伤寒及布氏杆菌病的诊断等。
2.方法（1）取洁净小试管8只并依次排列于试管架上，用特种铅笔或记号笔按顺序注明号码。
（2）将1ml刻度吸管套上乳胶皮头，吸取生理盐水0.9ml 加至1号试管，余下每管中分别加入0.5ml 生理盐水。
（3）用1ml刻度吸管取0.1ml抗伤寒杆菌“Ｈ”血清于第1管中。
（4）用1ml吸管在1号管内连续吸吹三次，使血清与生理盐水充分混匀，然后吸取0.5ml 加至2号试管，随后按上法进行倍比稀释直至7号试管，最后从7号管中吸出0.5ml混合液弃去。
至此，1～7号试管的血清稀释度依次为1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，而8号管中只有0.5ml生理盐水，此管系阴性对照管（见图5-1）。
（5）取5ml吸管吸取伤寒杆菌H菌液，加于1～8号试管中，各加0.5ml。
此时，每支试管中的液体量均为1ml，1～7号试管的血清最终稀释度分别为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280。
（6）持试管架轻轻振荡摇匀，以使血清与菌液混合均匀。
然后置37℃恒温箱过夜或56℃水浴箱2h，再观察结果。
图5—1 血清等倍稀释法图示3.结果与判定（1）对照管（第8管）：上清液混浊，管底有沉淀的物，如斜置试管可见其流动，若轻轻振荡便分散呈混浊状。
（2）试验管：按1-7号管依次观察。
如有凝集（此为阳性），可见管底有凝集块，平铺于试管底部，边缘向上卷曲或出现凝结颗粒，轻摇即升起，“H”菌液的凝集块呈絮状，液体上部澄清。
阴性者则与对照管（第8管）相同。
（3）凝集强弱的判定与记录。
++++：表示细菌全部凝集。
试管底部有大量凝集块，上清液澄清透明。
+++：表示绝大部分细菌凝集，凝集物较多或与++++相当，上清液澄清。
++：表示部分(约50％)细菌发生凝集，凝集物较少，呈颗粒状，上清液基本澄清。
+：凝集物很少，需仔细观察才能发现，上清液基本浑浊。
-：表示不凝集。
与阴性对照管相同。
（4）判定凝集效价(滴度)：以凝集物明显可见，且血清稀释度又最高的那一号试管的血清最终稀释度为血清效价。
4.注意事项（1）实验操作应认真仔细，如向试管内插放吸管宜轻，以免戳穿试管底；取货加样应准确；稀释血清时应仔细地逐管进行，以防跳管。
（2）观察结果时，最好不要振摇试管，以免凝集物摇散振碎而影响他人观察。
四、间接凝集试验1.原理本实验是将已知的可溶性抗原吸附或偶联在与免疫无关，有一定大小的颗粒性物质（载体颗粒）表面上，然后再与相应抗体混合，并在有适当电解质存在的条件下，由抗原抗体的特异性结合而发生肉眼可见的载体颗粒凝集。
该实验可用于细菌、病毒、钩体、梅毒螺旋体抗体，以及某些自身抗体（如抗核抗体、抗肾抗体、抗甲状腺抗体等0的检测。
可用作载体的物质有红细胞（如Rh-O型血红细胞、绵羊红细胞、兔红细胞等）、聚苯乙烯乳胶颗粒，活性炭以及硅酸铝颗粒等。
若所用载体为红细胞，即称间接血凝实验，如载体为乳胶颗粒，则叫间接乳胶凝集试验（见后述）。
2.方法（类风湿因子测定）（1）用生理盐水将待测血清稀释1:20。
（2）用巴氏吸管吸取1:20待测病人血清一滴于载玻片上，然后加一滴类风湿免疫诊断试剂。
（3）持玻片轻轻晃动使之充分混匀。
5分钟内出现均匀的乳白色凝集颗粒者为阳性，无凝集者为阴性。
3.注意事项应在5分钟内观察结果。
因放置过久可出现假阳性。
五、间接乳胶凝集抑制试验1.原理将待测样品与已知抗体混合作用一定时间后，再将其与相应抗原致敏的乳胶颗粒混合。
如待测样品中含有相应抗原，便可与加入的抗体结合，当再加入致敏乳胶颗粒后，就没有相应的抗体与乳胶颗粒表面的抗原结合而发生凝集，这就是乳胶凝集抑制试验（如图5-2）。
所以，不发生凝集者为阳性，表明待测样品中含有相应抗原；发生凝集者为阴性，提示待测样品中无相应抗原。
图5-2 间接凝集抑制试验本法主要用于检测抗原。
如乳胶妊娠试验，就是先将待测孕妇尿液（含有人绒毛膜促性腺激素，HCG)与已知抗HCG抗体作用，从而抑制了抗HCG与致敏乳胶颗粒表面上的HCG结合，于是乳胶凝集被抑制。
2.方法（见表5-2）（1）取凹玻片一张置实验台上，用标记笔划线分为三格，并注明甲、乙、丙。
（2）用巴氏吸管取生理盐水一滴加入乙格中，然后取待测孕妇尿一滴加在甲格中，另用巴氏吸管取HCG阳性孕妇尿一滴加在丙格中。
（3）于甲、乙、丙格中各加入一滴兔抗HCG血清。
分别用牙签将反应液充分搅拌均匀，静置30秒至1分钟。
（4）于甲、乙、丙格中各加入一滴HCG致敏乳胶试剂，分别搅拌均匀。
静置10分钟左右后观察结果。
表5-2 乳胶妊娠试验程序3.注意事项（1）所用诊断试剂必须是有效期内。
用前应充分摇匀。
（2）拌搅用的牙签不能共用。
（3）加样不宜过多，玻片应平置，以防两格之间反应液溢流相混。
（4）如肉眼观察不够清楚，可借助放大镜观察。
【实验报告与思考】1.记录玻片凝集实验的材料、方法、结果（最好用文字加图示），并讨论。
2.记录血型鉴定试验的材料、方法与结果。
3.记录试管凝集试验的材料、方法、结果及测定效价（可用表格方式表示）。
4. 记录类风湿因子乳胶凝集试验的材料、方法与结果。
试对结果作讨论分析。
5.记录乳胶妊娠试验的材料、方法、结果及判定。
试验结果予以分析讨论。