细胞凋亡检测试验方法

合集下载

细胞凋亡与检测原理

细胞凋亡与检测原理

细胞凋亡与检测原理细胞凋亡(apoptosis)是一种由体内分子机制调控的程序性死亡过程。

细胞凋亡对于维持身体健康和发展正常的组织功能至关重要。

它在多种生理和病理过程中发挥重要作用,包括胚胎发育、免疫监视和应答、细胞数量调节、损伤修复和肿瘤的发展等。

因此,对细胞凋亡的检测与研究对于了解细胞凋亡的机制和应用于治疗疾病具有重要意义。

细胞凋亡的检测可以通过多种方法和实验手段进行,下面将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法及其原理。

1.形态学检测法:细胞凋亡在形态上表现为细胞体积的缩小、细胞核染色质的凝结、细胞核的畸变和断裂等特征。

这些特征可以通过光学显微镜观察到。

常用的形态学检测方法有苏木精-伊红染色、核小体染色和电镜观察等。

2.核酸染色检测法:细胞凋亡过程中,细胞核内的DNA分子发生明显的断裂和畸变,这可以通过核酸染色荧光探针来检测。

常用的核酸染色方法有荧光染料染色、DNA单断链检测和TUNEL(转移酶介导的末端标记化反应)法等。

TUNEL法是最常用的细胞凋亡检测方法之一,它通过用荧光标记亲和剂连接到DNA断裂末端的3'-OH基团来检测细胞凋亡的程度。

3. 蛋白质检测法:细胞凋亡过程中,许多蛋白质的表达水平会发生明显变化。

比如,细胞凋亡会导致Bax、Caspase家族蛋白的活化和表达增加,而抑制凋亡的蛋白质Bcl-2则会下调。

因此,通过Western blot 和免疫组化等方法,可以检测细胞凋亡相关蛋白质的表达水平的变化。

4.流式细胞术:流式细胞术是一种通过光电探测器测定细胞数量和特征的方法。

流式细胞术可以通过筛选和排序上述染色体和蛋白质等特征,来确定细胞凋亡发生的程度和类型。

比如,通过测定细胞的细胞质内的卵磷脂翻转(PS)外露与细胞核DNA染色剂(如PI)结合的比例,可以鉴定凋亡细胞和坏死细胞。

细胞凋亡的检测原理是基于细胞凋亡的特征改变。

比如,形态学检测法通过观察细胞的形态学变化来鉴定细胞凋亡;核酸染色检测方法通过检测DNA断裂和畸变来判断细胞凋亡;蛋白质检测法则通过检测细胞凋亡相关蛋白质的表达水平变化来鉴定细胞凋亡。

细胞凋亡常用检测方法

细胞凋亡常用检测方法

细胞凋亡常用检测方法
以下是 6 条关于细胞凋亡常用检测方法的内容:
1. 哎呀呀,流式细胞术检测法你可不能错过呀!就好比在细胞的世界里,它像是一个超级侦探,能快速又准确地发现哪些细胞在凋亡呢!比如说,在研究一些疾病时,它就能帮我们搞清楚细胞的状态变化,神奇吧!
2. 嘿,还有形态学观察法哟!这就像是用一双敏锐的眼睛直接去看细胞凋亡后的模样变化,像那些凋亡小体啥的,都能被发现,就像在细胞的世界里寻找独特的线索一样,是不是很有意思呀!
3. 哇塞,DNA 片段化检测也超重要的呀!这就好像是去拆解细胞凋亡留下
的特殊“密码”,通过检测那些断裂的 DNA 片段,就能知道细胞是不是走上凋亡之路了。

比如在检测肿瘤细胞的时候,这可派上大用场啦!
4. 听我说呀,检测蛋白表达情况也是个好办法呢!就像是给细胞身上的蛋白做个标记,一旦细胞凋亡,这些蛋白就会有不一样的表现,这不就容易发现啦?好比在研究细胞的生命轨迹时,这能提供关键信息哟!
5. 哈哈,TUNEL 法也很厉害呢!它就如同给凋亡的细胞打上一个独特的“印章”,让它们无处可藏。

想象一下,在复杂的细胞群体中,一下子就能把凋亡的那些给找出来,多牛呀!
6. 哎哟哟,Annexin V 法也不能不提呀!它简直就是抓住细胞凋亡早期信号的高手,就像在细胞刚刚开始变化时就一把抓住,能及时发现呢!比如在研究某些药物对细胞的作用时,它就能大显身手啦!
总之,这些细胞凋亡常用检测方法都各有各的奇妙之处,它们可是我们探索细胞世界的得力工具呀!。

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,它在维持机体内稳态、发育和疾病发生中起着重要作用。

因此,准确、可靠地检测细胞凋亡是细胞生物学和生物医学研究中的重要课题。

本文将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法,希望能为相关研究提供一些参考。

首先,细胞凋亡的形态学特征是细胞体积缩小、细胞核浓缩、细胞膜破裂和细胞内出现凋亡小体等。

因此,通过显微镜观察细胞形态变化是最直观的方法之一。

在实验中,可以使用荧光染料(如荧光素酶、荧光素酶底物等)标记细胞核和细胞膜,然后观察细胞形态的改变。

这种方法简单直观,但不够精确,需要结合其他方法进行验证。

其次,细胞凋亡过程中,细胞内的DNA发生断裂和片段化,产生特征性的DNA ladder。

因此,DNA ladder检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。

实验中,可以通过DNA提取、电泳等技术,检测细胞内DNA的片段化情况。

这种方法对于凋亡细胞的检测比较准确,但需要较多的细胞样本和专业的实验操作技术。

另外,细胞凋亡过程中,细胞膜上的磷脂会外翻,暴露磷脂酰丝氨酸(PS)在细胞表面。

因此,PS外露检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。

实验中,可以使用PS结合蛋白标记或荧光染料标记PS,然后通过流式细胞术或显微镜观察PS的表达情况。

这种方法对于凋亡细胞的检测比较灵敏,但需要较为昂贵的试剂和设备。

最后,细胞凋亡过程中,细胞内的一些蛋白酶活性会发生改变,如半胱氨酸蛋白酶(caspase)的活化。

因此,caspase活性检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。

实验中,可以使用荧光染料标记caspase活性底物,然后通过荧光显微镜或流式细胞仪检测caspase的活化情况。

这种方法可以直接反映细胞内凋亡信号通路的活性,但需要较为复杂的实验操作和数据分析。

综上所述,细胞凋亡的检测方法多种多样,各有优缺点。

在实际研究中,可以根据具体的研究目的和条件选择合适的方法进行细胞凋亡检测。

希望本文介绍的方法能够为相关研究提供一些帮助,推动细胞凋亡机制的深入研究,为疾病的防治提供新的思路和方法。

tunel法检测细胞凋亡实验步骤

tunel法检测细胞凋亡实验步骤

tunel法检测细胞凋亡实验步骤细胞凋亡是一种重要的生物学过程,它在多种生理和病理情况下发挥着关键作用。

为了研究细胞凋亡的机制和调控,科学家们发展了多种方法来检测细胞凋亡。

其中一种常用的方法是使用tunel法。

本文将介绍tunel法检测细胞凋亡的实验步骤。

实验步骤如下:1. 细胞培养和处理我们需要选择一种适合的细胞系进行实验。

常用的细胞系有HEK293、HeLa和Jurkat等。

将细胞培养在含有适当培养基和补充物的培养皿中,并在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养至细胞密度适当。

在进行实验之前,需要根据实验设计的需要处理细胞。

例如,可以给予细胞不同的处理,如药物刺激、放射线照射或感染病毒等。

2. 固定细胞将处理后的细胞用适当的缓冲液进行固定。

常用的缓冲液有4%的乙醛或4%的甲醛等。

将缓冲液加入培养皿中,使细胞完全覆盖,并在室温下固定15分钟。

3. 洗涤细胞将固定的细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,每次5分钟。

洗涤的目的是去除固定液中的残留物质,以减少后续步骤中的非特异性背景。

4. 使细胞透膜使用蛋白酶K或蛋白酶XXIV等酶将细胞膜上的蛋白质降解,使细胞透膜。

将适量的酶加入细胞中,根据实验的需要,可以调整酶的浓度和作用时间。

一般来说,酶的浓度为20μg/ml,作用时间为30分钟。

5. tunel反应使用tunel试剂盒进行细胞凋亡检测。

tunel试剂盒中含有标记有荧光物质的dUTP,可以与DNA断裂的末端结合。

按照试剂盒说明书的要求,将tunel试剂加入细胞中,与细胞中的DNA断裂末端发生连接反应。

反应时间一般为1-2小时。

6. 洗涤和染色将反应结束后的细胞用PBS洗涤3次,每次5分钟。

然后,可以选择使用荧光染料(如DAPI)染色,以标记细胞核。

将染色液加入细胞中,孵育15分钟后再次用PBS洗涤。

7. 显微镜观察和图像获取将处理后的细胞放置在显微镜载玻片上,并使用合适的显微镜观察细胞。

可以调整显微镜的放大倍数和焦距,以获得清晰的图像。

【最新】凋亡细胞检测方法

【最新】凋亡细胞检测方法

【最新】凋亡细胞检测方法
众所周知细胞的凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式,根据死亡细胞,在形态学、生物化学和分子生物学上的差别,可以将二者区别开来。

细胞凋亡的检测方法有很多,下面我们来介绍以下几种我们常用的测定方法。

(一)细胞凋亡的形态学检测
根据凋亡细胞的一种固有的形态特征,人们已经设计许许多多不同的细胞凋亡形态学检测方法。

1光学显微镜和倒置显微镜
(1)未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。

贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

(2)染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。

凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割
成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

3透射电子显微镜观察
结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。

凋亡ⅰ期(pro-apoptosisnuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构;ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、
— 1 —
边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。

应广大用户的强烈要求,中国科学院生物化学与细胞生物学苏州研究院可提供细胞凋亡检测服务。

— 2 —。

检测细胞凋亡的三种流式方法

检测细胞凋亡的三种流式方法

检测细胞凋亡的三种流式方法细胞凋亡(apoptosis)是细胞自主性死亡的过程,是正常细胞发育和组织调控的重要途径。

为了研究细胞凋亡的机制和调控,科学家们发展出了许多方法来检测和定量细胞凋亡的发生。

其中流式细胞术(flow cytometry)是最常用的方法之一,根据不同的细胞特征和所需信息,可以有多种方法用于检测细胞凋亡。

下面将介绍三种常用的流式细胞术方法。

1. 荧光标记的Annexin V/PI双染法:Annexin V是一种细胞外结合蛋白,具有高度特异性结合细胞凋亡的特点。

当细胞凋亡发生时,磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞内翻转至细胞外,而Annexin V能够结合在PS上。

Propidium Iodide(PI)能够穿过损伤的细胞膜,结合到细胞核内的DNA分子上。

通过将Annexin V标记为绿色荧光染料,将PI标记为红色荧光染料,通过流式细胞术定量测量荧光信号的强度,可以区分出未凋亡细胞(Annexin V和PI双阴性),早期凋亡细胞(Annexin V阳性,PI阴性),晚期凋亡和坏死细胞(Annexin V和PI双阳性)等不同状态的细胞。

2.荧光标记的DNA碎片染色法:3. 荧光标记的Caspase活性检测法:Caspases是细胞凋亡过程中的关键酶,它们在给定的信号下被激活并参与调节细胞凋亡的执行阶段。

通过使用荧光标记的Caspase底物,如FLICA系列(Fluorochrome Inhibitor of Caspases)、CaspGLOW系列(Caspase-Glo Kits),可以测量细胞中Caspase的活性。

这些底物在被Caspase酶剪切后会释放出荧光信号,通过流式细胞技术可以测量荧光信号的强度。

由于Caspase活性与细胞凋亡过程密切相关,因此可以利用这些荧光标记底物来定量测量细胞凋亡的发生。

总结起来,流式细胞术是一种非常有效的方法用于检测细胞凋亡的发生。

Annexin V/PI双染法可以定量测量不同状态的细胞,DNA碎片染色法可以测量细胞凋亡的程度,荧光标记的Caspase活性检测法可以测量细胞中Caspase的活性。

简述细胞凋亡的检测方法

简述细胞凋亡的检测方法

简述细胞凋亡的检测方法
下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成,希望大家下载以后,能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改,请根据实际需要进行相应的调整和使用,谢谢!
Download Tip: This document has been carefully written by the editor. I hope that after you download, they can help you solve practical problems. After downloading, the document can be customized and modified. Please adjust and use it according to actual needs. Thank you!
细胞凋亡检测方法简述如下:
①形态学检测:利用光学显微镜、荧光显微镜乃至透射电子显微镜观察细胞形态变化,如细胞收缩、核染色质浓缩等。

②Annexin V标记:利用Annexin V与磷脂酰丝氨酸特异性结合的特性,荧光标记的Annexin V可检测早期凋亡细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸,结合PI可区分早晚期凋亡与坏死细胞。

③TUNEL染色法:检测细胞DNA断裂情况,通过标记末端脱氧核苷酸转移酶介导的DNA缺口,荧光显微镜下观察凋亡细胞的DNA片段化。

④Hoechst染色:使用荧光染料如Hoechst 33342染色细胞核,观察凋亡细胞核形态的改变,如浓缩、碎裂。

⑤DNA Ladder电泳:提取细胞DNA进行凝胶电泳,凋亡细胞DNA呈现特征性的梯状条带,反映DNA在核小体间的特定位置断裂。

细胞凋亡的六种检查方法

细胞凋亡的六种检查方法

细胞凋亡的六种检查方法一、引言细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,它在生物体的正常发育和疾病的发生中都起到了重要作用。

因此,对于细胞凋亡的检测方法也成为了科学家们关注的焦点之一。

本文将介绍六种常见的细胞凋亡检测方法。

二、TUNEL法TUNEL法是一种常见的检测DNA断裂和凋亡细胞数量的方法。

它利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)标记DNA断裂末端,并通过荧光或酶标记来检测。

操作步骤如下:1. 取出样品,并将其固定在载玻片上;2. 用缓冲液进行处理,使得DNA断裂末端暴露出来;3. 加入TdT和dUTP标记物,使得dUTP与DNA断裂末端连接;4. 洗涤样品,并加入抗dUTP抗体标记物;5. 洗涤样品,并观察荧光或颜色变化。

三、Annexin V染色法Annexin V染色法可以同时检测早期和晚期凋亡细胞。

它利用细胞表面磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)的变化,通过Annexin V结合检测细胞凋亡。

操作步骤如下:1. 取出样品,并将其固定在载玻片上;2. 加入Annexin V标记物,使得其与PIP2结合;3. 加入PI染色剂,使得细胞核染色;4. 观察荧光或颜色变化。

四、Caspase活性检测法Caspase活性检测法可以检测细胞内Caspase的活性水平,从而判断凋亡的程度。

操作步骤如下:1. 取出样品,并将其固定在载玻片上;2. 加入Caspase底物和缓冲液,使得Caspase底物被水解;3. 观察荧光或颜色变化。

五、DNA Ladder分析法DNA Ladder分析法可以检测DNA的断裂情况,从而判断凋亡的程度。

操作步骤如下:1. 取出样品,并提取其中的DNA;2. 用琼脂糖凝胶电泳分离DNA,并观察条带形态。

六、电子显微镜观察法电子显微镜观察法可以直接观察细胞的形态和结构变化,从而判断凋亡的程度。

操作步骤如下:1. 取出样品,并进行适当处理;2. 用电子显微镜观察细胞形态和结构变化。

七、总结以上六种方法是常见的细胞凋亡检测方法,每种方法都有其特点和优缺点。

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,它在维持机体内稳态和发育过程中起着关键作用。

因此,对细胞凋亡的检测方法研究具有重要意义。

在本文中,我们将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法,以及它们的优缺点和适用范围。

1. 形态学观察法。

形态学观察法是最早用于检测细胞凋亡的方法之一。

通过光学显微镜观察细胞形态的变化,如细胞体积缩小、胞质浓缩、核染色质凝聚和核小体形成等,来判断细胞是否发生凋亡。

这种方法简单直观,但不适用于高通量检测和定量分析。

2. DNA断裂检测法。

DNA断裂是细胞凋亡的一个显著特征,因此可以通过检测DNA 的断裂来判断细胞是否发生凋亡。

常用的DNA断裂检测方法包括凝胶电泳、TUNEL法和DNA断裂酶切法。

这些方法可以对凋亡细胞进行定量分析,但需要特殊仪器和试剂,操作较为复杂。

3. 蛋白质检测法。

细胞凋亡过程中,一些特定的蛋白质会发生变化,如Bcl-2家族蛋白、caspase家族蛋白等。

因此,可以通过检测这些蛋白质的表达水平或活性来判断细胞是否发生凋亡。

常用的蛋白质检测方法包括Western blot、免疫荧光染色和流式细胞术。

这些方法对于定量分析和高通量检测具有优势,但需要特异性抗体和专门仪器。

4. 细胞色素C释放检测法。

在细胞凋亡过程中,线粒体膜通透性增加,导致线粒体内膜空间的细胞色素C释放到细胞质中。

因此,可以通过检测细胞色素C的释放来判断细胞是否发生凋亡。

常用的方法包括免疫荧光染色和细胞色素C活性检测。

这些方法对于研究凋亡的机制和药物筛选具有重要意义。

综上所述,不同的细胞凋亡检测方法各有优缺点,研究者可以根据具体的实验目的和条件选择合适的方法。

随着生物技术的发展,新的细胞凋亡检测方法也在不断涌现,相信在不久的将来,会有更多更简便、灵敏的方法问世,为细胞凋亡研究提供更多的选择和可能性。

细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法

细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法

细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法:常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜进行定量或半定量的研究方法:各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳;二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法:琼脂糖凝胶电泳,形态学观察透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法,Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测,AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等;不能将二者区分开的方法:原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等;三、样品来源不同选择组织:主要用形态学方法HE染色,透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记,ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳;四、细胞凋亡检测1、早期检测:1 PS磷脂酰丝氨酸在细胞外膜上的检测2细胞内氧化还原状态改变的检测3细胞色素C的定位检测4 线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测:细胞凋亡晚期中,核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段;对于晚期检测通常有以下方法:1 TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记2 LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测3 Telemerase Detection 端粒酶检测3、生化检测:1典型的生化特征:DNA 片段化2检测方法主要有:琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记TUNEL等3TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记4通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP 多为dUTP间接或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果;可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测;4、LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少如活体组织切片时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化;通过LM-PCR,连上特异性接头,专一性地扩增梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段;此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较;如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成;上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征,但细胞受到其它损伤如机械损伤,紫外线等也会产生这一现象,因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰;需结合其它的方法来检测细胞凋亡;其它方法:1Telemerase Detection 端粒酶检测端粒酶是由RNA和蛋白组成,它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列,使细胞获得“永生化”;正常体细胞是没有端粒酶活性的,每分裂一次,染色体的端粒会缩短,这可能作为有丝分裂的一种时钟,表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号;研究发现,90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性;2mRNA水平的检测研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因,检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法;据报道,Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞cytotoxic T cells 等靶细胞;Bcl-2 和bcl-X 长的作为抗凋亡bcl-2 和bcl-X的调节物,它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活;用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确;通过检测fas, bax-alpha 和bcl-X 长的基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测; 5、细胞内氧化还原状态改变的检测:正常状态下,谷光苷肽GSH作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂;细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原;这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除;当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C三羧酸循环中的重要组分从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应;6、细胞色素C的定位检测细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用;正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆,结合Apaf-1 apoptotic protease activating factor-1后启动caspase级联反应:细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase; 7、线粒体膜电位变化的检测:1线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系2近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活,也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面;而一旦线粒体跨膜电位耗散,细胞就会进入不可逆的凋亡过程;3在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变,这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道PT孔道能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡;线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据:1若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温,并不导致细胞核的变化;但若将诱导生成PT 孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温,细胞核即开始凋亡变化;2形态学观察,看到细胞数目有限,统计学上的准确性受影响;3凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例;4流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化;用于流式细胞仪检测的染料:PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等,其中PI、Hoechst 最常用;PI和Hoechst33342双标:PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA或RNA结合;但是PI不能通过正常的细胞膜,Hoechst则为膜通透性的荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色;正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒;而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集; 故PI着色为坏死细胞;亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞;PI和Annexin-V双标:磷脂酰丝氨酸PS正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期或细胞损伤时PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中; Annexin-Vgreen可以和磷脂酰丝氨酸PS特异性结合;因此细胞处于调亡或坏死时,Annexin-V可为阳性早期的坏死细胞可能为阴性;但是只有坏死的细胞PI是阳性五、形态学观察1、普通光学显微镜观察2、透射电子显微镜观察3、荧光显微镜观察1、普通光镜下观察:1用苏木素-伊红HE染色:细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色凋亡细胞,正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失2Giemsa染色法、瑞氏染色法等,正常细胞核的色泽均一,凋亡细胞染色变深,坏死细胞染色浅或没染上颜色直接用倒置显微镜观察:1细胞体积变小,全面皱缩;2凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围;2、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩;细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样,部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体;3、荧光显微镜常用的荧光染料:丫啶橙、PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区;紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光;1PI双染色法基本原理Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用;Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高;DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色;碘化丙啶PI是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而将细胞核染红;因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来;注意事项:细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致;在分析结果时应该注意;六、细胞凋亡的分子生物学检测方法:细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段;然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180~200bp核小体DNA多聚体;DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法TUNEL;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色;低分子量的DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译nick translation,使低分子量的DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞;TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用;过氧化物酶标记测定法原理:脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛digoxigenin-11-dUTP在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合;在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察;毛地黄植物是地高辛的唯一来源;在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低;抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1%,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用;本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定;一试剂配制1、磷酸缓冲液PBS:磷酸钠盐50mM,NaCl 200mM;2、蛋白酶K200μg/ml,:蛋白酶K 0.02g;PBS 100ml;3、含2%H2O2的PBS缓冲液:H2O2 ;PBS缓冲液;4、TdT酶缓冲液新鲜配:Trlzma碱3.63g用HCl调节pH至,加ddH2O定容到1000ml;再加入二甲砷酸钠29.96g和氯化钴0.238g;5、TdT酶反应液:TdT酶32μl;TdT酶缓冲液76μl,混匀,置于冰上备用;6、洗涤与终止反应缓冲液:氯化钠17. 4g;柠檬酸钠8.82g;ddH2O 1000ml7、%二氨基联苯DAB溶液:DAB 5mg;PBS 10ml,, 临用前过滤后,加过氧化氢至%;8、%甲基绿:甲基绿0.5g;0.1M乙酸钠100ml;9、100%丁醇,100%、95%、90%、80%和70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶液,乙酸,松香水等;10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体ONCOR二实验步骤1、标本预处理:1石蜡包埋的组织切片预处理:将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5min;用无水乙醇洗两次,每次3min;用95%和75%乙醇各洗一次,每次3min;用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液20ug/ml,于室温水解15min,去除组织蛋白;用蒸馏水洗4次,每次2min,然后按下述步骤2进行操作;2冰冻组织切片预处理:将冰冻组织切片置10%中性甲醛中,于室温固定10min后,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min;置乙醇:乙酸2:1的溶液中,于-20℃处理5min,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;3培养的或从组织分离的细胞的预处理:将约5 × 107个/ml细胞于4%中性甲醛室温中固定10min;在载玻片上滴加50~100μl细胞悬液并使之干燥;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;2、色缸中加入含2%过氧化氢的PBS,于室温反应5min;用PBS洗两次,每次5min;3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液,置室温1~5min;4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加54μl TdT酶反应液,置湿盒中于37C反应1hr注意:阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液;5、将切片置于染色缸中,加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液,于37℃保温30min,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动;6、组织切片用PBS洗3次,每次5min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30min;7、用PBS洗4次,每次5min;8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的%DAB溶液,室温显色3~6min;9、用蒸馏水洗4次,前3次每次1min,最后1次5min;10、于室温用甲基绿进行复染10min;用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,最后1次静置30s;依同样方法再用100%正丁醇洗三次;11、用二甲苯脱水3次,每次2min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果;三注意事项一定要设立阳性和阴性细胞对照;阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本,阳性细胞对照可使用地塞米松1μM处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞;阴性对照不加TdT酶,其余步骤与实验组相同;一、吖啶橙简称AO荧光染色法原理:吖啶橙Acridine Orange是吖啶的衍生物之一;它是一种荧光染料,激发峰492nm,荧光发射峰530nmDNA,640nmRNA,它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间,而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上;在蓝光给502nm激发下,细胞核发亮绿色荧光约530nm,核仁和胞质RNA发桔红色荧光>580nm;吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光,但细胞固定阻抑了这种结合,从而主要显示DNA、RNA两种核酸;1试剂AO贮备液:AO 50mg分析纯蒸馏水 50ml4℃冰箱保存4个月;Tris缓冲液:Tris 50mmol/LMgCl2 LKCl 25mmol/LAO工作液:将AO贮备液10:1用蒸馏水稀释,再用Tris缓冲液将AO稀释到μg/ml的终浓度;2操作步骤①取乙醇固定的细胞悬液,浓度为107/ml,1500r/min,5分钟,弃乙醇;②加入2ml AO工作液,室温染10分钟;③滴在载玻片上,加缓冲甘油封片;④在荧光显微镜下用吸收波长405nm,发射波长530-640nm观察;结果:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体;二、Hoechst33258染色Hoechst33258为特异性DNA染料,,与A-T键结合,但在环境下则优先与RNA 结合,染色DNA时应调整染液的pH至,这种染料不溶于磷酸缓冲液;所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存;本方法是用于培养细胞、细胞涂片或细胞甩片;试剂及配制1Hoechst33258贮存液:称取Hoechst33258试剂1mg,用20ml蒸馏水溶解后,滤过,4℃避光保存;用时蒸馏水10倍稀释成染色液;2 ,;3封片液:20mmol/L柠檬酸,50mmol/L 磷酸氢二钠,50%甘油;4细胞固定液:甲醇/冰乙酸3:1,现配;操作方法1原代细胞培养、细胞学涂片或细胞甩片机制制备的单细胞片;2细胞固定液4℃固定5min;3蒸馏水稍洗后,点加Hoechst33258染色液,10min;4蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体;5封片剂封片后荧光显微镜观察;结果:在荧光显微镜下,活细胞核呈弥散、均匀荧光,坏死细胞不被Hoechst 染色;出现细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光及明显核形态变化,如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞;三、甲基绿-派诺宁染色法一原理细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态,但两者发生机制不同;细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程,需要有细胞内蛋白酶的激活,细胞质内常有mRNA表达的增强;而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程,细胞质内常有RNA的损失;根据这一特点,可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性,使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染,如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞,呈阴性染色者为坏死细胞;二试剂及配制1. 组织固定液无水乙醇 600ml氯仿 300ml冰醋酸 100ml2.甲基绿纯化新购买的甲基绿需用氯仿进行纯化处理以去除甲基紫;方法是将2%甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗,加入氯仿20ml充分,使其内的甲基溶于氯仿中而呈紫红色;旋动分液漏斗下部的砂塞,慢慢把下沉带比红色的氯仿移去,再加入新的氯仿10ml,如此反复更换氯仿,直到无紫红色为止;该液作为贮存液,4℃保存;3.染色液甲基绿贮存液 5ml5%派诺宁水溶液 1ml蒸馏水 12mlL乙酸钠 18ml临用前配制,滤纸过滤;三操作方法1.新鲜取材组织置固定液中4℃固定3-6h或培养细胞、细胞学甩片固定10min;2.直接转入95%乙醇脱水和无水乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋;3.切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化至蒸馏水;细胞学涂片不用梯度酒精4.置染色液中室温下染色约1h;5.取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液;6.插入丙酮中迅速分化;7.转入丙酮二甲苯1:1稍洗;8.二甲苯透明2-3次;9.中性树胶封固;四结果光学显微镜下凋亡细胞固缩,细胞核呈绿色或绿蓝色着染,胞质呈红紫色着染,坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染;观察时可用凋亡指数进行计数,即随机选择约10-20个视野每张切片约1000-2500个细胞,计数凋亡细胞百分率;四、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术TUNEL原理:在机体内部随时都在发生着细胞的死亡;传统上用显微镜来观察细胞的死亡,其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成;但是这种现象出现的很晚,时间也很短暂;凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活,细胞自身的染色质或DNA被切割,出现单链或双链缺口,并产生与DNA断点数目相同的3ˉ-OH 末端;末端脱氧核糖核酸转移酶Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT可以将地高辛标记的dUTPDIG-dUTP标记至3’-OH末端,DIG-dUTP核苷酸结合在DNA断点部位,可以通过生物标记的抗地高辛抗体Anti-DIG-Biotin反应后,再结合链酶亲和素-过氧化物酶SABC,然后加入显色底物DAB予以显示;凋亡的细胞核呈棕黄色,从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞;试剂1.标记缓冲液Labeling Buffer5×浓度的TdT反应缓冲液,含有以下成分:500mmol/L二甲胂酸钾;10mmol/L CoCl2 氯化钴1mmol/L DTT二硫苏糖醇2.末端脱氧核糖核酸转移酶TdT,×20×204.封闭液Blocking Reagent5.生物素化抗地高辛抗体×100×100×2008.抗体稀释液9. 多聚赖氨酸或APES;10. 0.01M TBS,配法:1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris和纯乙酸;11. DAB显色试剂;操作步骤1.样品处理1玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理;2细胞涂片和冰冻切片:最重要的是及时固定;用4%多聚甲醛/0.01M PBS室温下固定30-60分钟;0.01M PBS洗2分钟×2次;蒸馏水洗涤2分钟×2次; 3组织:有条件时应及时固定;常规4%多聚甲醛/0.01M PBS或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上,石蜡包埋;切片常规脱蜡入水脱蜡务必干净;2.新鲜配制3%H2O2,室温处理10分钟;蒸馏水洗涤2分钟×3次;3.标本片加0.01M TBS1:200新鲜稀释Proteinase K37℃消化5-15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次;细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10-60秒钟;新鲜石蜡切片消化5-10分钟;陈旧石蜡切片消化10-30分钟;4.标本片加标记缓冲液Labeling Buffer20μl/片,以保持切片湿润;按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl,加入18μl标记缓冲液中,混匀;甩去切片上多余液体后加标记液,20μl/片;置样品于湿盒中,37℃标记2小时;5.0.01M TBS洗2分钟×3次;6.加封闭液50μl/片,室温30分钟,甩掉封闭液,不洗;7.用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体:取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μl,混匀后50μl/片加至标本片上;置样品于湿盒中,37℃反应30分钟;0.01M TBS洗2分钟×3次;8.用抗体稀释液1:100稀释SABC:取1ml抗体稀释液加SABC10μl,混匀后50μl/片加至切片;37℃反应30分钟;0.01M TBS洗5分钟×4次;显色;10.苏木素轻度复染;脱水,透明,封片;显微镜观察;结果判定细胞核固缩有的呈碎片状,不规则,大小不一致,呈棕黄色颗粒者为阳性细胞; 即凋亡的细胞TUNEL改良方法在细胞凋亡检测中的应用.0M枸橼酸盐缓冲液、通透液%Triton-100、枸橼酸钠、标记缓冲液:二甲胂酸钠100mmol/L标记、二巯基苏糖醇L,氯化钴coci;TdT反应液;标记缓冲液中加TdT酶100U/ml,biotin-dUTP;链霉菌素标记的辣根过氧化物酶,蛋白酶K20μg/ml;显色剂氨乙基咔唑amino ethyl carbazole,AEC的配制AEC 20mg二甲酰胺DMF0.05M醋酸缓冲液 50ml%H2O2实验步骤1切片用冷风吹干后为防止冰冻切片脱片用1%火棉胶封片1分钟,PBS漂洗3×5分钟;23%H2O2阻断10分钟后PBS洗3×5分钟;3组织切片浸泡于盛有L枸橼酸盐缓冲液的烧杯中,置于微波炉内,在650W,辐射时间15min的条件下进行组织处理;冷却至室温;4放在通透液%Triton -100溶于%枸橼酸钠溶液中室温20分钟,PBS漂洗3×5分钟;5滴加50μl TdT反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟;6滴加50μl biotin-dUTP,反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟;7滴加50μl链霉菌标记辣根过氧化物酶液37℃孵育30分钟,8PBS漂洗3×5分钟, AEC-H2O2显色10-15分钟,苏木素复染用1%的酸性水分化,水洗、水溶性封片;阳性对照dTd 反应前用20μg/ml蛋白酶K处理切片;阴性对照用PBS代替dTd反应液; 结果判断及标准改良的方法:凋亡细胞核呈红色固缩,有白边集或碎列,细胞膜皱褶,有的卷曲和出泡,在计数时避开坏死区域,以避免假阳性;计数500个细胞中的凋亡细胞数目,得出凋亡百分率;凋亡染色分度如下:每个高倍视野平均1-3个为Ⅰ级;3-6个为Ⅱ级;6-10个为Ⅲ级;>10个者为IV级;阳性对照:经在dTd反应认前用20μg/ml蛋白酶,处理切片30分钟的切片同改良方法基本相同,但红色较浅;阴性对照:切片无棕色反应;评价正常的或正在增殖的细胞没有DNA的断裂,没有3’-OH末端被标记,因此镜下无显色的物质;这种分子生物学与形态学相结合的方法,可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行标记,准确反应细胞凋亡最典型的生物化学与形态学特征,灵敏度远远高于一般的组织化学和生物化学方法;在检测过程中,可设阴性对照不加TdT阳性对照已知的阳性标本;注意:AEC孵育切片,反应产物为红色;可用苏木精对衬染色,反应产物是纯酒精溶性的,因此;可用酸性水溶液分化,然后用水溶性封固剂封片;五、凋亡细胞:凝胶电泳检测前已提及凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核DNA的断裂;典型的细胞凋亡,在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段,而非典型的凋亡细胞,由于核内的DNA降解不完全,仅形成300~50kb的DNA大片;利用这一特性,可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况;试剂1. PBS缓冲液2. 消化液的配制:100mmol/L NaCl10mmol/L Tris-HCL25mmol/L EDTA%SDSml蛋白酶K3. 酚:氯仿:异戊醇混合液按25:24:1比例配制;4. 氯仿:异戊醇混合液按24:1比例配制;5. 醋酸铵,L;6. 100%和70%的乙醇;7. TE 缓冲液:100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA;8. TBE缓冲液;9. 电泳仪;。

细胞凋亡常见的检测方法

细胞凋亡常见的检测方法

细胞凋亡常见的检测方法
细胞凋亡常见的检测方法包括:
1. 细胞形态观察:细胞凋亡时,细胞会出现形态改变,如细胞体积减小、细胞核变小、细胞膜起泡等,可以通过显微镜观察细胞形态的改变来判断细胞是否发生凋亡。

2. 核染色观察:通过核染色技术,如单染色或双染色,可使用碘化丙啶、DAPI等荧光染料或Giemsa染色等方法,观察细胞核的形态和染色情况,从而判断细胞是否发生凋亡。

3. DNA损伤分析:通过DNA断裂、破碎等损伤的检测方法,如凝胶电泳分析、单细胞凝胶电泳分析、TUNEL染色等,可以检测细胞DNA的完整性,判断细胞是否发生凋亡。

4. 细胞膜的磷脂外翻:通过荧光标记磷脂的外露,如荧光标记的Annexin V结合细胞膜上翻暴露的磷脂,可以评估细胞凋亡程度。

5. 细胞色素C的释放:细胞凋亡时,线粒体膜破裂导致细胞色素C的释放,可以通过免疫荧光染色或Western blot等方法检测细胞色素C的定位及含量,来判断细胞是否发生凋亡。

6. caspase酶活性检测:Caspase酶是细胞凋亡过程的关键执行酶,通过检测Caspase活性、测定Caspase相关蛋白的水解活性,如Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等,可以判断细胞是否发生凋亡。

7. Annexin V/PI染色:通过Annexin V与细胞膜外露的磷脂结合,并使用胞内核酸染料PI进行双染色,可以实现对活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞的区分和定量。

细胞凋亡检测实验步骤大全(精华版)

细胞凋亡检测实验步骤大全(精华版)

细胞凋亡检测实验步骤大全(精华版)细胞凋亡检测实验步骤大全(精华版)
概述
细胞凋亡检测实验是一种用于研究细胞程序性死亡的方法。


文档旨在提供细胞凋亡检测实验的详细步骤,帮助您顺利进行实验。

实验准备
1. 准备所需材料:细胞培养基、培养皿、细胞培养器、实验药
物等。

2. 检查仪器和设备是否正常工作。

3. 消毒实验台和使用的器具,确保实验环境清洁。

细胞处理
1. 用适当的方法将细胞分离并制备成单细胞悬液。

2. 将细胞转移到培养皿中,根据实验需要将其培养至合适的生
长期。

实验组设计
1. 根据实验目的设计不同的实验组,如对照组和处理组。

2. 确定实验组的处理剂量和时间。

细胞凋亡检测方法
1. 选择合适的细胞凋亡检测方法,如荧光染料法、DNA断裂检测法等。

2. 按照所选方法的要求进行实验操作。

数据分析
1. 使用适当的方法和工具对实验数据进行分析。

2. 统计和比较各实验组的凋亡率或其他相关指标。

结果解释
1. 根据实验结果进行结果解释,并对实验结果进行讨论。

2. 结果解释可以包括细胞凋亡的程度、机制等方面的分析。

结论
总结实验结果,并提出可能的结论和展望。

参考文献
列出使用的参考文献以支持实验步骤和结果解释。

以上是细胞凋亡检测实验步骤的精华版大全,希望对您的实验有所帮助。

细胞凋亡的形态实验报告

细胞凋亡的形态实验报告

一、实验目的本实验旨在观察细胞凋亡的形态学特征,了解细胞凋亡的发生过程,为细胞凋亡的研究提供形态学依据。

二、实验材料1. 细胞培养:小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3细胞);2. 试剂:H2O2(双氧水)、Annexin V-FITC、PI(碘化丙啶)、RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液;3. 仪器:倒置显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪、超净工作台、CO2培养箱。

三、实验方法1. 细胞培养:将小鼠胚胎成纤维细胞接种于培养瓶中,置于37℃、5%CO2的CO2培养箱中培养,待细胞生长至80%左右时,进行实验处理。

2. 实验分组:(1)正常组:不做任何处理,作为对照组;(2)凋亡组:加入0.8mol/L H2O2溶液处理细胞24小时。

3. 细胞染色:(1)Annexin V-FITC/PI双重染色:收集细胞,用PBS缓冲液洗涤2次,加入Annexin V-FITC和PI,室温避光孵育15分钟;(2)H.E染色:收集细胞,用PBS缓冲液洗涤2次,加入H.E染色液,室温避光孵育15分钟。

4. 细胞观察:(1)荧光显微镜观察:用荧光显微镜观察细胞凋亡形态学特征,包括细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等;(2)流式细胞仪检测:用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

5. 数据分析:采用SPSS软件对实验数据进行统计分析。

四、实验结果1. 荧光显微镜观察:凋亡组细胞出现细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等形态特征,与对照组相比,凋亡组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。

2. 流式细胞仪检测:凋亡组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),约为对照组的2倍。

五、实验讨论1. 细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式,具有形态学特征,如细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等。

本实验中,凋亡组细胞出现这些形态特征,表明细胞凋亡已发生。

2. Annexin V-FITC/PI双重染色是一种常用的细胞凋亡检测方法,可以检测细胞凋亡率。

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测方法是利用特定的实验手段和技术来识别细胞凋亡的发生与否,观察细胞凋亡的程度。

细胞凋亡检测是生物过程中重要的一块,其能够反映细胞死亡的类型,从而可以帮助研究者确定细胞是否已经进入凋亡状态。

现在,细胞凋亡检测的常用方法有多样,包括水解酶活力分析、流式细胞术、免疫组化、细胞图像分析等。

1. 水解酶活力分析:水解酶活力分析法是目前使用最多的细胞凋亡检测方法,原理是以细胞内的水解酶活性(如肌酸激酶、核糖核酸酶)来反映细胞凋亡程度。

细胞凋亡检测方法将细胞悬液添加到活性检测液体,然后经过细胞溶解和脱水稀释后,细胞内的水解酶(如肌酸激酶或核糖核酸酶)就会被释放出来,测定其活力值。

通过比较正常细胞和凋亡细胞的活力值,可以判定细胞凋亡的程度。

2. 流式细胞术:流式细胞术是一种常用的检测细胞凋亡的方法,主要以细胞的DNA含量与形态特点作为检测凋亡的标志物。

通常,凋亡细胞的DNA含量要明显低于正常细胞,且凋亡细胞的形态特征也会发生明显的变化,比如大小、形状、酸性等。

3. 免疫组化:免疫组化是一种利用免疫细胞学技术检测细胞凋亡的方法,它主要是针对细胞凋亡伴随而出现的特定抗原,如多种酶、APO2.7及特有蛋白等。

通过洗涤细胞,并用带有特定抗原的抗体制作出免疫印迹,就可以观察到细胞凋亡的现象。

4. 细胞图像分析:这是一种以细胞形态及细胞图像分析来检测细胞凋亡的方法,主要是利用荧光显微镜或电子显微镜观察细胞,以及对被观察细胞的形态特点进行分析,根据细胞形态变化观察凋亡程度。

通过观察正常细胞与凋亡细胞的形态比较,便可以判断细胞是否进入凋亡状态。

上述是现时比较常用的细胞凋亡检测方法,它们都有一定的特点,可以根据不同的实验需求选择合适的检测方法。

然而,对于不同的细胞类型,其凋亡方式也可能会有所不同,可能需要使用不同的检测方法来进行识别细胞凋亡的发生与否。

因此,根据具体的实验,研究者可以选择合适的检测方法,配合研究凋亡发生机制,为研究凋亡提供科学依据。

细胞凋亡检测方法和实验标准

细胞凋亡检测方法和实验标准

细胞凋亡检测方法和实验标准常用的细胞凋亡检测方法1. DNA片段化检测DNA片段化是细胞凋亡的一个明显特征。

常用的DNA片段化检测方法包括:- 凝胶电泳:将凋亡细胞的DNA提取出来,通过凝胶电泳可以观察到DNA片段化的特征。

- TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP接头标记):使用TUNEL试剂可以标记凋亡细胞的DNA断裂端,通过显微镜观察可以检测到凋亡细胞的存在。

2. 细胞色素c释放检测细胞凋亡时,线粒体内的细胞色素c会释放出来。

常用的细胞色素c释放检测方法包括:- 免疫荧光染色:使用特定抗体标记细胞色素c,通过荧光显微镜观察可以检测到细胞色素c的释放情况。

- Western blotting:使用特定抗体检测细胞色素c的蛋白表达水平,可以间接判断细胞色素c的释放。

3. 细胞内和细胞外凋亡标志物检测细胞凋亡过程中会产生一些特定的标志物,可以用于凋亡检测。

常用的细胞内和细胞外凋亡标志物包括:- 单克隆抗体检测:使用特定抗体识别和检测细胞内和细胞外的凋亡相关标志物,如凋亡相关蛋白、凋亡相关受体等。

- 酶标记法:利用特定的酶标记物标记凋亡相关标志物,通过酶标仪测量酶的活性来判断凋亡的发生。

实验标准为了保证细胞凋亡检测的可靠性和精确性,在进行实验时应遵守以下标准:1. 样本准备:样本的准备应严格遵循实验方案,包括细胞培养、药物处理、提取样本等步骤。

同时,应采用质量控制措施,确保样本的一致性和可比性。

2. 试剂选择:选择具有高灵敏度和特异性的试剂,确保能够准确检测细胞凋亡的发生。

3. 方法验证:在进行细胞凋亡检测之前,应先进行方法验证和优化,确保所选择的方法可以准确、可重复地检测细胞凋亡。

4. 阳性和阴性对照:在每个实验中都应包括阳性和阴性对照,以确认实验结果的准确性和可靠性。

5. 数据分析:对实验结果进行准确的数据分析和统计处理,确保结果的可解释性和可靠性。

6. 结果报告:结果应准确、清晰地呈现,包括实验方法、样本信息、数据分析和统计结果等信息。

常用细胞凋亡检测方法

常用细胞凋亡检测方法

常用细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种基本的细胞程序性死亡过程,对于维护正常组织结构和功能发挥重要作用。

因此,准确检测凋亡是研究细胞生物学、药物作用以及疾病发生机制的关键。

以下是几种常用的细胞凋亡检测方法。

1.同步体细胞凋亡分析法同步体细胞凋亡分析法基于DNA片段化的原理,通过载荷量测定等手段评估细胞死亡。

其中,凝胶电泳法可以评估DNA的片段化,而在DNA降解过程中也会释放核酸碱基和低分子量的寡糖,可以通过典型的化学制剂检测其蓄积量。

2.DAPI染色法4',6-二胺-2-苯并咪唑(DAPI)是一种DNA特异性荧光染料,它可以与DNA结合并发射蓝色荧光。

细胞凋亡时,DNA会发生片段化并形成形态特异的核质凝块,称为凝胶体(GC)。

DAPI染色后,健康细胞呈现规则形状的核,而凋亡细胞则呈现出碎裂的DNA染色残基。

3.DNA碎片检测法DNA碎片检测法利用凋亡细胞释放到细胞外的DNA碎片,通过测量DNA浓度的改变以评估细胞凋亡。

可以通过比色法、荧光染料测量或特定酶的检测来定量DNA。

4. Annexin V-PI(propidium iodide)双荧光染色法Annexin V是一种能够选择性结合凋亡细胞的磷脂。

同时,PI可以穿透受损的细胞膜并与细胞核DNA结合。

所以,通过联合使用这两种染料,可以区分正常细胞、凋亡细胞以及坏死细胞。

5. TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)法TUNEL法是一种特异的DNA断裂终端标记法,它能够用于检测细胞死亡领域的DNA片段化。

具体而言,该方法依赖于终端脱氧核苷酸转移酶(TdT),它能够与DNA链上的未配对的碱基发生共价连接。

通过在DNA 链的断裂末端引入二脱氧尿嘧啶三磷酸(dUTP),再使用碱性棕榈酸蓝(APB)进行染色,TUNEL法可以在荧光显微镜下检测出碎片化的DNA。

细胞凋亡 凋亡小体检测

细胞凋亡 凋亡小体检测

细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡过程,通常包括细胞收缩、核形态改变、染色质凝聚和最终形成凋亡小体等特征。

检测凋亡小体是判断细胞是否正在经历凋亡的一种方法。

以下是一些常用于凋亡小体检测的技术:
1. 荧光显微镜观察:可以使用荧光染色剂,如荧光显微镜观察凋亡小体的形成。

例如,使用DNA染色剂,如DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)或者荧光标记的DNA结合染料,如Hoechst 33342,可以用来观察细胞核的变化。

2. 流式细胞仪:流式细胞仪是一种用于分析细胞的工具,可以通过流式细胞仪测定荧光标记的凋亡小体。

一些可用于凋亡小体检测的标记物包括荧光标记的DNA结合染料和特定的抗体。

3. 电镜观察:透射电镜可以提供高分辨率的图像,用于观察凋亡小体的超微结构。

这对于详细研究细胞内部的变化非常有用。

4. 凋亡小体DNA片段检测:凋亡小体形成通常伴随着DNA的断裂。

通过凝胶电泳或PCR等技术,可以检测到凋亡小体中的DNA片段,这也是一种常见的凋亡检测方法。

5. TUNEL染色法:终末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP辅助染色法(TUNEL)是一种用于检测DNA断裂的方法,可以通过荧光或酶标记观察。

选择适当的方法取决于实验的具体需求和可用的实验设备。

在实验设计和执行中,注意选择合适的控制组,确保结果的准确性。

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法tunel完成

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法tunel完成
TUNEL
TUNEL的原理 TUNEL的操作步骤 结果及注意事项
主要试剂
1. 缓冲液(Labeling Buffer):
用于维持一定的反应条件,含有以下成分:500mmol/L二甲胂酸钾、 pH7.2 10mmol/L CoCl2 (氯化钴)、1mmol/L DTT(二硫苏糖醇)。
2.末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT) :
TUNEL的原理是:用荧光素(fluorescein)标记的脱 氧核糖核苷酸,在TdT 的作用下连接到凋亡细胞中 断裂DNA的3’-OH末端,用荧光显微镜即可观察结 果。在此基础上连接辣根过氧化酶标记的荧光素抗 体,可进一步放大检测信号,并且普通显微镜观察 实验结果。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染 色。
TUNEL原理
标 ’-OH末端 dUTP反应的关键酶
3.荧光素-dUTP :
TdT的底物和本实验的标记物
4.蛋白酶K:
消化组织,增加细胞通透性
TUNEL的原理
凋亡细胞的特征是:内源性核酸内切酶被激活,细胞 自身的染色质DNA被切割,出现单链或双链缺口, 并产生与DNA断点数目相同的 3’-OH末端 。末端 脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT)能将脱氧核糖核苷酸连接到DNA 的3’-末端。
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
过程),导致凋亡特有的生化和形态学改变。
25
细胞凋亡涉及的共同通路

Caspase:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶,水 解底物天冬氨酸C端肽键,因此又称之为 Caspases(取英文Cysteine C,aspartic acid ,Asp ,proteases的词头)
26
27
Caspase家族的结构与分类
8
Tissue remodeling.
Sculpting the digits in the developing mouse paw by apoptosis.
Elimination of transitory organs and tissues.
The resorption of the tadpole tail at the time of its metamorphosis into a frog occurs by apoptosis.

1972年,Kerr,Wylle和Curry在许多正常组织 中观察到一种与经典的细胞坏死形态特征不同 的现象:细胞收缩、细胞碎片、散在不完整细 胞等,据此,他们首次提出apoptosis一词。 国内常译为细胞凋亡、细胞凋落、细胞凋谢、 细胞衰亡等,多数学者倾向于“细胞凋亡”。 强调这一过程是一种自然的生理学过程。
42
根据结构和功能分为两类: 抗凋亡/促增殖成员:包括 Bcl-2、 Bcl-xl 等。 机制:可阻止线粒体外膜通透化,从而阻止

细胞色素C的释放,抑制细胞凋亡。 促凋亡成员:包括Bid、Bim、Bad等“BH3only” 蛋白质和Bax、Bak、Bok等“多BH”蛋白质
机制:影响APAF1的功能 影响线粒体的结构与功能


有意义的是CAD只在ICAD存在时才能合成并显示活 性,因而ICAD对CAD的活化与抑制是必需的。
33
破坏细胞结构

Caspase可直接破坏细胞结构:如裂解核纤层 核纤层(Lamin)是由核纤层蛋白通过聚合作用而 连成头尾相接的多聚体,由此形成核膜的骨架结构,使 染色质(chromatin)得以形成并进行正常的排列。 在细胞发生凋亡时,核纤层蛋白作为底物被 Caspase裂解,从而使核纤层蛋白崩解,导致细胞染色 质的固缩。
细胞凋亡与细胞程序性死亡
细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)
PCD最初是1956年发育生物学中提出的概念,是个功能 性概念,一般指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物 体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的,并受到严 格程序控制的正常组成部分。 细胞凋亡和程序性死亡具有非常密切地关系。大多数 情况下程序性细胞死亡是以凋亡的方式进行,但并不是所 有的程序性死亡都采取凋亡的方式。
43
44
45

IAP(inhibitor
of apoptosis,细胞凋亡抑制因子)
IAP超家族的成员较多,共同的特征是含有一个 或多个70个氨基酸的重复序列(BIR),类似于 zinc指状的结构。 BIR功能域和之间的连接区域介导对caspase的 抑制作用,而环指状结构则具有泛素化蛋白连接酶的 作用,介导caspase-3和-7的泛素化降解作用。
☆ 细胞凋亡的研究是近年来生命科学中发展起来的 热点课题。早期基于形态学和生物化学,近期则是 基于分子生物学技术从基因调控、信号转导等方面 研究。
2
主要内容

细胞凋亡概述(基本概念、意义、
生物学特征、调节、信号传递等)


细胞凋亡与免疫生理 细胞凋亡与免疫病理 细胞凋亡的检测方法 细胞凋亡研究相关展望
37
切割Bid 线粒体途径
FasL/
/Fas
38
(3).死亡受体途径的调控机制

FLIP [FADD-like-IL-1β-convertingenzyme(FLICE) inhibitory protein]
近年发现的含DED的凋亡抑制蛋白 广泛存在于真核生物、哺乳动物细胞和病毒中 包括:病毒基因编码的FLIP(v-FLIP) 细胞FLIP(c-FLIP):c-FLIPS或c-FLIPL





功能:抑制Caspase8结合到DISC上,从而抑制 起始Caspase激活。
39
4.2 线粒体途径
(1).基本环节:



释放caspase活化因子 细胞色素C:细胞色素C+Apaf-1+ AIF(凋亡诱导因子) Caspase3
caspase9
凋亡体

Apaf-1:凋亡蛋白酶活化因子
特征 诱导因素 受累范围 膜完整性 细胞体积 染色质 细胞器 溶酶体 细胞形状 基因组DNA 大分子合成 基因调控 后果 意义
18
19
DNA 'ladder
endonucleolytic
DNA fragmentation nucleosome core histone
DNA
chromatin
180bp

细胞凋亡的生物学意义:
近年来对细胞凋亡的研究日渐重视,现代研究结果表明: 细胞凋亡不仅是认识细胞死亡过程的基础,而且在胚胎发 育、造血、免疫、乃至肿瘤形成中都有极为重要的作用。
1. 确保正常的生长发育(development ):清除无用 、多余的细胞。 2. 维持内环境稳定(maintenance of homeostasis) :清除受损、突变或衰老的细胞。 3. 发挥积极的防御功能(defense reaction):清除 病毒感染细胞等对机体有害的细胞。
28
Caspase家族的特点:

以酶原的形式存在,需要活化:
同源活化和异源活化,活化后形成四聚体
的蛋白水解酶,发挥生物学作用

C端同源区存在半胱氨酸激活位点
29
Caspase活化机制:

Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程,虽
然分子各异,但是它们活化的过程相似。

首先在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的
36
(2).死亡受体通路
FASL+FAS
受体多聚化 和构像改变
+FADD
死亡受体/配体 /FADD/Caspase8或10
凋亡诱导复合物(DISC) 胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上
细胞有足够caspase8 死亡受体活化, 细胞凋亡
细胞caspase8浓度不够 tBid从胞质到线粒体 CtyC 释放
细胞凋亡 与 免疫
1
引言
☆细胞凋亡是一种普遍存在的生物学过程 ,它与细
胞增殖、细胞分化都是最重要的生命现象,正是由 于细胞增殖、细胞分化、细胞调亡的相互联系、相 互制约的关系,才保证了生物体的正常发育。
☆正常凋亡过程受阻或某种原因所致不正常的细胞 凋亡,都会使机体出现病症。因此对细胞凋亡的研 究有助于某些疾病的阐明与治疗。



22
免疫相关的凋亡信号途径

死亡受体介导的信号途径


线粒体途径
颗粒酶B途径(CTL特有)
23
死亡受体通路、线粒体通路
24
细胞凋亡涉及的共同通路

其中膜受体和线粒体途径均通过激活含半胱氨 酸的天冬氨酸酶(Caspase)剪切胞内底物 ( Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应

ICE亚类Caspase蛋白酶:ICE是单核细胞来源的参
与成熟的一种蛋白酶,参与凋亡但不起主要作用;

Hale Waihona Puke Caspase1,Caspase4, Caspase5, Caspase11 Caspase12,Caspase13, Caspase14。 凋亡启动亚类Caspase蛋白酶(上游Caspase): Caspase8, Caspase2, Caspase 9,Caspase10。 凋亡效应亚类Caspase蛋白酶(下游Caspase): Caspase3, Caspase6, Caspase7
20
3. 细胞凋亡的诱导和抑制因素
物理性因子,包括射线(紫外线, 射线等),较温 和的温度刺激(如热激,冷激)等; 化学及生物因子:包括活性氧基团和分子,激素,细 胞生长因子,肿瘤坏死因子(TNF)等。 DNA和蛋白质合成的抑制剂等。
21
4.免疫相关的凋亡信号转导

接受凋亡信号
凋亡调控分子间的相互作用 蛋白水解酶(caspases)的活化 凋亡的级联反应




Morphological Changes (细胞生物学详讲) 第一阶段:胞体缩小与周围细胞失去联系,细胞器变 致密,核体积缩小,核仁消失,染色质浓集于核膜内 表面下,形成新月形致密小块。 第二阶段:染色体断裂,核膜与细胞膜均内陷,包裹 胞内成分(胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜)形成 “泡”样结构,此为“凋亡小体”。最后,整个细胞 均裂解成这种“小体”。 第三阶段:凋亡小体被邻近的巨噬、上皮细胞等识别、 吞噬、消化。上述三个阶段维持时间很短,通常在几 分钟、十几分钟内即可完成。
3

细胞凋亡概述
1. 基本概念及生物学意义:
凋亡(apoptosis)一词于1972年Kerr(英国阿伯丁 大学病理学教授)引入,是一个希腊语合成词,原意指 花瓣或树叶的自然脱落(Apo脱落+ptosis飘零 =Apoptosis)。
基本概念:细胞凋亡是一个“形态学”概念,是对细 胞超微结构观察的基础上得出的特指一种由基因控制、 形态学特征与坏死截然不同的自主性细胞死亡方式。

破坏细胞抗凋亡因素
破坏细胞结构 影响核酸的结构与功能

32
破坏细胞抗凋亡因素

正常活细胞内核酸酶处于无活性状态。这是由于核 酸酶和抑制物结合在一起(如抑制物被破坏,核酸 酶即可激活,引起DNA片段化)。 现知caspase可以剪切裂解这种抑制物而激活核酸 酶,因而把这种酶称为Caspase激活的脱氧核糖核 酸酶(caspase-activated deoxyribonulease CAD),而把它的抑制物称为ICAD。
相关文档
最新文档