普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤
PCR包括哪些步骤和方法及步骤的实验过程及原理
PCR包括哪些步骤和方法及步骤的实验过程及原理PCR简介聚合酶链式反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，可以在体外扩增目标DNA 序列。
它通过不断的循环反应，迅速大量复制目标DNA，从而能够快速获取足够的起始模板用于后续的实验。
PCR具有高效、敏感、特异性强等优点，在基因工程、医学诊断和犯罪鉴定等领域得到广泛应用。
PCR步骤和方法PCR主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
这三个步骤通过循环反应，反复进行以达到目标DNA扩增的目的。
1.变性（Denaturation）：在高温条件下（通常为94-98°C），双链DNA被迅速分离成两条单链DNA。
这被认为是PCR反应的起始步骤，使得目标DNA的两个互补链分开，为后续的PCR步骤提供单链DNA模板。
2.退火（Annealing）：降温至50-65°C的退火温度，引入特异性引物（primers），使其与目标DNA序列上的两个互补区域发生配对。
引物是短寡核苷酸序列，用于定位目标序列的起始和终止位置。
3.延伸（Extension）：在60-75°C条件下，DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等）以引物为起点，沿模板链的互补链合成新的DNA链。
延伸速率通常为60-100 bp/分钟。
以上三个步骤完成后，产生的DNA分子会成为下一轮PCR反应的起始模板。
每个PCR循环通常需要几十秒到几分钟的时间。
PCR的方法可以进一步分为常规PCR、荧光定量PCR（qPCR）和逆转录PCR（RT-PCR）等。
PCR实验过程以下是PCR在实验室内的基本步骤：1.提取DNA：从待检测的样品（如血液、组织等）中提取目标DNA。
这一步需要遵循相应的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
2.准备反应体系：将PCR反应所需的各种试剂按比例加入反应管中。
通常，反应体系包括目标DNA、引物、核苷酸、DNA聚合酶、缓冲液和Mg2+等。
3.PCR反应：将反应管置于PCR仪中，按照设定的PCR程序进行反应。
pcr原理,反应体系和基本过程
PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学和遗传学研究的技术，用于扩增DNA 序列。
PCR基于DNA的复制原理，在体外模拟DNA的自然复制过程，通过酶和适当的反应体系，使特定DNA序列在反应中进行指数级扩增。
以下是PCR的基本原理、反应体系和过程：原理：PCR反应基于DNA的双链结构。
通过加热将DNA双链分离为两条单链，然后通过引物（primer）与目标DNA序列的特定区域结合，然后在适当的温度下，DNA聚合酶（DNA polymerase）催化合成新的DNA链，形成两条新的双链DNA。
这个过程包括三个基本步骤：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）。
反应体系：PCR反应通常包含以下组分：模板DNA：要扩增的DNA样本。
引物（primer）：短的DNA序列，与目标DNA序列的两端相互补，作为起始合成新DNA链的起点。
DNA聚合酶：如Taq聚合酶，用于合成新的DNA链。
dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）：包括A、T、C和G四种碱基的单元，供DNA聚合酶使用。
缓冲液：维持反应体系的pH和离子浓度，提供适宜的环境供DNA聚合酶催化反应。
基本过程：PCR反应通常涉及以下的循环步骤，每个循环依次进行变性、退火和延伸：变性（Denaturation）：将PCR反应管中的混合物加热至94-98摄氏度，使DNA双链解离为两条单链。
退火（Annealing）：将反应温度降低至45-68摄氏度，使引物与目标DNA序列的特定区域结合。
延伸（Extension）：将温度提高至72摄氏度，DNA聚合酶催化新的DNA链的合成。
DNA 聚合酶使用dNTPs作为碱基单元，延伸引物，合成新的DNA链。
这个循环步骤会重复多次（通常为20-40次），每次循环都会使目标DNA序列扩增约一倍，最终产生大量目标序列的DNA。
通过PCR，可以在短时间内从少量的起始DNA模板扩增出大量的目标DNA序列，为分子生物学、基因组学研究以及遗传疾病诊断等提供了强大的工具。
PCR的原理和操作步骤有哪些方法进行分析
PCR的原理和操作步骤有哪些方法进行分析PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种基因分析技术，通过扩增DNA片段以实现基因检测和分析。
它广泛应用于医学、农业、环境科学等领域。
本文将介绍PCR的原理和操作步骤。
原理PCR的原理基于DNA的复制机制，通过不断复制目标DNA片段，使其数量呈指数增长。
这种复制过程需要酶的介入，主要涉及三个步骤：变性、退火和延伸。
1.变性（Denaturation）：将DNA双链分离为两条单链。
这一步需要高温（通常是94-98°C），以破坏氢键使双链解开。
这样，我们可以得到两条单链DNA。
2.退火（Annealing）：将引物（primers）与目标DNA序列互补配对。
引物是短的DNA片段，可以选择性地结合目标序列。
这一步发生在较低的温度下（通常在50-65°C），以保证引物与目标DNA序列结合。
3.延伸（Extension）：通过DNA聚合酶的作用在引物的两侧合成新的DNA链。
DNA聚合酶以引物为起始点，向着DNA链的3’端合成新的DNA链。
这一步需要较高的温度（通常在72°C），以确保DNA聚合酶的最佳活性。
通过这三个步骤的循环重复，可以在短时间内扩增目标DNA片段。
操作步骤PCR的操作步骤主要包括制备反应体系、设置PCR程序和结果分析。
1.制备反应体系：PCR反应体系由DNA样本、引物、酶和缓冲液等组成。
首先，将目标DNA片段、引物和其他所需试剂按照一定比例加入试管中。
然后，将反应体系混匀。
2.设置PCR程序：PCR反应需要一定的温度和时间调控。
通常需要设置反应的温度曲线和时间参数。
这些参数包括变性温度、退火温度、延伸温度和循环次数等。
通过合理设置PCR程序，可以确保反应的特异性和高效性。
3.结果分析：PCR反应完成后，可以通过凝胶电泳等技术来分析PCR产物。
凝胶电泳可以根据PCR产物的大小来判断是否扩增成功。
PCR技术的原理与应用ppt课件
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
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锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
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Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
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2.PCR技术的主要类型及其应用
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锚定PCR原理示意图
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标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤普通PCR1概述聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。
可看作生物体外的特殊DNA复制。
DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。
现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。
它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。
PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。
他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。
而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。
此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。
随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。
Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
2 PCR原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
pcr技术的原理和步骤
PCR技术的原理和步骤一、引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它在许多领域中具有广泛的应用。
PCR技术的核心原理是通过体外复制DNA，使得我们能够从微量DNA样本中扩增出足够的DNA量进行后续分析。
本文将详细介绍PCR技术的原理和步骤。
二、PCR技术的原理PCR技术的原理主要基于DNA的复制与扩增过程，它包含以下三个重要步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性PCR反应开始时，DNA模板被加热到95°C，使其两个DNA链分离。
这一步骤被称为变性，它破坏了氢键，使DNA双链变为单链。
变性是PCR技术的起始步骤，确保反应中的DNA单链能够被其他反应物所利用。
2. 退火在变性之后，温度降至50-60°C，引物加入PCR反应体系中与单链DNA互补配对。
引物是短的寡聚核苷酸序列，其中一个与DNA模板的一个单链区段互补，另一个与DNA模板的相对应的区段互补。
引物在退火温度下与DNA单链形成氢键，稳定地结合在DNA模板上。
3. 延伸在退火的温度下，酶聚合酶（Taq polymerase）被加入反应中，它能以引物为起始点，在DNA模板上合成互补链。
Taq polymerase是从一种热水生产的细菌中分离得到的，它能耐受高温，因此可以在PCR反应过程中保持活性。
Taq polymerase能够扩增DNA，其DNA合成速度约为每分钟1000个核苷酸。
PCR技术涉及多个步骤，包括DNA提取、反应体系的准备、PCR反应的设置和PCR产物的分析。
1. DNA提取PCR反应需要DNA作为模板。
DNA可以从多种样本中提取，如血液、组织、细胞培养物等。
DNA提取的方法有多种，包括使用商业DNA提取试剂盒或自行制备DNA提取试剂。
2. 反应体系的准备PCR反应体系通常包括DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液和二硫苏糖醇（DMSO）等。
引物的浓度通常为0.2-0.5 μM，聚合酶的浓度为1-2.5 U/μL。
PCR及原位PCR 的原理和方法PCR的基本原理
• ___有别于原位PCR， 以mRNA为起始物， 而原位PCR以DNA 为起
始物。 • ___有别于液相反转录PCR， 原位反转录PCR反应过程在组织切 片上进行，标记用DNA酶处理，以破坏组织细胞中的DNA，确 保PCR扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA， 残留在细胞中 DNA就不会被扩增。 • ___原位反转录PCR更适宜检测细胞内低拷贝基因检出。
• 细胞---将细胞孵育在含60ug/ml蛋白酶K的PBS中55 C 2小时，
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然后加热到960C 2分钟以使蛋白酶K失活。 • 组织切片---孵育在含有1 ng/1ml pre-digested promase 50mM Tris HCl pH7.5, EDTA. 370C 20-60 min。
原位基因扩增
•
原位基因扩增可通过特异的引物和热稳定DNA聚合酶增加靶 核酸的拷贝数达检出水平
扩增产物的检测
• 扩增产物的可视化可通过以下两条途径进行：直接和间接
直接法原位PCR Direct in situ PCR
• 应用的引物和三磷酸核苷酸分别标以放射性同位素(如 S等)， 非放射
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性同位素（如生物素和地高辛）进行PCR原位扩增，扩增的产物经放 射自显影，免疫组化和亲和组织化学方法进行检测，不需原位杂交检 测特异性扩增产物的一种检测技术。
PCR在体外进行的三个基本步骤 组成PCR的循环反应 0 • 第一步：变性 Denaturation 94 C 30s将所要扩增的基因片段加热， 使双链DNA解离成单链DNA。
• 第二步：复性 Annealing （退火） 55 C 30s当温度下降时，化学方法
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合成的寡核苷酸引物即与所要扩增基因两侧的DNA相结合。
PCR反应基本原理和反应过程
PCR反应基本原理和反应过程什么是PCR？聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是⼀种分⼦⽣物学技术，⽤于体外扩增特定的DNA⽚段。
PCR技术发展简史image.pngPCR之⽗ Kary MullisPCR反应基本原理和反应过程基本原理：反应过程：变性——将被复制的DNA⽚段在⾼于其Tm的条件下（94~95℃）加热，使DNA双螺旋结构的氢键断裂⼆解螺旋，形成两条单链分⼦作为扩增反应的模板，以便与引物结合。
退⽕——将反应体系的温度降⾄寡核苷酸（引物）的熔点温度以下（40~70℃），以便使引物能与模板DNA序列互补结合，形成杂交链。
延伸——将反应体系的温度升⾄72℃左右，此时反应体系按照模板链的序列以碱基互补配对原则以此把dNTP加⾄引物的3’端，在Taq DNA聚合酶的存在下，杂交链不断延伸，直⾄形成新的DNA双链。
PCR反应体系:反应体系为100µL的PCR反应，其反应混合物为：模板DNA 0.1～2µg前后引物各20pmol；20mmol/L Tris-HCl缓冲液 (pH 8.3)；1.5mmol/L 氯化镁；0.05% Tween 20；100mg/L灭菌的明胶或⽆核酸酶的⽜⾎清蛋⽩；1000µmol/L的四种dNTP；25mmol/L KCl；2U的Taq DNA酶。
PCR由变性-退⽕-延伸三个基本反应步骤构成1、模板DNA的变性：模板DNA经加热⾄93℃左右⼀定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退⽕（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降⾄55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。
此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。
该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA⽚段长度。
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR实验（聚合酶链反应）是一种在生物化学中广泛使用的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。
该技术由Kary Mullis于1983年发明，并于1993年获得了诺贝尔化学奖。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的基本原理是利用DNA聚合酶对单链DNA进行复制的能力。
这个过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：在高温（通常为95℃）下，双链DNA被解旋成两条单链模板。
2. 退火：温度降低（一般为50-65℃），引物与模板DNA的互补序列结合。
3. 延伸：在适宜的温度（72℃左右）和DNA聚合酶的作用下，引物沿着模板DNA向两侧延伸，形成新的双链DNA。
这三个步骤循环进行，每次循环都会使目标DNA的数量翻倍，经过几十到几百次循环后，就能得到大量的目标DNA。
二、PCR所需材料1. DNA模板：待扩增的目标DNA。
2. 引物：两段短的寡核苷酸，与目标DNA的两端互补。
3. dNTPs：脱氧核苷三磷酸，作为合成新链的原料。
4. Taq DNA聚合酶：能在高温下保持活性的酶，用于催化DNA的合成。
5. 缓冲液：提供合适的pH和离子环境。
三、PCR操作步骤1. 设计引物：根据目标DNA的序列设计出两条引物，分别与DNA的正反两条链互补。
2. 配制反应体系：将模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶和缓冲液按照一定比例混合。
3. PCR循环：将反应体系放入PCR仪中，设定好变性、退火和延伸的温度和时间，开始循环反应。
4. 产物检测：可以通过凝胶电泳等方法检测PCR产物的大小和数量。
四、PCR的应用1. 分子诊断：如病原体检测、基因突变检测等。
2. 基因克隆：将目的基因扩增后，可以方便地进行后续的克隆和表达。
3. 序列分析：通过扩增特定的基因区域，可以进行基因测序和SNP分析等。
4. 生物考古学：可以从古代样本中提取DNA并进行扩增，研究古生物的遗传信息。
五、PCR实验注意事项1. 引物设计：引物应具有良好的特异性和稳定性，避免产生非特异性扩增和二级结构。
PCR技术原理与过程
Typical PCR Thermal Profile
Program
94℃ ℃ (first step) 1min 1min 1min
37—60℃ ℃ (second step) 1min 1min 1min
72℃ ℃ (third step) 1min 1min 10min
Reps
Cycle1 Cycle2—30 Cycle31*
（四）多重PCR 多重
使用Taq DNA聚合（A组） 聚合（ 组 使用 聚合 酶或Platinum Taq DNA聚合 酶或 聚合 利用5个不同的 酶（B组），利用 个不同的 组），利用 引物对，从人基因组 引物对，从人基因组DNA对 对 dystrophin基因进行多重 基因进行多重 PCR。使用所示引物和模板 。 浓度，从人基因组 浓度，从人基因组DNA中得 中得 到268bp到547bp范围的扩 到 范围的扩 增产物。 增产物。 对于多重PCR，Platinum® Taq ， 对于多重 DNA聚合酶提供了更好的灵敏度 聚合酶提供了更好的灵敏度
三、PCR结果分析 结果分析
四、PCR技术的应用 技术的应用
反转录PCR 反转录 锚定PCR 锚定 反向PCR 反向 多重PCR 多重 实时荧光定量PCR 实时荧光定量 不对称PCR、巢式PCR、长距离 、巢式 不对称 、长距离PCR等 等
（一）反转录PCR 反转录
（二）锚定PCR 锚定
（三）反向PCR 反向
（五）实时荧光定量PCR 实时荧光定量
反应体系中加入荧光基团， 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 反应体系中加入荧光基团 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。 进程， 进程
PCR技术应用实例 技术应用实例——a-地中海贫血的诊断 技术应用实例 地中海贫血的诊断
PCR介绍
dNTPs:
0.6μl×6 = 3.6μl
引物 P：
2.4μl ×6 = 14.4μl
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl
水：
21μl × 6 = 126μl
共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时
混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。 3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混
加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA分子 也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调 整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可 使各种复杂的DNA分子完全变性。
温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活 性和dNTP分子造成损害。
⑵ 复性温度和时间：
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。
总原则是提高扩增的效率和特异性
引物设计原则
⑴ 长度15～30 b，过短特异性降低，过长则成本增加， 产量也下降。
⑵ 引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆 积现象，引物 G+C 含量宜在45 ～ 55%左右。
⑶ 引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹 样二级结构，两个引物之间尤其在 3’ 末端不应有互 补链存在，不然会形成引物二聚体。
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
PCR技术基本原理及相关知识
PCR技术基本原理及相关知识PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学和遗传学研究中常用的基因扩增技术，其基本原理是利用体外体内的DNA聚合酶（通常是热稳定聚合酶）在DNA模板上进行逐渐增加的连续DNA合成过程。
1. 变性（Denaturation）：将DNA双链融解成两条单链。
通常使用高温（约94-98℃）使DNA的双链结构分离，使得DNA模板变为两个单链，以便后续的反应。
2. 退火（Annealing）：在较低的温度下，引物（primers）与DNA模板结合。
引物是一段长度为15-30个核苷酸的短DNA或RNA分子，能与目标DNA序列的两端互补碱基对结合。
这些引物在PCR反应中起到限制DNA合成的作用。
3. 扩增（Extension）：在适温下，DNA聚合酶利用引物开始在目标DNA序列作为模板上进行DNA合成，不断扩增目标序列。
常用的DNA聚合酶是热稳定的聚合酶，常见的是来自热液单纯病毒Taq聚合酶。
PCR反应通常进行30-40个循环，每个循环包括上述三个步骤。
每个循环的时间和温度取决于目标DNA序列和反应条件。
除了基本的PCR技术原理，以下是一些相关知识：1. 反向转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）：可以在RNA模板上合成相应的DNA序列，通过引物合成cDNA，然后进行PCR。
RT-PCR常用于分析转录水平、检测RNA病毒和研究基因表达调控。
3. 嵌段PCR（Nested PCR）：在传统的PCR反应后，再次进行PCR，使用内部引物扩增上一次PCR反应获得的产物。
嵌段PCR提高了灵敏度和特异性。
4. 随机引物PCR（Random Primed PCR）：使用随机引物作为引物，能扩增DNA模板上的所有可能的序列，常用于建立基因文库和DNA指纹。
PCR技术在许多领域应用广泛，如医学诊断、遗传学研究、基因工程等。
其快速、高效、灵敏和特异性的特点使其成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
PCR包括哪些步骤和方法及步骤的关系
PCR包括哪些步骤和方法及步骤的关系PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因检测、疾病诊断和基因工程等领域。
PCR通过体外复制DNA片段，使其扩增到数百万个拷贝，以便于进一步的研究和分析。
PCR技术的核心是酶链式反应，其包括一系列关键步骤和方法。
步骤一：变性（Denaturation）变性是PCR反应的第一步，其目的是将DNA模板的双链DNA分离为单链。
这一步通常在94-98摄氏度下进行，高温能够破坏DNA的氢键，使其解开成两条单链。
步骤二：引物结合（Annealing）引物结合是PCR反应的第二步，它通过降低温度使引物与目标DNA序列的互补区域结合。
引物是一对特异性的寡聚核苷酸，分别位于目标序列的两段。
引物的选择十分重要，必须确保其在特定温度下与目标序列可稳定结合，从而确保PCR的特异性。
步骤三：延伸（Extension）延伸是PCR反应的第三步，它通过加入DNA聚合酶使引物结合的DNA链末端在一定的温度下进行扩增。
DNA聚合酶能够利用存在的单链DNA作为模板合成新的DNA 链。
常用的DNA聚合酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。
PCR可以通过选择合适温度来调控延伸的速度，通常在60-75摄氏度的温度下进行。
这个温度范围既能保证DNA聚合酶的活性，也不会降解引物的稳定性。
PCR循环PCR反应通常会进行多个循环，每个循环又包含了上述三个步骤。
通过循环，PCR 可以一次又一次地复制DNA片段，并且呈指数级的增加。
每次循环的结束，都会产生新的DNA片段，这些片段成为下一轮循环的起始物质。
PCR循环的次数取决于DNA片段的起始数量和扩增的要求。
一般情况下，进行20-40个循环就可以得到足够多的DNA拷贝。
PCR相关方法在基础的PCR反应基础上，还衍生出了其他扩增方法，以满足不同的研究需求。
以下是一些常见的PCR相关方法：1.逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）：在PCR反应中引入逆转录酶，将mRNA反转录为cDNA，然后进行扩增。
PCR技术丨基本原理、各步骤目的、反应体系
PCR技术丨基本原理、各步骤目的、反应体系一PCR技术基本原理PCR是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。
在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程，以拟扩增的模板DNA分子，与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系，经过重复地变性一退火一延伸三步，扩增新的目的DNA链，这个过程通过控制反应体系的温度来实现。
PCR包含下列三步反应：1、变性(denaturation)将反应体系混合物经加热至94℃左右，维持较短的时间，使双链DNA变成单链DNA，便于下一步引物的结合。
2、退火(annealing)将反应体系温度下降到特定温度（一般是引物的Tm值以下)，引物与DNA模板以碱基互补的方式结合，形成模板-引物杂交双链。
退火温度是保证引物与DNA模板互补结合的关键。
由于引物结构简单，加之引物量远远大于模板DNA的数量，所以DNA模板单链之间的互补结合很少。
3、延伸(elongation)将反应体系的温度上升到72℃左右并维持一段时间，在Taq DNA 聚合酶的作用下，以引物为起始点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，从5'→3'方向延伸反应，合成新的DNA双链。
以上三步反应为一个循环，重复进行变性、退火、延伸这三步反应，如此反复循环可以使DNA以指数形式进行扩增。
上述过程1.5小时左右完成，从而使所需的目的DNA片段扩增放大百万倍。
二PCR各步骤目的1、预变性破坏DNA中可能存在较难破坏的二级结构。
使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好地和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要省去这个步骤。
此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。
2、变性一退火一延伸循环(1)模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双徒DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备。
e44-6各种PCR技术的原理及其运用
e44-6 各种PCR技术的原理及其运用名称原理和步骤应用逆转录PCR （RT-PCR）先以mRNA为模板，经逆转录酶催化，获得与mRNA互补的cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR反应。
从总mRNA中，获得特定的无内含子的蛋白质基因反向PCR （Inverse PCR）选择1个在已知序列中缺乏、但在其两侧都存在的RE切点，用相应的RE切割，再用连接酶将酶切片段环化，使得已知序列位于环状分子上，根据已知序列的两端序列设计1对引物，以环状分子为模板进行PCR，就可以扩增出位于已知序列两侧的未知序列，由于引物方向与正常PCR所用的正好相反，故称反向PCR。
用于扩增已知序列两端的未知DNA序列增效PCR （Booster PCR ）当扩增少于1千个拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是引物形成二聚体，二是非特异扩增消耗了酶和引物，导致特异扩增片段产量降低。
为此可设置二步PCR，第一步PCR使用较低浓度的引物，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能性不高，但它并不影响靶序列的扩增，只是产量低。
经15～20个循环后，补充引物量，以第一步PCR产物为模板进行第二步PCR，靶序列的产量将相应增加。
用于拷贝数少的目的基因或序列的扩增巢式PCR （Nested PCR）也是进行二步PCR，与增效PCR不同的是，第二步PCR需使用另外一对引物，并另行设置反应体系。
第二对引物的位置位于第一步PCR引物的内侧，用第一步PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有第一步PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增到。
除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。
一般应用于动物病源基因的鉴别，如梅毒螺旋体、HIV和肿瘤基因等标记PCR （LP-PCR）利用放射性同位素或荧光染料对PCR引物的5′-端进行标记，用来检测靶基因是否存在。
有色互补PCR（CCA-PCR）是其中的一种，它用不同颜色的荧光染料标记引物的5′-端，故扩增后的靶基因序列分别在两端带有不同颜色的荧光，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根此法可用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的型别鉴定等据不同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增情况。
PCR的基本原理和操作步骤包括哪些方面内容
PCR的基本原理和操作步骤包括哪些方面内容介绍聚合酶链式反应（PCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，它能够在体外复制和扩增DNA片段。
PCR的原理是通过不断重复的循环反应，将少量的DNA模板扩增为大量的DNA产物。
本文将介绍PCR的基本原理和操作步骤。
PCR的基本原理PCR的基本原理包括三个步骤：变性、退火和延伸。
这三个步骤需要在不同的温度下进行，通过PCR仪的温度控制来实现。
1.变性（Denaturation）: PCR反应开始时，将PCR反应管中的DNA模板加热至94-98°C的高温，使其双链DNA解链成两条单链DNA。
2.退火（Annealing）: 将温度降低至50-65°C，引入PCR引物（即DNA扩增的起始序列），使其与单链DNA特异性结合。
3.延伸（Extension）: 将温度提高至72°C，加入热稳定DNA聚合酶（例如Taq DNA聚合酶），使其在目标序列上进行DNA链的合成，产生新的DNA片段。
以上这个循环被称为一次PCR循环。
通过循环反复执行这三个步骤，就能够在很短的时间内扩增出大量的目标DNA片段。
PCR的操作步骤1.实验前的准备工作：准备PCR反应液的各种试剂（如DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液等），并确保操作台面及实验器皿清洁。
2.制备PCR反应液：按照所需扩增片段的大小、反应体系的要求，精确称取所需试剂，并按照比例加入PCR反应管。
反应液的配制需在无菌条件下进行。
3.反应条件的设置：根据反应体系的要求，设置PCR仪的温度程序。
一般而言，PCR反应的条件包括反应温度、变性时间、延伸时间等。
4.PCR反应：将PCR反应管置入PCR仪，并启动PCR反应。
通过PCR仪的控制，反复执行PCR的三个步骤，直至达到所需扩增的DNA片段的数量。
5.PCR产物分析：将PCR反应产物进行电泳分析，用于检测扩增的DNA片段的大小和纯度。
结论PCR作为一种重要的分子生物学技术，已经被广泛应用于基因工程、疾病诊断、人类遗传学研究等领域。
PCR的原理和操作过程
PCR的原理和操作过程PCR是一种在分子生物学中广泛使用的技术，它能够在短时间内从少量DNA样本中扩增大量DNA。
PCR的全称是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），它是由美国科学家基利斯与生物技术先驱的名字关联而来。
PCR基本原理：PCR的基本原理是通过反复进行三个步骤的循环反应，这三个步骤是：变性、退火和延伸。
通过这个循环过程，每一轮的PCR会在每个目标DNA分子的两端复制一个新的DNA分子，这样反复迭代多次，就可以在短时间内从一个DNA分子扩增出大量DNA。
PCR的操作过程：PCR技术主要涉及到以下步骤：DNA提取、PCR反应体系的制备、PCR循环反应、分析PCR产物。
1.DNA提取：PCR的第一步是从所需的生物样品中提取DNA。
这涉及到细胞破碎和DNA分离的过程，常用方法有酚/氯仿法和商业DNA提取试剂盒。
DNA提取的目的是获取纯度高、浓度适中的DNA样本。
2.PCR反应体系的制备：制备PCR反应需要购买PCR试剂盒，并根据试剂盒的指南来配制反应液。
PCR反应液包括模板DNA、聚合酶、引物、核苷酸、Mg2+ 离子和缓冲液。
聚合酶一般使用DNA聚合酶，如Taq聚合酶。
引物是用于选择DNA特定区域的两个短DNA片段，引物设计的合理性直接影响PCR扩增的结果。
3.PCR循环反应：PCR循环反应是PCR的核心步骤。
它主要包括三个不同的温度区域：变性区域、退火区域和延伸区域。
PCR每个循环包括以下步骤：- 变性（Denaturation）：将PCR反应体系加热至95-98摄氏度，使双链DNA解链为两个单链DNA。
- 退火（Annealing）：将PCR反应体系降温至40-65摄氏度，使引物与模板DNA的互补序列结合。
- 延伸（Extension）：将PCR反应体系升温至72摄氏度，使DNA聚合酶从引物的3'端延伸合成新的DNA链。
这个步骤称为延伸或扩增。
以上三个步骤组成了PCR的一个循环，一个完整的PCR反应通常包含25-35个循环。
PCR 技术的种类及其应用
PCR 技术的种类及其应用1PCR 技术的基本原理PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下, 依赖于DNA聚合酶(T aq酶)的酶促合成反应。
其具体反应分三步：变性、退火、聚合。
以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。
2PCR技术的种类2.1反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA 作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。
该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。
用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。
该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。
这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。
②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid 中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。
2.2锚定PCR(Anchored PCR, APCR)技术用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。
应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。
2.3不对称PCR(asymmetric PCR)技术两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。
在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。
PCR技术的原理与方法
PCR技术的原理与方法PCR定义PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DN A为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DN A。
可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。
PCR技术的基本原理一.PCR反应成分：1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2 等。
二.PCR反应基本步骤：1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。
2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。
3.延伸：中温延伸。
DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。
2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。
3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2 存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。
以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。
•PCR扩增的基本方法•PCR反应的成分和作用总体积：一般为25μl～100 μl（一）无Mg2 buffer：由纯水、kcl、Tris组成。
Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。
kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。
（二）Mg2 :终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的3.延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。
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普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤普通PCR1概述聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。
可看作生物体外的特殊DNA复制。
DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。
现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。
它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。
PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。
他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。
而现今所发展出来的PCR 则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。
此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。
随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。
Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
2 PCR原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在T aqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
3 PCR反应体系与反应条件3.1标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物200μl引物10～100μl模板DNA 0.1～2μgTaq DNA聚合酶 2.5 μlMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水100 μl3.2 PCR反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)。
［PCR步骤］标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
现在有些PCR因为扩增区很短，即使T aq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
4 PCR反应特点4.1特异性强PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③T aq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。
引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。
聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。
再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
4.2 灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。
能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
4.3简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。
扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
4.4 对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
5 PCR常见问题5.1假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有T aq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
5.2 假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
5.3 出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：必要时重新设计引物。
减低酶量或调换另一来源的酶。
降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
5.4出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
适当降低Mg2+浓度。
增加模板量，减少循环次数。
原位PCR在科学研究中，每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的发展。
纵观形态研究领域，50年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；60-70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位，对医学生物学的发展无疑产生了深刻的影响。
70年代，分子生物学技术在形态学中的广泛应用，随着原位杂交技术的出现，使组织细胞内特定的DNA或RNA序列能够被定位，将蛋白质水平又提高到基因水平即核酸分子的观察和定位，从而使人类对许多生命现象在基因水平上的认识得以深化；80年代，分子生物学领域中一项具有强大生命力的技术PCR——多聚酶链反应技术问世了，很快地就被引入形态学观察的领域，使细胞内低拷贝或单拷贝的特定DNA或RNA得以进行定位及观察。
这一技术的问世，必将带来更多的研究成果，使形态学的研究又向前迈出一大步。