石蜡包埋

石蜡切片及HE染色过程

一石蜡切片

1. 取材: 刀片要求锋利而薄,组织厚度约2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm为宜. 取材时间越快越好.

2. 固定: 组织取下后应立即放入10%福尔马林(相当于4%甲醛)固定.

注意: (1). 固定液量应为组织块体积的40倍.

(2) 固定时间固定时间与使用的固定液种类和组织块大小, 温度等有关. 一般为3—24h.

(3)固定温度大多可在室温固定, 在低温(4℃)时间应延长.

(4)固定容器应大些.

3. 漂洗: 流水冲洗2—10h.

4. 脱水: 从低浓度酒精到高浓度酒精.

70%(数分钟)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→100%(60-120’)→100%(6 0-120’).

5. 透明: 组织块脱水后必须经过一种既能与酒精混合又能溶解石蜡的溶剂, 而使石蜡进入组织块. 常用二甲苯, 一般浸泡30m即可.

6. 浸蜡: 组织经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡. 一般需经2—3次浸渍才能完成, 总时间为3—4h. 用于浸蜡的石蜡熔点为52—56℃.

7. 包埋: 先将熔化的石蜡倒入包埋框再用加热的镊子将组织块放入. 包埋面必须平整. 包埋后石蜡稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固.

8. 切片: 修块→切片→展片→捞片→烤片.

二HE染色

1. 染色前切片处理

(1) 脱福尔马林色素.

(2) 脱汞盐结晶.

(3) 脱黑色素.

2. 染色步骤

二甲苯脱蜡(10’)→ 无水乙醇洗去二甲苯(1’×2次)→95%酒精(1’)→90%酒精(1’)→85%酒精(1’)→自来水洗(2’)→苏木精染色(1—5’)→自来水洗(1’)→1%盐酸酒精分化20s→自来水洗(1’)→稀氨水(1%)反蓝30s→自来水或蒸馏水洗(1’)→伊红染色(20s—5min)→自来水洗(30s)→85%酒精脱水(20s)→90%酒精脱水(30s)→95%酒精(1’)→95%酒精(1’)→100%酒精(2’)→100%酒精(2’)→二甲苯(2’)→中性树胶封片.

3. 染色结果: 细胞核呈兰色, 胞浆呈红色.

三盐酸酒精的配制

浓盐酸0.5—1ml + 75%酒精99ml.

此液用一段时间后需延长或更换液体, 新液体分化时间要短.

脑组织的石蜡包埋过程中有很多干预因素，一个环节处理的不好就会影响整个实验，我把我们的制作方法说一下，供参考。

1，后固定充分的脑组织放于0.01mol/L PBS中，40minx3次

2，50%的酒精4小时

3，70%4小时

4，80%4小时

5，90%过夜

6，95%6小时（1.5x4次）

7，100%6小时（1.5x4次）

8，二甲苯透明的时间要看组织块大小了，一般我们的经验是4毫米厚的组织块一般是45分钟，基本可以。薄一点呢就取40，后一点就取50，这步其实很关键，建议taratara 先用一个空白组的大鼠脑组织先做一次，看条件怎么样，然后再调整一下时间。

9，浸蜡，一般是4.5--5小时，蜡一1小时，蜡二1小时，蜡三2.5--3小时。

以上就是我们的作法，希望对你有所帮助。

如果脑组织不能及时包埋，就用原来的固定液继续固定，放于4度冰箱中，最好不要时间太长，小于一个月，越早包埋越好。

祝实验顺利！

脑组织包埋过程基本上和其它组织是相同的。

但对于某个具体的组织块来说，脱水、透明、浸蜡的时间需要摸索。虽然相差不大，可是有些原则。比如：

1.在组织块大小相同的情况下处理疏松的组织需要较短一点的时间；

2.肌肉组织比脂肪组织时间短；

3.纤维组织比结构细腻、细胞成分多的组织时间长。

4.组织块越大需要处理时候越长；等等。

所以你处理脑组织的具体时间需要自己摸索，并不是有很现成的步骤的。

建议你去病理科, 是因为这些过程不是一次两次就可以摸索透彻的。

病理科一般不会擅自切你的标本的，也不会切掉你需要的组织。他们只是包埋，又不是帮你取材。

你的目的是做HE切片或者免疫组化之类的实验吧？如果不去病理科，难道你连片子也自己切吗？

GOOD LUCK!

我们实验室的做法通常是：

固定: 组织取下后应立即放入4℃的4%甲醛过夜.（注意:固定液量应为组织块体积的20倍.）脱水: 从低浓度酒精到高浓度酒精依次：（注意：不能时间太长，否则组织易碎。）

70%酒精1min----80%酒精2-4小时----95%酒精2-4小时----95%酒精2-4小时----100%酒精2-4小时----100%酒精2-4小时。

透明: 常用二甲苯, 一般浸泡30min即可.

浸蜡: 组织经透明后放入熔化的石蜡（熔点为52℃）内，1小时/次，共三次。

可以试一下冰冻切片，我们实验室先是用石蜡做大脑的免疫组化，后发现冰冻孵片法方便，而且抗原丢失少，具有很多优点。

我们石蜡的过程如下：

1. 前固定：脑组织最好经心脏灌流进行前固定——麻醉动物，暴露心脏，从左心室灌注生理盐水或0.1M PBS几百毫升（一般为动物体积2－3倍），同时在右心房剪一口。然后再灌注几百体积4％多聚甲醛等固定液。

2. 后顾定：然后取脑，置于固定液中后顾定24小时

3. 脱水: 从低浓度酒精到高浓度酒精依次：（注意：高浓度酒精时间不能太长，否则组织易

碎。）

70%酒精可过夜－－80%酒精2小时－－95%酒精1小时两次－－100%酒精1小时两次。

4. 透明: 1：1酒精二甲苯1小时－－常用二甲苯, 一般浸泡30－45min即可。

5. 浸蜡: 组织经透明后放入熔化的软蜡（熔点为52－54℃）内，2小时；然后入硬蜡（熔点56－58℃）2－3小时。

6. 包埋: 将熔化的硬蜡倒入包埋框再将组织块放入，放入时不能有气泡。

建议：大鼠脑袋大，若不影响实验可切开，有利于上述步骤。

祝试验成功！