DTT水解大豆胰蛋白酶抑制剂的研究_赵美琳

大豆蛋白是人类最主要的植物蛋白质来源，但豆类植物在提供丰富营养的蛋白质资源的同时，又广泛存在着各类营养限制性因子，其中STI 就是其中之一。

一些学者研究发现STI 是导致大豆利用率下降的最根本的原因，它限制了人体和动物对豆类蛋白质的吸收和利用，STI 分子内含有跨链的二硫键，使得STI 结构稳定，耐热耐酸。

许多植物STI 的一个分子可以同时结合两分子的蛋白酶，这就造成了蛋白酶失去与蛋白质底物结合的机会，因此我们必须通过特定的方法除去或克服STI 所带来的不利影响，才能充分利用豆类蛋白质资源。

本文主要选择DTT 对STI 的水解作用，采用分光光度法、SDS-PAGE 和GPC 色谱法相结合，对STI 的水解程度进行分析研究。

1实验材料与方法1.1实验材料1.1.1主要试剂DTT 溶液、TGase 溶液、Tris-Hcl 缓冲液(50moI/L ，pH7.5)、大豆胰蛋白酶抑制剂溶液（5000BAEE/mL ）、BAPNA 溶液（0.4mg/mL ）、胰蛋白酶溶液（5,000BAEE/mL ）、30%(v/v)冰醋酸溶液、电泳试剂等1.1.2主要仪器电子分析天平、电子恒温水浴锅、PHS-25型酸度计、78-1型电磁搅拌器、752分光光度计、DY-III 型电泳仪、Waters 高效液相色谱仪、凝胶成像系统等。

1.2实验方法1.2.1DTT 对STI 的水解DTT 对STI 的水解步骤如图l 所示。

图1DTT 水解STI 的方法对照样为0.25ml 大豆胰蛋白酶抑制剂加入1mL 的TGase(1U/mL)，然后50℃水浴恒温8h 后，100℃灭酶5min,反应液4℃储藏以备后用。

1.2.2采用分光光度法测定STI 水解程度实验方法如图2所示。

图2测定DTT 对STI 的水解步骤对照样为不经处理的STI 原溶液，其余操作相同。

用空白样做参比，分别取样液及对照样溶液，通过比较处理的STI 与不经处理的STI 原液反应的样品在410nm 的吸光值，就可由残留的胰蛋白酶活性间接检测出DTT 及TGase 对STI 的水解程度。

另外，用0.lmL 胰蛋白酶溶液加上0.31mLTris-Hcl 缓冲液，混匀后与2mLBAPNA 溶液于75℃水浴反应15min ，然后加入0.lmL30%冰醋酸中止反应，在410nm 下比色，测定胰蛋白酶的活力(A 410表示)。

当STI 完全水解时，胰蛋白酶表现出最高活力，这时反应液的吸光值最大；当STI 未被水解时，胰蛋白酶表现出最低活力，这时反应液的吸光值最小；当STI 部分钝化时，反应液的吸光值介于他们之间。

因此，可用下式表示STI 钝化的相对活力大小:STI 的相对失活（%）=（样液的A 410值－对照样的A 410值）／胰蛋白酶活力（A 410值）1.2.3SDS-PAGE 分析将STI 与反应液进行SDS-PAGE 分析，电泳胶按表l 所四川职业技术学院学报2010年8月Journal of Sichuan Vocational and Technical College Aug ．2010第2０卷第3期vol．2０No．3收稿日期：２０１０—０６—０８作者简介：赵美琳（１９６８—），女，漯河职业技术学院食品工程系，副教授。

主要研究方向：食品生物技术。

DTT 水解大豆胰蛋白酶抑制剂的研究赵美琳，张素霞（漯河职业技术学院，河南漯河462002）摘要；大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)可以抑制一些来源于动物或植物的蛋白酶的活力，使之降低水解蛋白质的效力，降低蛋白质的利用率。

本文主要选取二巯基苏糖醇（DTT ）采用分光光度法、SDS-PAGE 和GPC 色谱法相结合测定DTT 对大豆胰蛋白酶抑制剂的水解程度进行研究。

关键词；DTT ；水解；大豆胰蛋白酶抑制剂中图分类号:Ｑ５５６．３文献标识码:A文章编号:1672-2094(2010)03-0120-03·１２０·列配制。

表1电泳胶试剂表电泳样品分别为STI标样、DTT与STI反应液、DTT结合TGase与STI的反应液及TGase与STI的反应液。

标样STI的浓度和水解反应中STI的浓度一样，反应液加入等体积的样品缓冲液，电泳时电流先取10mA，待样品完全进入分离胶后，改为20mA，电泳时间为6h。

电泳结束后，凝胶用ρ(考马斯兰R-250)=2.5g/L染色，然后用标准低甲醇脱色液脱色，最后拍照保存。

1.2.4GPC分析1.2.4.1GPC操作条件色谱柱：Protein--Pak TM60(7.8×300mm Column WA-TO85250);流动相：50mMTris-HCl的缓冲液(pH7.5);流速：0.6mL／min；柱温：20℃；进样量：10μL。

1.2.4.2GPC样品预处理将样品溶液与流动相溶液以l：1比例混合，用离心机以8000r／min离心20min后，取10μL注入色谱仪，进行GPC 分析。

2实验结果及分析2.1分光光度法测定STI水解的结果测定实验结果见表2。

表2BAPNA测定实验结果从表中可以看出，DTT单独处理和DTT与TGase酶结合处理均可不同程度的钝化STI，由于DTT的加入，与STI 发生氧化还原反应，使得STI分子内部的二硫键被打断，但DTT并不能完全钝化大豆胰蛋白酶抑制剂，其原因可能是因为DTT并未把STI中的二硫键完全打开。

但DTT和TGase酶结合处理时，TGase可以进一步聚合残存的还原态的STI,因此使STI失活程度更高些，使胰蛋白酶活力残存较高，能够与底物BAPNA生成较多的能在410nm处显色的物质，而热处理及TGase酶单独处理作用对STI钝化作用较小，使胰蛋白酶活力几乎失活，很少与底物BAPNA反应生成在410nm处显色的物质。

2.2SDS-PAGE分析电泳结果见图3。

图3DTT水解大豆胰蛋白酶抑制剂的电泳照片从电泳图带III和IV可以看出，热处理和TGase酶处理STI水解效果不大。

带I和带II中残留STI部位特别是带I 明显减少，说明STI被水解，得出DTT单独处理及DTT和TGase共同处理均可钝化STI活性。

从带I和带II中还可看出，STI经这两种方法处理后均有大分子聚合物生成，并且带I生物聚合物含量大大增加，由于DTT处理后仍有一部分还原态STI残留，当加入TGase后，进一步聚合残存的还原态STI，因此聚合物含量增加。

这就证明：DTT能使STI的分子结构发生改变，从而对STI具有一定的水解作用，其结果与比色法得出的结果相一致。

2.3GPC分析GPC分析结果见图4。

I:由TGase处理的STI II:热处理STI III:由DTT处理的STI IV:由DTT和TGase处理的STI溶液图4DTT水解大豆胰蛋白酶抑制剂的凝胶渗透色谱图从图4中可以看出，STI经DTT处理后，其活性被水解钝化,对应的STI位置及其峰值面积(曲线III峰B)也有一定程度的降低，而DTT和TGase酶结合处理的STI，对应的STI位置峰值及峰面积(曲线IV峰B)均最大程度的降低，这就得出这两种处理方法均可使STI活性降低。

STI经DTT 处理后残留部分还原态STI(曲线III中峰C)和部分高分子量的聚合物(曲线III中峰A)，且此时的残余还原态SIT峰值较高，而生成的聚合物峰值较低，而当加入TGsea酶处理后，ＤＴＴ水解大豆胰蛋白酶抑制剂的研究赵美琳，张素霞·１２１·四川职业技术学院学报2010年8月Journal of Sichuan Vocational and Technical College Aug ．2010第2０卷第3期vol．2０No．3大分子聚合物含量大大增加(曲线IV 中峰A)，而小分子量物质含量大大降低。

该结果也很好的说明了TGase 也可催化还原态STI 小分子量物质发生聚合反应，产生大量高分子聚合物。

由曲线I 、II ，得出热处理及TGase 酶处理STI 均对其作用不大，对应的STI 位置峰值和峰面积基本保持不变，STI 活性被很好保留，因此氧化态STI 不能被TGsea 催化聚合。

这一结果与比色法及电泳法得出的结果也相一致。

3结论STI 对大豆蛋白营养价值的不利影响，需要探索胰蛋白酶抑制剂的灭活方法，本研究主要选用DTT 水解STI ，同时利用DTT 和TGase 酶结合、单独利用TGase 酶以及进行热处理STI 的方法进行对比试验，来测定STI 的水解程度，通过研究DTT 可以使STI 水解，而单独利用TGase 和热处理效果不明显，但若DTT 和TGase 结合处理STI ，其水解程度更好。

由此在食品加工过程中，为了提高大豆蛋白的营养价值，可以采用DTT 结合TGase 处理其原料的方法来提高食品中的蛋白质的营养价值。

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（3）物体重力是否标注：若图中未画重力，且题目中未给定重力大小，按没有重力处理；若题目中写明为轻质杆，也按没有重力处理。

3结束语在约束反力作图时，应该先分析约束的类型和数量，然后根据具体约束类型，运用该类型约束反力判定的原则加以确定，切忌想当然的乱标方向，所定方向应有正确而充分的理论依据。