蛋白质的提取

6)detergent- based：提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是要害），梯度离心分离细胞器(ER)，然后分级抽提方法。例如，去掉细胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分。

总的感受：细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便迅速。

到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。

2、分离膜蛋白的方法（操作）

1）分离细胞膜蛋白的方法：

1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。

2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。

3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。

4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。

buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)

buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA

buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),

2）分离细胞膜蛋白的方法：

1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次

2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min

3、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心

4、溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min

5、收集水相留作分析

6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心

7、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积

8、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验

试剂：

1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂

2、缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）

3、buffer C

10mmol/L Tris HCl(pH7.5)

150mmol/L NaCl

5mmol/L EDTA(PH7.5)

3）分离细胞膜蛋白的方法：

7M urea

2M thiourea

4%chaps

2.5%***3-10

1000000个细胞，可用此buffer 1ml。冰浴匀浆。冰上置30分钟。

4度高速低温离心30min。

取上清-20保存。

4）分离组织膜蛋白的方法：

1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。

2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。

3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

4、收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。

Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。

5）分离组织膜蛋白的方法：

RIPA

1XPBS

1%NP40

0.5去氧胆酸钠

0.1%SDS

以下用时加入

10mg/ml PMSF异丙醇（终浓度10ul/ml）

Aprotinin（30ul/ml）

1000mM Sodium Orthovandate（10ul/ml）

冰冻组织100mg/细胞1000000个，可用RIPA buffer 1ml。冰浴匀浆。冰上置30分钟。

4度高速离心30min，20000转低温离心最佳。

取上清-20保存。

6）分离细菌膜蛋白的方法：

①于20ml 营养肉汤中过夜培养细菌，37℃，200rpm。

② 10000g、20min、4℃离心，去上清。

③ 20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。

④超声波破碎细菌。

⑤3000g，10min、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被成分）。

⑥超速离心I：100,000g，60min，4℃，去除上清（胞质成分），收集细菌外被成分。

⑦用10ml含2％的SLS的Tris-Mg 缓冲液重悬沉淀物，室温温育20-30min。

⑧超速离心II：70,000g，60min，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。重复⑦、⑧两步。

⑨充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用0.1-0.2 ml的ddH2O重悬沉淀物。根据公式：蛋白浓度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40ug/ul，该蛋白质样品-70℃贮存。