醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
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第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
2.1引言
醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30],又名醋酸细菌。醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯,也有少部分像椭圆形,由单个、成对或者成链状排列的,大小一般在0.6〜0.8 X.0〜3.0 ym。醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌,它有的细胞是周生鞭毛种类,一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布广泛,在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒,以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。醋酸菌在发酵过程中,会产生大量的醋酸和其他有机酸,而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件,通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验,并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册,做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法
2.2.1材料与仪器
分离样品:取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1a
表2.2.1.a主要仪器设备
Tab 2.2.1.a Main instrument equipment
主要仪器型号厂家
生化培养箱PYX-250S-A长沙科技
双目生物显微镜BME (BA/E3 ) 科力仪器
分析天平BS224S德国来卡手提式不锈钢蒸汽灭菌锅DSX-280B北京化丰
超净工作台SW-CJ-1FD上海南鹏
精密数子式酸度计PHS-3C上海科技
试验试剂:葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaC03、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4 7H2O、FeCb、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯;琼脂食用级。
2.2.2 培养基[33-37]
表2.2.1. b培养基成分表
Tab 2.2.1. b Medium composition
名称踰
糖
酵母
膏
无水乙醇
(v/v)
琼
脂
CaCO3备注
⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5
⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然
⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然
⑷液体保臧培养基1%1%1%pH自然
改进后的斜面液体
⑸
保臧培养基
1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5
Horyer-Frateur 培养
⑺
基
3%pH自然
⑻GYC 培养基10%5%2% 2. 5%pH自然
⑼冋糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%
产5-酮基葡萄糖酸
(11) 土卜拉K甘
^培口养基
3%1%2%2%pH自然
(12)
i\7亦公* -H-"1%1%2%乙酸钙1% pH 氧化乙酸培养基
7.2
乳酸钙2%
(13) 氧化乳酸培养基1%1%2%
pH7.0-7.2乙醇培养基1%3%2%pH自然
注:培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上,30 C培养24 h,加入无菌碳酸钙,灌入并液体
培养基到斜面上,至离管口2cm处,密封冷藏;培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1% , K2HPO40.1% , KH2PO40. 01% , 0.025% , FeCb0. 0005% ;以上培养基均以121C 灭菌20 min。
2.2.3醋酸菌的分离纯化
2.2.
3.1分离纯化实验
称取醋醅样品5g,液态增殖培养48h后,按照浓度梯度10-6、10-7和10-8, 涂布在分离培养基
上,培养2d 后,挑取平板上单个透明圈大的菌落。连续在平板上培养3 次,观察其菌落形态是否一致,选取透明圈又大又清晰的单菌落,转接并保藏于4C的冰箱。
2.2.
3.2 革兰氏染色实验
将上述活化后的菌株,接种于新鲜的培养基培养24 h,制作水晶镜片进行革兰氏染色。
2.2.
3.3 产醋酸定性实验[38]
取活化好的斜面菌种,分别接种于基础培养基中,并加入3% (v/v) 的无水乙醇,32C 震荡培养60 h,取少量除去菌体的培养液,用NaOH溶液(2.5 mol/L) 调节pH至7.0,加入5~6滴5% FeC3溶液,产醋酸细菌会形成红褐色沉淀。
根据2.2.3.3试验和2.2.3.4试验结果,筛选出革兰氏阴性且产醋酸的细菌[39] 为醋酸菌。
2.2.
3.4 醋酸定量实验
经过初步筛选后,把所得菌株接种至发酵培养基中,在32C、140 r/min恒温震荡培养60 h后,检测其发酵液中总酸,每株平行3组。
醋酸定量测定[40]:
精确吸取发酵液2 mL至250 mL三角瓶中,并加入蒸馏水50 mL,滴加1~2 滴0.
5%的酒精酚酞溶液,用已标定过的0.1 mol/L NaOH 溶液滴定至微粉色。
产酸量(g/L) = (V-V 0) >C NaOH >60/样品毫升数;式中:V=发酵液样品滴定耗用的
NaOH毫升数;
V0=以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH毫升数;
C NaOH=NaOH 溶液的浓度(mol/L);
60 为醋酸分子量。
2.2.
3.5 耐酒精能力实验
初筛所得的菌株,分别接种到含有无水乙醇的基础培养基中培养,无水乙醇体积分数从5%到14%,每个梯度相差1%,32E恒温培养3d,观察其是否生长,筛选出耐酒精性能好的菌株。
2.2.
3.6 传代稳定性实验[41]
将上述所筛选出的菌株,每隔一个月,转接纯化后的菌株,连续转接培养7 代,并测定其酸度,来判断、筛选,传代最稳定和产醋酸最高的菌株。