金针菇菌种保藏效果的评价

金针菇菌种保藏效果的评价

摘要：研究利用保藏在-70℃超低温冰箱的5个金针菇菌种（保藏期2年）和保藏在4℃冰箱的5个金针菇菌种（保藏期为6个月）为材料，比较和评价两种保藏方法：（1）在pda平板上两种保藏方法在菌丝的宏观形态、微观形态上的差异；（2）在液体培养条件下比较其子实体的分化情况；（3）在固体培养条件下比较其子实体的分化情况。结果表明：（1）两种不同的保藏方法金针菇在菌丝的宏观形态、微观形态上都没有差异。菌丝的分枝、锁状联合及横隔都非常明显，说明金针菇菌株没有发生变异。（2）在液体培养条件下，实验组和对照组的情况一致。（3）在固体培养条件下，所有菌种实验组和对照组在子实体外观形态上没有特别明显的差异，可以说明没有发生变异。通过拮抗实验观察到不同保藏条件下的菌种之间没有出现拮抗现象，表明在-70℃低温冰箱保藏2年后的菌种没有发生基因的变异。

关键词：金针菇菌种保藏保藏效果评定

中图分类号：ts275 文献标识码：a 文章编号：1007-3973（2013）007-090-03

1 前言

1.1 金针菇概况

金针菇（flammulina velutpes），隶属真菌门、担子菌亚门、蘑菇目、口蘑科、类火菇属，是世界上著名的食药两用菌和观赏菌。

1.2 营养价值

金针菇的营养保健作用日益引起人们的重视，目前以金针菇为原料加工的产品有金针菇豆奶、金针菇酸奶、金针菇酱、金针菇可乐、金针菇果冻、金针菇啤酒、金针菇菇脯、金针菇冰淇淋、金针菇挂面、金针菇火腿肠、金针菇保健饮料等。

金针菇的营养极其丰富，据日本学者研究指出，金针菇柄中含的大量食物纤维，有极好的食疗作用，是一种极好的保健食品。

日本用金针菇菌丝体的醣噻胺的生物活性物质来生产了一种新

型的抗癌剂，治癌剂副作用小，用于外科手术后的辅助治疗效果也十分明显。

1.3 菌种保藏技术概况

金针菇的经济实用价值高，而种植金针菇的关键是优良性状的菌种。目前菌种保藏的方法包括：常规低温继代保藏、液氮超低温保藏、冷冻干燥保藏、-86℃深度低温保藏、石蜡封存、寄主保存、土壤保藏法、硅胶保藏法、滤纸条保藏法、蒸馏水保藏法等，其中液氮超低温冷冻保藏法效果最好。但液氮保藏系统成本高，一般不能单独依靠这一保藏技术。且液氮保藏的菌种必需培养在琼脂培养基或液体培养基中，不利于邮寄交流。fritssdu首先在荷兰horst 发现杂交菌株u1经液氮保藏三年后出现退化，部分培养物产量下降，出现硬开伞，经组织分离培养后，产质量又恢复正常。分析表明：经原生质体重新融合产生的杂交菌株，其本身对不利因素（如超低温的刺激）适应性差，在液氮保藏中必须考虑到这方面的影响；反复的冷冻和解冻也会使菌株受到不同程度的损伤。对菌种保藏方

面所存在的相关问题有待更深入的研究。

1.4 菌种质量检测

食用菌菌种的生物学特征、对基质分解能力、遗传特征、生产出菇能力等方面需进行质量检测。正常的菌丝一般具有透明、分枝状，有横隔和明显的锁状联合；仅有单核菌丝，不具结实性异宗结合的食用菌不宜作菌种；锁状联合多而密的双核菌丝结菇力强，一般是好菌种。在适宜的条件下，若菌丝长速正常、粗壮、浓密、整齐，一般为优质菌种。最后通过拮抗试验，观察菌丝接触区有无对峙反应。若无褐色的带线出现，表示两个受检菌株的基因极相似或相同；反之，是不同的菌株。

本次实验尝试用低温冰箱保藏菌种。须测定保藏后的菌种是否仍存活，有否变异。由于条件所限，只选5个菌种进行菌丝形态观察、菌丝生长速度测量、液体及固体培养基出菇实验和拮抗实验。

2 材料与方法

2.1 材料与仪器

2.1.1 菌种

菌种是在-70℃冰箱用离心管保藏两年的5株不同的金针菇菌种fla2、fla3、fla4、fla5、fla7，及其在4℃冰箱用试管保藏半年的菌种。

2.1.2 培养基

（1）活化及菌丝观察培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（pda）培养基。（2）液体培养基：马铃薯葡萄糖培养基。

（3）固体培养基：棉籽壳培养基。

2.2 方法

2.2.1 菌种的活化

在严格的无菌条件及超净工作台下操作。4℃冰箱常规保藏的菌种：从试管里取出包括气生菌丝和基内菌丝的菌块，然后接到pda 斜面中，每个种重复4次；-70℃冰箱离心管保藏菌种：同样处理。接种后在22℃恒温培养箱中培养。

2.2.2 平板菌丝培养

在pda固体培养基表面放无菌盖玻片，每个培养皿放3片。从活化菌种试管取大小相仿的菌块进行接种，每个种接4个平板，每个温度保藏的已活化菌种做2个平行。接种后在22℃恒温培养箱培养，测量菌丝平均生长速度。

2.2.3 液体栽培出菇实验

在超净台里，从活化菌种的试管里取出几块大小相仿的菌块放进pda液体培养基中，每个菌种接4瓶，两瓶为4℃冰箱常规保藏的已活化的菌种，另两瓶为-70℃冰箱离心管保藏的已活化的菌种。接种后置于22℃恒温培养箱静置培养。

2.2.4 固体栽培出菇实验

按配方称取各种成分，把糖溶于水中，与干料混合，搅拌均匀，装袋。在1.5kg/cm2的压力下，灭菌115min。培养基灭菌后冷却到25℃左右时进行接种，整个过程都保证无菌操作。

接种后在22℃恒温培养箱培养，对菌丝的生长速度进行测量，菌

丝长到袋底表示培养阶段结束。

培养阶段结束后，把栽培袋移到菇房进行搔菌。气温控制在十几到二十几度左右，打开培养袋放在菇房里，每天喷水保湿，适当通风，当子实体长到约15cm时可采收。

2.2.5 拮抗实验

培养基除不放盖玻片外，其余与2.2.2平板菌丝培养的相同。在一个培养皿中接同一个种的不同温度保藏的已活化的菌种，保证无菌操作，每个做2个平行，共接10个培养皿。接种后，在22℃恒温培养箱静置培养。

3 结果与分析

3.1 菌丝平均生长速度

3.1.1 平板培养菌丝日平均生长速度（见表1）

表1是平板培养菌丝的日平均生长速度，每个处理测3次。从表2可看到fla3、4、5种内的不同温度下保藏后的菌种日平均生长速度的差异达到极显著，fla7的两种菌种的日平均生长速度的差异显著，fla2的两种菌种的日平均生长速度的差异不显著。总的而言，在4℃冰箱保藏的菌种比在-70℃低温冰箱保藏的菌种的生长速度要快。但菌种在4℃冰箱保藏的时间比在-70℃低温冰箱保藏的时间要短，所以4℃冰箱保藏的菌种有可能恢复得比较快，造成其生长速度快。同时还有不可避免的人为误差的存在。（说明：方差分析表中，a代表组间，e代表组内，ss代表平方和，ms代表均方和，p代表显著水平。）