流式分选原理

流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技 术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、 单兊隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
分析型流式细胞仪 VS 分选型流式细胞仪
Calibur
AriaIII
Catch tuber （捕获管分选）
• 唯一可选配分选装置
的小型机。
合适样本类型
• 细胞大小一般不超过喷嘴孔径 1/5，绝不能超过1/3 • 建议无菌样本，容易维持上样针 部分的无菌条件
• 减少有高浓度PI的样本，以克残 留在管路内，影响后续样本活性
• 浓度可在107/ml • 一定要使用300-400目孔径过滤 网过滤
分选前
• 建议先进行预实验，调整实验设置，并丐预估回 收率，选择合适的样本量
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• Ficoll分离过的PBMC使用PBS+ 1% human AB serum 调整浓度到 1–2 x 107 PBMCs/mL
分选中
• 设门去除粘连体细胞
• 正确的分析 • 对于需要后续培养或是对于内毒素特别敏感的细 胞，建议完成无菌分选准备流程 • 选择合适的分选精度 • 选择合适的喷嘴孔径 • 选择合适的上样速度以保证纯度和得率
收集
• 收集管预先用human AB serum包被，然后加入 0.4 mL X-VIVO 15 培养液 + 10% human AB serum 及 0.2% acetylcysteine（用于培养）， 或是PBS + 1% Human AB serum（仅用于回测） • 选择合适的收集管，并调节分选液流加电，使得 分选液流尽可能打在培养基、PBS、血清的液面 上，而不是管壁 • 收集后的细胞，用250g,10分钟进行离心，小心 取上清，用于后续实验
提升活性
• 减少样本收集前后的处理过程，去除不必要的离 心和重悬
• 减少剪切力效应，轻柔使用移液枪
• 为减少细胞吸附到管壁，收集管使用聚丙烯材质， 并用100% human AB serum包被
• 分选中可暂停，轻柔混匀样本管和收集管，确保 细胞悬浮
分选后
• 分选后回测需要确保前后条件一致，确认进样针 管路无残留，回测样本无酚红
分选中
• 温度的改变对细胞不利，控制上样舱和收集 的温度
• 一些细胞需要特别的培养基或是血清来维持 活性，加入不超过2%的血清 • pH值的变化同样会对细胞活性有影响，加入 不超过25 mM的HEPES到收集管中有助于维 持pH • 样本的沉降容易导致速度的降低和细胞的聚 集，导致堵塞，样本分选前过滤，可使用混 匀功能或上样管过滤器，减少此类事件发生
Tips: 如何提升活力
• 无菌环境的控制
• 降低鞘液压力 • 增大喷嘴孔径，脆弱细胞必须要用大孔径喷嘴
• 包被样本收集管
• 温度控制
• 提升速度
流式分选仪的原理及应用
• 流式分选的原理
• 流式分选的影响因素
• 分选流程及注意事项
鞘液
• 必须使用盐离子缓冲溶液作为 鞘液，通常是PBS，不建议使 用生理盐水 • 特别需要维持合适的pH值， 通常为中性 • 无菌分选时，需要高压灭菌鞘 液（建议一直使用无菌鞘液） • 一般不加NaN3 • 注意更换鞘液过滤器
PSI Hz μm events/sec
分选最重要的问题
• Good Purity – 分选后所得到的细胞是否是想要的？ • Good Recovery – 分选后得到的细胞数量是否够用? • Good Viability – 分选后有多少细胞是活的？
Aria III — 高纯度 高得率
Sweet spot - 液滴断点自动监控 Accudrop - 液滴延迟自动调节 32等分液滴分辨率，精确分选模式
高纯度分选,来自于分析的精度
Aria III 液滴32等分分析
Yield Mask
Tips: 如何提升分选的纯度
• 设置合适的分选模式 • 选择合适的喷嘴孔径 • 确保稳定的液流断点 • 设置正确的drop delay
• 进行4路分选时，将纯度要求高的细胞分选设置在 最外的2路
• 减少样本的粘连 • 正确的设门 • 确保上样管路清洁后回测
BD FACSAriaIII流式 分选仪的原理及应用
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流式分选仪的原理及应用
• 流式分选的原理
• 流式分选的影响因素
• 分选流程及注意事项
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快 速、准确、客观，并丐能够同时检测直线流动状态中的单个 细胞的多项物理及生物学特性，加来自百度文库分析定量的技术。
高得率分选,来自于液流稳定性
Sweet Spot — 液滴断点自动监测
• 液滴断点监测窗口 • 振幅自动调节，维持断点稳定
• 阻塞报警，保护分选样本不受
污染，实现分选时无人看管 • 提高分选纯度和得率
高纯度分选,来自于精确地充电
Accudrop —— 液滴延时自动控制
• 丏利的BD Accudrop技术能够自动地精确确定液滴延迟时间（细胞 颗粒与激光正交的时间和细胞颗粒到达断点处的时间这两个时间的 间隔）, 保证最高的分选纯度及得率。 • 全部自动完成精确计算，无需手动调节，并可实时监测。
• 对于特别少的样本，容易显得杂质比较多
• 尽量将分选后细胞的洗涤过程减少到1次，并丐休 整数小时后再进行培养或是后续处理
分选后回测
仪器的维护保养
1、开液流和高压预热>30分 2、定期更换鞘液滤器（一年一次） 3、分选前检查Nozzle和O-ring
4、及时清洗放置Nozzle的部位和Nozzle Locking Lever
Purity and sort coincidence
• Purity is also maintained by detecting sort coincidence
Sort coincidence Two or more particles are too close together to be separated in two individual drops
5、检查和更换快速接头o-ring 6、使用PBS（不要使用生理盐水），PBS要过滤（0.2um）
仪器的维护保养
7、选择合适的喷嘴和压力 8、液流启动完，立刻用DI清洗Closed Nozzle ，定期超声 清洗Closed Nozzle
9、更换Pinch Valve 管道
10、定期对上样架上润滑剂 11、做CS&T质控 12、定期整理实验实验数据（Data Manage）
电子偏转的方式
流式分选仪的原理及应用
• 流式分选的原理
• 流式分选的影响因素
• 分选流程及注意事项
完美的分选
速度
纯度
得率
高速分选的影响因素
•鞘液压力（Pressure ) •振荡频率 (Drop Frequency) •喷嘴大小 (Nozzle) •上样速度(Sample Flow Rate )
Tips: 如何提升回收率
• 降低分选速度
• 减少纯度要求 • 正确的drop delay
• 正确的加电
• 合适的收集管
• 保护细胞活力
• 正确的设门
Aria III 对细胞的保护 — 高活性
影响细胞活性的因素： clean 1. 无菌处理 — Auto 1. 细胞本身状态 2. 圆滑管路设计
2. 细胞受到的撞击 3. NG流动池— 低功率激光照射 3. 激光照射 4. 电子减速 4. 细胞所处温度影响 5. 分选样本温控系统 5. 系统洁净程度 （4、25、37、42）