抗氧化自由基检测的方法及步骤

清除DPPH自由基能力检测方法

清除DPPH自由基能力检测方法清除DPPH自由基能力是用来评价化合物在体外是否具有抗氧化活性的一种常用方法。

DPPH自由基是一种常用的自由基模型，其具有紫色，可通过其吸收峰的变化来反映清除能力。

以下是常用的几种用于检测清除DPPH自由基能力的方法：1.分光光度法分光光度法是一种常用的检测方法，基本原理是通过测量化合物与DPPH反应后的溶液吸光度的变化来评估清除DPPH自由基能力。

实验过程如下：1）准备1mM的DPPH乙醇溶液。

2）将待测化合物按一定浓度体系添加到相应的试管中。

3）将相同体积的DPPH溶液加入到每个试管中，混匀。

4）放置在室温下，静置反应30分钟。

5）使用紫外可见分光光度计测量反应体系的吸光度，计算清除率。

2.电子顺磁共振法（EPR）电子顺磁共振法是另一种常用的方法，通过测量化合物对DPPH自由基的清除能力，进而评估其抗氧化活性。

实验过程如下：1）准备含有DPPH和待测化合物的溶液。

2）使用电子顺磁共振仪测量样品的EPR信号，同时测量含有DPPH和不含DPPH的样品作为参比。

3）通过比较样品与参比的EPR信号来计算清除率。

3.原子力显微镜方法（AFM）原子力显微镜方法是一种非常灵敏的方法，可以用于直接观察化合物对DPPH自由基的清除作用。

实验过程如下：1）制备DPPH自由基薄膜。

2）将待测化合物沉积到DPPH自由基薄膜上。

3）使用原子力显微镜观察样品的表面形态变化。

4）通过观察DPPH颜色的变化和表面形态的变化来评估清除率。

4.荧光法荧光法是一种快速、灵敏且简便的检测方法，利用化合物与DPPH反应后荧光上转换的变化来评估清除DPPH自由基能力。

实验过程如下：1）制备DPPH乙醇溶液。

2）将待测化合物与DPPH溶液混合。

3）使用荧光光谱仪测量样品的荧光强度的变化。

4）通过荧光强度的变化来计算清除率。

总结：以上所述是几种常用于检测清除DPPH自由基能力的方法，分别基于吸光度、EPR、AFM和荧光等原理。

dpph抗氧化能力测定

DPPH.法测定绿原酸清除自由基能力2.1 待测液的制备将绿原酸(纯度56%)、维生素C 和没食子酸分别配制成体积分数为0.1mg/mL 的无水乙醇溶液。

2.1.1 绿原酸母液的配制称取 9.0 mg 绿原酸，定容到50ml ，即可得到绿原酸的母液0.1mg/mL 。

然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。

分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。

2.1.2 Vc 母液的配制称取 mg VC ，定容到100ml ，即可得到VC 的母液。

然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。

分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。

2.1.3 没食子酸母液的配制称取 mg 没食子酸，定容到100ml ，即可得到没食子酸的母液。

然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。

分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。

2.1.4 DPPH 母液的配制称取 mg DPPH ，用无水乙醇定容到100ml ，即可得到DPPH 的母液。

然后，再将所配制的母液按照要求稀释成至一定浓度的溶液。

C DPPH = mg/ml 。

（建议用0.025mg/mL ）2.2 DPPH.溶液的可见光谱以无水乙醇为对照，在分光光度计上对DPPH.溶液进行在440～600nm 下扫描。

A max = nm2.3 抗氧化活性测定DPPH.是一种稳定的自由基，它的乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为 nm 。

当DPPH.溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm 处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。

因此，可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力，其能力用清除率(Scavenging Rate,SR)来表示，清除率越大，抗氧化能力越强[4.5]。

抗氧化活性测定方法

抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法在食品、药物、化妆品以及生物学研究中具有重要的应用价值。

抗氧化活性是指物质对自由基的清除能力，其测定方法可以评估物质的抗氧化性能和保护细胞免受氧化损伤的能力。

本文将介绍一些常用的抗氧化活性测定方法。

一、DPPH自由基清除法DPPH自由基清除法是目前应用最广泛的抗氧化活性测定方法之一、该方法基于DPPH自由基的紫色溶液，在受到氧化损伤时会褪色。

通过测定样品对DPPH自由基的清除能力，可以评估其抗氧化活性。

实验步骤：1.准备0.1mM的DPPH溶液。

2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。

3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的DPPH溶液。

4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。

二、还原能力测定法还原能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。

该方法基于物质对氧化剂的还原能力，通过测定还原剂浓度与吸光度之间的关系，评估样品的抗氧化活性。

实验步骤：1.准备一系列不同浓度的还原剂溶液。

2.取一定量的还原剂溶液，加入适量的氧化剂溶液。

3.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出还原剂的浓度与吸光度之间的关系。

4.根据吸光度与还原剂浓度的关系，评估样品的抗氧化活性。

三、总抗氧化能力测定法总抗氧化能力测定法是一种综合评估样品抗氧化活性的方法。

该方法基于样品的抗氧化剂含量和抗氧化活性，通过测定样品对氧自由基的清除能力，评估其总抗氧化能力。

实验步骤：1.准备一定浓度的氧自由基溶液。

2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。

3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的氧自由基溶液。

4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。

以上是常用的抗氧化活性测定方法，还有其他一些方法如ORAC法、TEAC法等也被广泛应用。

不同的方法适用于不同的样品和测定目的，选择适合的方法进行测定可以更准确地评估样品的抗氧化活性。

3种抗氧化活性测定方法

3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法是评估化合物或材料抗氧化性能的一种重要手段。

随着抗氧化活性的研究日益深入，目前已经发展出很多种测定方法。

以下将介绍三种常用的抗氧化活性测定方法：DPPH自由基清除法、Fe2+/Fe3+还原能力法和ABTS自由基清除法。

1.DPPH自由基清除法：DPPH（2,2-二苯基-1-苦味肼）是一种紫色的自由基，常用于评估化合物或材料的抗氧化活性。

该方法基于DPPH自由基与抗氧化物质发生反应后，颜色由紫色变为淡黄色或无色。

测定方法简单，操作方便。

其原理是待测样品与DPPH混合后，通过电子或氢的转移反应，DPPH自由基将被清除，溶液颜色由紫色转变为淡黄色。

根据吸光度变化可以计算出自由基清除率，进而评估抗氧化活性。

2.Fe2+/Fe3+还原能力法：该方法基于还原能力测定抗氧化物质对Fe3+离子的还原能力。

常用的试剂是FeCl3溶液和TPTZ（2,4,6-三聚吡啶甲酸）、酸性pH缓冲液。

其原理是待测样品能够还原Fe3+离子为Fe2+离子，Fe2+离子与TPTZ反应生成有颜色的络合物，通过分光光度计测定络合物的吸光度变化，进而计算出还原能力。

较高的吸光度变化表示较高的抗氧化活性。

3.ABTS自由基清除法：ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙基苯并噻唑啉-6磺酸)）自由基是一种蓝绿色自由基，其浓度在紫外可见光区域有最大吸收。

该方法基于ABTS自由基清除率来评估抗氧化物质的抗氧化活性。

该方法较DPPH法和还原能力法更为灵敏。

其原理是待测样品与ABTS自由基反应后，ABTS自由基将被清除，溶液颜色由蓝绿色变为无色或浅黄色。

通过测定吸光度的变化，可以计算出自由基清除率，进而评估抗氧化活性。

除了上述常用的抗氧化活性测定方法外，还有很多其它方法也被广泛应用于抗氧化活性的评估，如氧化还原测定法、Fenton反应法、还原剂抑制能力法等。

每一种测定方法都有其独特的原理和适用范围，研究人员可以根据具体的研究目的和样品性质选择合适的测定方法。

3种抗氧化活性测定方法

3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性是指物质对氧化过程的抑制作用，能够减缓或阻断自由基对细胞和组织的损害。

目前，常用的抗氧化活性测定方法主要包括DPPH 自由基清除法、ABTS自由基清除法和铁还原能力测定法。

以下将对这三种方法进行详细介绍。

1.DPPH自由基清除法：DPPH（2,2-二苯基-1-若氧基-苯基-π-苦味噁唑）自由基清除法是一种常用的抗氧化活性测定方法。

该方法是通过测定样品对DPPH自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。

DPPH自由基是一种紫色稳定的自由基，在接触到氢供体（抗氧化剂）后，会发生颜色变化从紫色转变为黄色。

可以通过测定样品溶液的吸光度来评估其抗氧化能力。

吸光度的降低表明样品对DPPH自由基的清除能力较强。

2.ABTS自由基清除法：ABTS（2,2'-联氨基双（3-乙基苯并噻唑））自由基清除法也是一种常用的抗氧化活性测定方法。

ABTS自由基是一种无色可溶性自由基，其生成主要通过氧化剂与ABTS反应而产生。

测定方法是将ABTS与过氧化氢反应，生成蓝色自由基溶液，然后将样品加入到溶液中，通过测定吸光度的变化来评估样品的抗氧化活性。

吸光度的降低表明样品对ABTS自由基的清除能力较强。

3.铁还原能力测定法：铁还原能力测定法是一种评估抗氧化活性的常用方法，通过测定样品对Fe3+还原为Fe2+的能力来评估其抗氧化能力。

在这个方法中，还原剂（如抗氧化剂）会与Fe3+反应，生成Fe2+，并且Fe2+的浓度可以通过测量其吸光度来确定。

浓度越高，吸光度越高，表明样品的抗氧化能力越强。

这三种抗氧化活性测定方法各有其优势和适用范围。

DPPH自由基清除法适用于评估样品对自由基的清除能力，但其结果受其他化合物的影响较大；ABTS自由基清除法对于水溶性和脂溶性样品均适用，但其结果也受其他化合物的影响；铁还原能力测定法适用于样品中还原型物质的测定，可评估样品对金属离子的还原能力。

因此，在实际应用中，可以根据需要选择适合的方法来评估样品的抗氧化活性。

体外抗氧化清除自由基能力测定方法总结

体外抗氧化清除自由基能力测定方法总结1 总还原力的测定采用Lee等[14]方法,略修改.取1.0 mL浓度为25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL, 150μg/mL和200μg/mL的样液,加入2.5 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L,pH 6.6),然后加入2.5 mL 1%六氰合铁酸钾(K3Fe(CN)6), 50℃水浴30 min后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,混匀1 500 g离心10 min,取上清液2.5 mL加2.5 mL水和0.5 mL 0.1%的三氯化铁混匀,于700 nm处比色测定.以25~200μg/mL维生素C为标准溶液做标准曲线,以维生素C相当含量(mg/g)表示样品总还原力.2 DPPH·自由基清除率的测定采用Yamaguchi等[15]方法,取0.2 mL浓度分别为25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL, 150μg/mL和200μg/mL的样液同1.0 mL 95%的DPPH乙醇溶液混匀,于37℃反应60 min后在517 nm处比色.DPPH自由基清除率用以下方程式计算: Y= [(OD517对照-OD517样品)/OD517对照]×100式中:Y为清除率,%;OD517对照为517 nm下对照品的吸光度值;OD517样品为517 nm下不同浓度样品的吸光度值.3 羟基自由基(·OH)清除率的测定桦褐孔菌多酚的羟基自由基(·OH)清除率由改动后的Nicholas Smirnoff[11]法测得。

反应体系(4 mL)包括:1 mL H2O2(8.8 mmol/L),1 mL FeSO4(9 mmol/L),1 mL水杨酸(9 mmol/L),1 mL多酚溶液(0.4mg/mL)。

H2O2最后加入以启动整个反应。

反应体系在37℃条件下温育60 min,在15 000×g条件下离心6 min。

抗氧化测定方法流程

一DPPH自由基清除能力仪器及药品：酶标仪、紫外-可见分光光度计、甲醇、DPPH等DPPH 即1，1-二苯基-2-苦肼基自由基，是一种稳定的自由基，其甲醇溶液呈紫色，并在517 nm处有强吸收。

参考Braca et al. (2001)的方法进行测量。

取0.1 ml样品，加入3 ml 0.004％DPPH 甲醇溶液（质量分数）。

（0.02g溶于500ml甲醇溶液。

）混合均匀后，静置30 min后在517 nm处测定吸光值。

抑制率采用公式[(A0－A1)/A0] · 100计算，其中A0（加0.1ml甲醇和3mlDPPH甲醇溶液）为加入样品前的吸光值，A1 为加入样品后的吸光值。

（空白样采用甲醇。

用甲醇溶液调零。

）配置各个级分不同浓度的甲醇溶液，浓度范围可以先做预实验，大致在1mg-1000mg/l 之间：测定吸光值计算DPPH自由基清除率，绘制吸收曲线，找出其IC50二FRAP法测定抗氧化能力药品：醋酸纳、醋酸、三吡啶基均三嗪（2,4,6-Tripyridyl-s-triazine，TPTZ）、盐酸、FeCl3·6H2O、维生素C（L-Ascorbic Acid）（1）300mmol/L的醋酸盐缓冲液（pH=3.6）：3.1g C2H3NaO2·3H2O ＋16mL C2H4O2 溶于1L容量瓶中定容。

（或着是1.869g醋酸钠）（2）10mmol/L三吡啶基均三嗪（2,4,6-Tripyridyl-s-triazine，TPTZ，分子量312.33）溶于40mmol/L HCl中：称取0.312g三吡啶基均三嗪溶于50ml小烧杯中，加入0.34ml浓HCl（约11.7mol/l）搅拌均匀，然后定容到100ml容量瓶中。

（3）20mmol/L FeCl3·6H2O溶液，称取2.703gFeCl3·6H2O溶解于200ml蒸馏水中，然后定容到500ml容量瓶中FRAP试剂：25mL 醋酸盐缓冲液＋ 2.5mL TPTZ溶液＋ 2.5mL FeCl3·6H2O溶液（10:1:1）标准样：0.1-1mmol/L的维生素C（L-Ascorbic Acid）溶液FRAP分析步骤：取0.1 ml 样品放入10ml试管中，加入新鲜的FRAP试剂3.0 ml，然后置于25℃恒温水浴中，5 min后用紫外分光光度计在波长为593 nm处测吸光值，（空白样采用去离子水。

清除自由基功能的测定实验目的

清除自由基功能的测定实验目的自由基是一类具有不成对电子的高度活跃的化学物质，它们在生物体内的形成和累积会对细胞和组织造成损伤，引发多种疾病。

因此，研究和测定清除自由基的功能对于探索疾病的发生机制以及开发相关药物具有重要意义。

本实验旨在通过测定清除自由基的能力来评估不同物质的抗氧化活性，为进一步研究提供理论依据。

实验步骤如下：1. 实验材料准备：- 各种待测物质（如维生素C、维生素E等）- 自由基发生剂（如过氧化氢、DPPH等）- 各种常用溶剂（如乙醇、水等）- 甲醇- 离心机- 分光光度计- 显微镜2. 实验操作：- 将待测物质和自由基发生剂按一定比例混合，使其达到反应体系的最佳浓度。

- 在不同时间点（如0 min、10 min、20 min等）取样，离心去沉淀。

- 用甲醇溶解沉淀物，使其溶解充分。

- 利用分光光度计测定样品的吸光度值，计算自由基清除率。

- 若需要观察清除自由基的形态变化，可使用显微镜进行观察。

3. 数据处理：- 根据吸光度值计算自由基清除率，以评估待测物质的抗氧化能力。

- 利用统计方法对数据进行分析，得出结论。

实验注意事项：1. 实验过程中要严格控制温度和pH值，以保证实验结果的准确性。

2. 不同物质的浓度和反应时间可根据实际需要进行调整，以获取更精确的结果。

3. 实验操作要规范、仔细，避免误操作对结果产生影响。

4. 实验过程中要注意安全，避免接触自由基发生剂和有毒溶剂。

实验结果的分析与讨论：根据实验测定得到的吸光度值，可以计算出不同时间点的自由基清除率。

通过对比不同物质的清除率，可以评估它们的抗氧化能力。

清除率高的物质具有较强的抗氧化活性，可以帮助减少自由基的损伤，从而对细胞和组织起到保护作用。

实验中还可以观察待测物质对自由基形态的影响。

例如，通过显微镜观察自由基颜色的变化、形态的变化等，可以进一步了解待测物质对自由基的清除机制。

实验的局限性与扩展：本实验只是一种简单的测定方法，对于评估物质的抗氧化能力具有一定的局限性。

抗氧化试验方法

抗氧化试验方法一、试验方法1、DPPH自由基清除率的测定本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。

1.1实验原理1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。

当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。

1.2溶液的配制0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH 溶液，避光保存，备用。

1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，臵10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。

按下列公式计算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100%公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值将实验重复三次，求得清除率的平均值。

2、总的抗氧化活性的测定总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。

2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。

抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。

此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。

抗氧化测定方法流程

抗氧化测定方法流程一DPPH自由基清除能力仪器及药品：酶标仪、紫外-可见分光光度计、甲醇、DPPH等DPPH 即1，1-二苯基-2-苦肼基自由基，是一种稳定的自由基，其甲醇溶液呈紫色，并在517 nm处有强吸收。

参考Braca et al. (2001)的方法进行测量。

取0.1 ml样品，加入3 ml 0.004％DPPH 甲醇溶液（质量分数）。

（0.02g溶于500ml甲醇溶液。

）混合均匀后，静置30 min后在517 nm处测定吸光值。

抑制率采用公式[(A0－A1)/A0] · 100计算，其中A0（加0.1ml甲醇和3mlDPPH甲醇溶液）为加入样品前的吸光值，A1 为加入样品后的吸光值。

（空白样采用甲醇。

用甲醇溶液调零。

）配置各个级分不同浓度的甲醇溶液，浓度范围可以先做预实验，大致在1mg-1000mg/l 之间：测定吸光值计算DPPH自由基清除率，绘制吸收曲线，找出其IC50二FRAP法测定抗氧化能力药品：醋酸纳、醋酸、三吡啶基均三嗪（2,4,6-Tripyridyl-s-triazine，TPTZ）、盐酸、FeCl3·6H2O、维生素C（L-Ascorbic Acid）（1）300mmol/L的醋酸盐缓冲液（pH=3.6）：3.1g C2H3NaO2·3H2O ＋16mL C2H4O2 溶于1L容量瓶中定容。

（或着是1.869g醋酸钠）（2）10mmol/L三吡啶基均三嗪（2,4,6-Tripyridyl-s-triazine，TPTZ，分子量312.33）溶于40mmol/L HCl中：称取0.312g三吡啶基均三嗪溶于50ml小烧杯中，加入0.34ml浓HCl（约11.7mol/l）搅拌均匀，然后定容到100ml容量瓶中。

（3）20mmol/L FeCl3·6H2O溶液，称取2.703gFeCl3·6H2O溶解于200ml蒸馏水中，然后定容到500ml容量瓶中FRAP试剂：25mL 醋酸盐缓冲液＋2.5mL TPTZ溶液＋2.5mL FeCl3·6H2O溶液（10:1:1）标准样：0.1-1mmol/L的维生素C（L-Ascorbic Acid）溶液FRAP分析步骤：取0.1 ml 样品放入10ml试管中，加入新鲜的FRAP试剂3.0 ml，然后置于25℃恒温水浴中，5 min后用紫外分光光度计在波长为593 nm处测吸光值，（空白样采用去离子水。

抗氧化物活性测定方法总结

抗氧化物活性测定方法总结引言：一、化学法1.DPPH自由基清除法该方法利用DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苦基）自由基的特性，通过测定样品对DPPH自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。

该方法简便、快速，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法无法反映样品在生理条件下的真实抗氧化活性。

2.ABTS自由基清除法该方法利用ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙酸苯并咪唑-6-磺酸)）自由基的特性，通过测定样品对ABTS自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。

该方法操作简单、结果稳定，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法在高浓度下可能存在偏差。

二、生物学法1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定法该方法通过测定样品对超氧自由基的抑制能力来评估其SOD活性。

该方法可以反映样品在生理条件下的真实抗氧化活性，适用于抗氧化物活性的研究。

但该方法操作复杂、耗时较长，且受到其他物质的干扰。

2.过氧化氢酶（CAT）活性测定法该方法通过测定样品对过氧化氢的分解能力来评估其CAT活性。

该方法操作简单、结果准确，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法无法反映样品在生理条件下的真实抗氧化活性。

三、电化学法1.循环伏安法该方法通过测定样品在电极上的氧化还原行为，来评估其抗氧化活性。

该方法操作简单、结果准确，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法需要特殊的电化学设备，且对于非水溶性样品不适用。

2.差示脉冲伏安法该方法通过测定样品在电极上的差示脉冲伏安曲线，来评估其抗氧化活性。

该方法操作简单、结果准确，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法需要特殊的电化学设备。

结论：目前，抗氧化物活性测定方法多种多样，各有优缺点。

选择合适的测定方法应根据具体实验目的、样品性质、设备条件等综合考虑。

为了准确评估样品的抗氧化活性，可采用多种方法进行综合分析。

未来，随着科技的不断发展，抗氧化物活性测定方法将会更加精确、快速、简便，为抗氧化物活性的研究提供更多便利和准确的手段。

抗氧化测定方法（三种）

实验一超氧阴离子自由基清除能力的测定——抗氧化实验之一一、目的要求通过本实验掌握利用利用植物（或微生物发酵生产的原料）提取物进行超氧阴离子自由基清除能力测定的方法。

二、实验原理超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。

邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02﹣∙，02﹣∙能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30s~45s 与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有色产物在325nm 有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02﹣∙的浓度，清除02﹣∙就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。

三、器材及试剂（一）器材恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。

10ml比色管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。

（二）试剂邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸、BHT等。

（1）pH8.2的Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）：50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与22.9ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。

（2）0.2mmol/L邻苯三酚溶液（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制）四、操作步骤（一）样品的测定（1）先将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度，在10mL的比色管中分别加入4mL（0.05mol/L）pH8.2的Tris-HCl缓冲液，置于25℃水浴中预热20min，然后加入25℃水浴中预热20min不同浓度样品液1mL，再加入在25℃水浴中预热20min的0.2mmol/L邻苯三酚溶液1mL（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制），混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用浓HCl两滴终止反应，并在325nm处测定吸光度（A样）。

抗氧化性测定方法

抗氧化性测定方法
抗氧化性测定方法是一种用于测试物质对氧气自由基、过氧化物和其他氧化性物质的抵抗能力的方法。

以下是常见的抗氧化性测定方法：
1. DPPH自由基清除法：使用一种紫色自由基DPPH，通过测定反应前后DPPH 吸收峰的差异来评估样品的自由基清除能力。

2. ABTS自由基清除法：使用一种蓝色自由基ABTS，通过ABTS的光谱变化来衡量样品对自由基的清除能力。

3. ORAC法：利用ORAC反应器测量被测样品对氧化过程中产生的自由基的清除能力。

4. FRAP法：利用FRAP反应器测量被测样品对铁离子的还原能力。

5. TAC法：通过测量总抗氧化能力评价样品的抗氧化能力。

6. 超氧化物歧化酶(SOD)活力测定法：利用SOD对超氧化物的清除作用来评估物质的抗氧化能力。

以上方法中，DPPH和ABTS自由基清除法是较常用的评估抗氧化性的方法。

抗氧化性是很多食品和保健品评估其品质和功效的重要指标，因此，准确测定物质
的抗氧化性对于推广新产品、提高产品质量和开发功能性食品有着重要意义。

抗氧化活性实验方法

抗氧化活性实验方法（体外实验）1、清除DPPH自由基能力的测定称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。

分别取2mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。

取上清液于517nm处测吸光值。

用Vc作为阳性对照。

样品对DPPH 自由基的清除率用以下公式计算：DPPH()121100%A AA-=-⨯清除率A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。

2、总还原能力的测定在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。

取出后加入2.5mL 10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。

取上清液2.5mL，加入2.5mL 蒸馏水和0.5mL FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。

Vc作为阳性对照。

3、对Fe2+离子螯合能力的测定分别取1mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。

EDTA为阳性对照。

样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：Fe2+()121100%A AA-=-⨯螯合率A0—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值；A1—样品溶液反应后的吸光值；A2—0.1mL的蒸馏水代替反应体系中FeCl2溶液后的吸光值。

4、超氧自由基（O2-）清除率的测定采用邻苯三酚自氧化法测定。

取50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）4.5mL，置25℃水浴中保温20min，分别加入1mL样品溶液和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1mL 8mmol/L HCl终止反应，于299nm处测定吸光度（A x），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。

抗氧化性检测(羟基自由基、普鲁士蓝)

d.还原能力的测定采用普鲁士兰法。

分别精密吸取各组分浓度为0.1，0.5，1.0，2.0，5.0mg/mL的多糖及Vc 溶液2mL，加入0.2mol/L pH=6．6的磷酸盐缓冲液2.5mL及1%铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，于50℃水浴加热20min后迅速冷却，再加入10%三氯乙酸溶液2.5mL，混匀后吸取2.5mL 溶液于比色管中，加蒸馏水2.5mL和0.1%氯化铁溶液0.5mL，常温反应10min后于700nm 处测定吸光值，吸光值越大，表明还原能力越强。

a.清除羟基自由基活性的测定采用水杨酸法。

在10mL试管中依次加入9mmol/LFeSO4溶液2mL，9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL和各组分浓度为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL的多糖或Vc溶液2mL，8.8mmol/LH2O2溶液2mL。

充分混匀后于37℃水浴30min，于510nm处测定吸光值A，以加蒸馏水为空白对照，做三次平行试验。

用以下公式计算对羟基自由基的清除率：R=[Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100%(2-10)式中，Ao表示加入蒸馏水空白体系的吸光值；Ai表示为加入不同浓度样品溶液后测得的吸光值。

Aj表示水代替H2O2时不同多糖浓度下测得的本底吸光值。

取7支试管依次加入1.8 mmol/L FeSO4 1.0mL、1.8mmol/L水杨酸0.75 mL、0.3% H2O2 0.5mL摇匀，分别向7支试管中加入10 mg﹒L-1多糖溶液0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL，再补水至0.5mL，摇匀，37℃水浴30 min，以双蒸水为参比测其510nm处吸光度Ax。

空白实验：0.5 mL双蒸水取代多糖溶液，重复上述过程，测吸光度A0；对照实验：用0.5 mL双蒸水取代H2O2溶液，重复上述过程，测吸光度A s；用蒸馏水分别取代多糖溶液和H2O2溶液，重复上述过程，测吸光度A s0 。

dpph法

dpph法
DPPH法是一种测定抗氧化能力的方法，它可以用来测定物质的抗氧化能力，也可以用来测定植物提取物的抗氧化能力。

DPPH法的原理是：DPPH是一种自由基，它具有一个自由基反应中特有的结构，它的分子中含有一个芳基环，这个芳基环上有一个自由基，这个自由基可以与抗氧化剂发生反应，从而使DPPH的自由基变成非自由基，从而使DPPH的色素发生变化，从而可以用来测定抗氧化能力。

DPPH法的实验步骤如下：
1.准备实验材料：准备DPPH溶液、待测物质溶液、标准抗氧化剂溶液；
2.测定：将DPPH溶液和待测物质溶液按照一定的比例混合，然后将混合液放入光度计中，测定其吸光度；
3.计算：将待测物质溶液和标准抗氧化剂溶液按照一定的比例混合，然后将混合液放入光度计中，测定其吸光度，然后计算待测物质抗氧化能力的折算值，即DPPH法的结果。

DPPH法是一种简单、快速、准确的测定抗氧化能力的方法，它可以用来测定物质的抗氧化能力，也可以用来测定植物提取物的抗氧化能力，是一种重要的抗氧化检测方法。

抗氧化活性测定方法

抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定是指评估化合物或物质对抗自由基或其他氧化物种的能力。

氧化反应是生物体代谢过程中不可避免的一环，会产生各种有害氧化物，如自由基。

自由基对人体细胞和分子造成损害，导致各种疾病的发生。

因此，评估物质的抗氧化活性具有重要的生物学和医学意义。

目前有许多方法可用于测定抗氧化活性，常用的方法有自由基清除法、还原能力测定法和氧化物抑制法。

下面将对它们进行详细介绍。

1.自由基清除法：自由基清除法主要是通过测定物质对自由基的清除速率来评估其抗氧化能力。

常用的方法有DPPH自由基法、ABTS自由基法和超氧阴离子自由基法。

其中，DPPH自由基法是最常用的一种方法。

该法是将DPPH自由基与物质反应，通过测定DPPH自由基消失的程度来反映物质的抗氧化活性。

2.还原能力测定法：还原能力是物质抗氧化活性的重要指标之一、通常是通过测定物质还原过程中电子释放的程度来评估其抗氧化活性。

常用的方法有Fe3+/Fe2+离子还原法和Cu2+/Cu+离子还原法。

其中，Fe3+/Fe2+离子还原法是最常用的一种方法。

该法是将Fe3+还原为Fe2+的过程中，测定还原剂的浓度变化或颜色的变化。

3.氧化物抑制法：氧化物抑制法是通过测定物质对氧化物的生产和活性的抑制能力来评估其抗氧化活性。

常用的方法有脂质过氧化抑制能力法和DNA损伤抑制法。

其中，脂质过氧化抑制能力法是最常用的一种方法。

该法是通过测定物质对脂质过氧化的抑制作用来评估其抗氧化活性。

此外，还有其他一些辅助方法可用于评估物质的抗氧化活性，包括电子顺磁共振(EPR)、化学发光法和细胞抗氧化活性测定等。

这些方法可以提供更加准确和全面的抗氧化活性评估。

总之，抗氧化活性测定是评估物质对自由基和其他氧化物的抗氧化能力的重要手段。

不同的测定方法各有特点，可根据需要选择合适的方法进行评估。

抗氧化活性测定方法的发展将为药物研发、食品安全和环境保护等领域提供有力的支持。

dpph法[001]

DPPH法引言DPPH（2,2-二苯基-1-苦味胍）是一种常用于测定自由基抗氧化活性的方法。

DPPH法是一种简便快速的可见光分析方法，广泛应用于评估食品、药物和天然产物中的抗氧化活性。

本文将介绍DPPH法的原理、实验步骤和数据分析方法。

原理DPPH法是基于DPPH自由基溶液的颜色变化来评估样品的抗氧化活性。

DPPH 自由基溶液呈紫色，但在受到抗氧化物质的作用下，DPPH自由基被还原为无色的DPPH-H，颜色逐渐变浅。

通过测量溶液的吸光度变化，可以计算出样品的抗氧化能力。

实验步骤1. 准备DPPH溶液称取适量的DPPH粉末加入溶剂中（通常为乙醇），摇晃均匀，直到DPPH完全溶解。

2. 预备样品溶液根据需要测试的样品，制备相应浓度的样品溶液。

如果需要，可以通过稀释样品来得到不同浓度的溶液。

3. 准备空白试剂准备一个空白试剂，在其中加入适量的溶剂，以保持实验条件的一致性。

4. 测量吸光度将DPPH溶液、样品溶液和空白试剂分别放入分光光度计中，并设置波长为517 nm。

先测量空白试剂的吸光度作为基准值，然后分别测量DPPH溶液和样品溶液的吸光度。

5. 数据分析计算DPPH溶液的吸光度与样品溶液的吸光度之差，代表了DPPH被样品抗氧化的能力。

可以使用以下公式计算抗氧化能力：抗氧化能力（%）=（A₀ - A₁）/ A₀ × 100其中，A₀为空白试剂的吸光度，A₁为样品溶液的吸光度。

结论DPPH法是一种简便有效的评估抗氧化活性的方法。

通过测量DPPH自由基溶液的吸光度变化，可以得到样品的抗氧化能力。

该方法广泛应用于食品、药物和天然产物的抗氧化活性研究中。

参考文献1.Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable freeradical. Nature, 1958, 181: 1199-1200.2.Mensor LL, Menezes FS, Leitao GG, et al. Screening of Brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH free radical method. Phytotherapy Research, 2001, 15(2): 127-130.。

抗氧化活性测定方法

抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法是一种用于评估物质对自由基活性的抑制能力的方法。

自由基是一种高活性化合物，容易引发氧化反应，并对生物体内的细胞和分子产生损伤。

抗氧化活性的测定方法可以用于评估食品、药物、化妆品和保健品等物质的抗氧化能力，有助于指导其应用和开发。

目前常用的抗氧化活性测定方法包括化学方法、生物方法和细胞方法等。

化学方法主要是通过测定物质对自由基引起的化学反应的抑制能力来评估其抗氧化活性。

其中最常用的方法是自由基清除能力测定，常见的实验方法包括DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和Folin-Ciocalteu法等。

这些方法都是通过测定物质与自由基之间的反应，并通过测定产生的颜色变化或吸光度的变化来评估其抗氧化活性。

生物方法主要是利用生物体内的抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等）作为指标来评估物质的抗氧化活性。

这些方法通常涉及到营养生理学、生物化学和分子生物学等多个领域的知识，需要进行较为复杂的实验操作和数据分析。

细胞方法主要是通过评估物质对细胞的保护作用来评估其抗氧化活性。

常用的方法包括细胞存活率测定、细胞色素c释放测定和DNA损伤测定等。

这些方法通常使用细胞培养技术来培养和处理细胞，在培养期间引入氧化应激物质，然后通过测定细胞的生存状况、重要蛋白的释放和DNA的损伤程度来评估物质的抗氧化活性。

抗氧化活性测定方法的选择取决于所研究物质的性质和应用场景。

不同的方法有其各自的优势和局限性，需要根据具体情况进行选择。

此外，在进行抗氧化活性测定时需要注意实验条件的控制，如温度、pH值、实验时间和浓度等，以确保实验结果的准确性和可重复性。

综上所述，抗氧化活性测定方法是评估物质抗氧化能力的重要手段，对于指导物质的使用和开发具有重要意义。

随着科学技术的不断进步，抗氧化活性测定方法也在不断演变和发展，更多新的方法和技术将会被引入到这一领域，并为相关领域的研究和应用提供更加准确和全面的信息。