金针菇菌种保藏效果的评价

金针菇菌种保藏效果的评价
摘要：研究利用保藏在-70℃超低温冰箱的5个金针菇菌种（保藏期2年）和保藏在4℃冰箱的5个金针菇菌种（保藏期为6个月）为材料，比较和评价两种保藏方法：（1）在pda平板上两种保藏方法在菌丝的宏观形态、微观形态上的差异；（2）在液体培养条件下比较其子实体的分化情况；（3）在固体培养条件下比较其子实体的分化情况。

结果表明：（1）两种不同的保藏方法金针菇在菌丝的宏观形态、微观形态上都没有差异。

菌丝的分枝、锁状联合及横隔都非常明显，说明金针菇菌株没有发生变异。

（2）在液体培养条件下，实验组和对照组的情况一致。

（3）在固体培养条件下，所有菌种实验组和对照组在子实体外观形态上没有特别明显的差异，可以说明没有发生变异。

通过拮抗实验观察到不同保藏条件下的菌种之间没有出现拮抗现象，表明在-70℃低温冰箱保藏2年后的菌种没有发生基因的变异。

关键词：金针菇菌种保藏保藏效果评定
中图分类号：ts275 文献标识码：a 文章编号：1007-3973（2013）007-090-03
1 前言
1.1 金针菇概况
金针菇（flammulina velutpes），隶属真菌门、担子菌亚门、蘑菇目、口蘑科、类火菇属，是世界上著名的食药两用菌和观赏菌。

1.2 营养价值
金针菇的营养保健作用日益引起人们的重视，目前以金针菇为原料加工的产品有金针菇豆奶、金针菇酸奶、金针菇酱、金针菇可乐、金针菇果冻、金针菇啤酒、金针菇菇脯、金针菇冰淇淋、金针菇挂面、金针菇火腿肠、金针菇保健饮料等。

金针菇的营养极其丰富，据日本学者研究指出，金针菇柄中含的大量食物纤维，有极好的食疗作用，是一种极好的保健食品。

日本用金针菇菌丝体的醣噻胺的生物活性物质来生产了一种新
型的抗癌剂，治癌剂副作用小，用于外科手术后的辅助治疗效果也十分明显。

1.3 菌种保藏技术概况
金针菇的经济实用价值高，而种植金针菇的关键是优良性状的菌种。

目前菌种保藏的方法包括：常规低温继代保藏、液氮超低温保藏、冷冻干燥保藏、-86℃深度低温保藏、石蜡封存、寄主保存、土壤保藏法、硅胶保藏法、滤纸条保藏法、蒸馏水保藏法等，其中液氮超低温冷冻保藏法效果最好。

但液氮保藏系统成本高，一般不能单独依靠这一保藏技术。

且液氮保藏的菌种必需培养在琼脂培养基或液体培养基中，不利于邮寄交流。

fritssdu首先在荷兰horst 发现杂交菌株u1经液氮保藏三年后出现退化，部分培养物产量下降，出现硬开伞，经组织分离培养后，产质量又恢复正常。

分析表明：经原生质体重新融合产生的杂交菌株，其本身对不利因素（如超低温的刺激）适应性差，在液氮保藏中必须考虑到这方面的影响；反复的冷冻和解冻也会使菌株受到不同程度的损伤。

对菌种保藏方
面所存在的相关问题有待更深入的研究。

1.4 菌种质量检测
食用菌菌种的生物学特征、对基质分解能力、遗传特征、生产出菇能力等方面需进行质量检测。

正常的菌丝一般具有透明、分枝状，有横隔和明显的锁状联合；仅有单核菌丝，不具结实性异宗结合的食用菌不宜作菌种；锁状联合多而密的双核菌丝结菇力强，一般是好菌种。

在适宜的条件下，若菌丝长速正常、粗壮、浓密、整齐，一般为优质菌种。

最后通过拮抗试验，观察菌丝接触区有无对峙反应。

若无褐色的带线出现，表示两个受检菌株的基因极相似或相同；反之，是不同的菌株。

本次实验尝试用低温冰箱保藏菌种。

须测定保藏后的菌种是否仍存活，有否变异。

由于条件所限，只选5个菌种进行菌丝形态观察、菌丝生长速度测量、液体及固体培养基出菇实验和拮抗实验。

2 材料与方法
2.1 材料与仪器
2.1.1 菌种
菌种是在-70℃冰箱用离心管保藏两年的5株不同的金针菇菌种fla2、fla3、fla4、fla5、fla7，及其在4℃冰箱用试管保藏半年的菌种。

2.1.2 培养基
（1）活化及菌丝观察培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（pda）培养基。

（2）液体培养基：马铃薯葡萄糖培养基。

（3）固体培养基：棉籽壳培养基。

2.2 方法
2.2.1 菌种的活化
在严格的无菌条件及超净工作台下操作。

4℃冰箱常规保藏的菌种：从试管里取出包括气生菌丝和基内菌丝的菌块，然后接到pda 斜面中，每个种重复4次；-70℃冰箱离心管保藏菌种：同样处理。

接种后在22℃恒温培养箱中培养。

2.2.2 平板菌丝培养
在pda固体培养基表面放无菌盖玻片，每个培养皿放3片。

从活化菌种试管取大小相仿的菌块进行接种，每个种接4个平板，每个温度保藏的已活化菌种做2个平行。

接种后在22℃恒温培养箱培养，测量菌丝平均生长速度。

2.2.3 液体栽培出菇实验
在超净台里，从活化菌种的试管里取出几块大小相仿的菌块放进pda液体培养基中，每个菌种接4瓶，两瓶为4℃冰箱常规保藏的已活化的菌种，另两瓶为-70℃冰箱离心管保藏的已活化的菌种。

接种后置于22℃恒温培养箱静置培养。

2.2.4 固体栽培出菇实验
按配方称取各种成分，把糖溶于水中，与干料混合，搅拌均匀，装袋。

在1.5kg/cm2的压力下，灭菌115min。

培养基灭菌后冷却到25℃左右时进行接种，整个过程都保证无菌操作。

接种后在22℃恒温培养箱培养，对菌丝的生长速度进行测量，菌
丝长到袋底表示培养阶段结束。

培养阶段结束后，把栽培袋移到菇房进行搔菌。

气温控制在十几到二十几度左右，打开培养袋放在菇房里，每天喷水保湿，适当通风，当子实体长到约15cm时可采收。

2.2.5 拮抗实验
培养基除不放盖玻片外，其余与2.2.2平板菌丝培养的相同。

在一个培养皿中接同一个种的不同温度保藏的已活化的菌种，保证无菌操作，每个做2个平行，共接10个培养皿。

接种后，在22℃恒温培养箱静置培养。

3 结果与分析
3.1 菌丝平均生长速度
3.1.1 平板培养菌丝日平均生长速度（见表1）
表1是平板培养菌丝的日平均生长速度，每个处理测3次。

从表2可看到fla3、4、5种内的不同温度下保藏后的菌种日平均生长速度的差异达到极显著，fla7的两种菌种的日平均生长速度的差异显著，fla2的两种菌种的日平均生长速度的差异不显著。

总的而言，在4℃冰箱保藏的菌种比在-70℃低温冰箱保藏的菌种的生长速度要快。

但菌种在4℃冰箱保藏的时间比在-70℃低温冰箱保藏的时间要短，所以4℃冰箱保藏的菌种有可能恢复得比较快，造成其生长速度快。

同时还有不可避免的人为误差的存在。

（说明：方差分析表中，a代表组间，e代表组内，ss代表平方和，ms代表均方和，p代表显著水平。

）
3.1.2 固体栽培菌丝日平均生长速度（见表3）
表3是固体栽培菌丝的日平均生长速度，每个处理测三次。

从表4看到只有fla5的菌丝日平均生长速度差异极显著，是
-70℃低温冰箱保藏的菌种的生长速度快。

fla3、4种内不同条件保藏的菌种生长速度差异显著，是4℃冰箱保藏的菌种的生长速度快。

而fla2、7的种内不同条件保藏的菌种生长速度差异不显著，即认为数据上的差异可能是由试验误差引起的，如培养基装袋时松紧度不同等。

表4中只有两个菌种表现出在4℃冰箱保藏的菌种的生长速度与-70℃低温冰箱保藏的菌种的生长速度有差异，而且是4℃冰箱保藏的长得快，与平板活化的情况一致。

而其他三个菌种表现为无差异和差异极显著，但差异极显著的菌种却是-70℃低温冰箱保藏的菌种长得快，由此可以推断在平板培养阶段，由于-70℃低温冰箱保藏的菌种已经保藏了两年时间，刚恢复生长时还不能体现它真正的活力，要经过一定时间才能基本恢复到其原来的状态了。

表3 固体栽培菌丝日平均生长速度（cm）
表4 固体栽培菌丝日平均生长速度方差分析
f0.01（1，4）=21.20，f0.05（1，4）=7.71， f0.1（1，4）=4.54 “**”代表差异极显著，“*”代表差异显著
3.2 菌丝显微形态
金针菇属低温结实性真菌，菌丝体在5～32℃范围内均能生长，正常菌丝呈白色绒毛状，有锁状联合、横隔和分枝。

两个不同保藏
条件下的同一菌种的菌丝显微形态没有显著的变异情况出现，菌丝的粗细，分支情况都大致相同。

通过显微镜观察，菌丝的锁状联合、菌丝细胞间的横隔都非常明显。

3.3 出菇情况
3.3.1 液体栽培出菇情况
液体栽培实验中，只有3个菌种长出了子实体，另外2个没有子实体分化，对照组情况一致，这说明不是菌种出现了问题，可能是部分菌种不适宜用液体栽培，或是所需的条件不同。

虽然子实体没有形成，但菌丝长势旺盛，用于菌丝球的培养或液体发酵是可行的。

3.3.2 固体栽培出菇情况
固体栽培每个菌种都出菇。

结合液体出菇实验，总的来看对照组与实验组在子实体形态上没有明显的差异。

3.4 拮抗性
拮抗性是反映菌种的基因有否变异的一个重要实验。

实验显示对照组与实验组的菌丝交界并不明显，菌丝之间可以交错生长，表明实验组与对照组的菌种间没有拮抗现象，说明实验组菌种的基因没有发生变异。

在生长初期，绝大部分都是-70℃保藏的菌种菌丝长得比较快。

同时菌丝在平板培养的状况：白色绒毛状，健壮，生长速度正常，7-8天就可长满培养皿。

4 结论
菌种在-70℃低温下保藏了2年而没有发生退化和变异，用这种方法来长期保藏金针菇菌种是可行的。

5 讨论
本次实验证明了用超低温冰箱代替液氮罐进行菌种的长期冷冻
保藏是可行的，大大增加了冷冻保藏的实用性。

而且放到冰箱里以后基本不需要任何的管理，非常方便。

冷冻温度为-70℃，但远比普通冷藏温度4℃低，从而有利于一般保藏菌种单位保持菌种种性和延长保藏时间。

并可推知其他食用菌菌种也可以用这种方法来保藏，但还需要进一步的实验来证明。

试验采用小离心管作冷冻菌种的容器，不仅价廉易得，而且有很多型号可挑选，可根据单位实际空间大小来选择。

同时不需专用封口设备，保藏操作处理也方便。

从经济层面上说，远比用液氮罐进行保藏的成本要低，也不需要像用4℃冰箱常规保藏那样半年就得活化一次，活化的次数多了菌种容易退化、变异，节约人力物力的同时菌种变异的几率也降低了。

这次用的是保藏了两年的菌种，这些菌种还能在这种条件下有效地保藏多少时间还有待研究。

如果可以保藏3-5年，甚至更久的话，将为食用菌菌种的保藏节约更多的成本。

这次的菌种仅保藏了2年的时间，远不能满足需求，试验将继续进行。

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