凝胶层析方法及原理

基本原理

凝胶过滤法（gel filtration）也称为排阻层析（exclusion chromatography）、凝胶层析（gel c hromatography）或分子筛层析（molecular sieve chromatofraphy），它是在1960年后发展出来的技术。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，內部具有网状筛孔，利用球状凝胶內的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶內的筛孔，故在管柱內的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。一般状況下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。

目前常用的凝胶包括3个主要类型：

1. Polydextran

Polydextran的商品名称是Sephadex，它几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型号，如 G-25、G-75、G-100或是G-200，G 后面的数字为凝胶吸水量再乘以10，以G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml 。

2. Polyacrylamide

Polyacrylamide是一种合成凝胶，商品名Bio-Gel P，干粉颗粒状，在溶剂中自动溶成胶体，依胶的分离范围不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。Polyacrylamide的化学性质不活泼，但它在极端的pH 下会被水解，水解后产生的C OOH-具有离子交换的性质，因此pH 值应尽量控制在2-10之间。

3. Agarose

商品名Separose，属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose 2B，4B和6 B。Agarose gel 是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。Agarose 做成beads后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。

凝胶和管柱的选择

凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性（denature）或是其它化学反应，最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的pH和温度范围內使用。由于凝胶上的离子交换基团会吸附带电荷的物质，产生离子交换的效果，所以凝胶上最好不具有离子交换的基团。此外，凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。

凝胶颗粒的粗细与分离效果有直接关系，颗粒细的分离效果好，但流速慢而费时，因此要依具实际的需要来选择。对于分子量较小的物质，一般采用polydextran或polyacrylamide材质的凝胶，大分子物质则使用agarose。

以Sephadex为例，Sephadex G-50可用于区分分子量1,500～30,000之分子，而Sephadex G-75 凝胶可区分分子量3,000～70,000之分子，所以若要分离分子量10,000及20,000之分子，两种都适用。

如果要分离的分子大小相差很多，则可选用柱高：直径＝5∶1～15∶1的管柱，且管柱体积要大于4～15倍的样品体积；如果要分离的物质之间分子量差异不大，则要选用柱高：直径＝2 0∶1～100∶1的管柱，且管柱体积要大于25～100倍的样品体积。

凝胶的处理

商品凝胶一般是干燥的颗粒，使用前要先泡在欲使用的沖洗液中，使它充份膨胀，否则有引起凝胶柱破裂的危险。热胀法是常用的前处理法，即把浸于沖洗液中的凝胶加热，让它膨胀并除去气泡，温度够高的话（加温至近沸腾）也可消毒杀菌。凝胶处理过程不能剧烈搅拌，如此易使颗粒破裂，影响流速。

将凝胶裝入管柱的方法有很多种，实验室常用的方法是先在柱中加入约1/3 体积的沖洗液，边轻轻搅拌边将凝胶悬浮液倒入其中，等到底部沉积约1~2公分的凝胶后，打开下方出口让水流出，上面不断加入悬浮液，等到沉积到离顶部约3～5公分处停止，让3～5倍柱床体积的缓冲液流过层析柱。若用polydextran的凝胶，可放入有颜色的蛋白质（如cytochrome c）流过管柱，看看色带是否均匀下降，不均匀或出现气泡，凝胶均需倒出重新填裝。

冲洗缓冲液仅需留高于柱床2公分左右，多余的可用滴管吸去，再将出口打开使冲洗液流到距表面1～2公分，关闭出口，用滴管缓缓加入样品再打开出口，样品完全渗入凝胶內后，加入约4公分冲洗液，出口处接上收集瓶开始层析。

由于polydextran 和agarose都属于多糖类，一旦微生物生长过多，分泌的酶会水解凝胶使其性质改变，为了防止这种情況发生，凝胶最好采用真空或低温保存，但温度不能过低使凝胶冻结。加入抑菌剂（chlohexidine, chlorbutol, phenylmercuric salts, NaOH等）也是常用的方法。长时间不用的凝胶可用干燥保存法，也就是把使用过的凝胶用水除去碎颗粒和杂质，再用不同浓度的酒精，由70%、90%到95%逐步脱水，在摄氏60～80度下烘干，不能加热的Se pharose则用乙醚洗涤干燥。