实验 产淀粉酶菌株的诱变剂量选择
枯草芽孢杆菌产胞外淀粉酶高产菌株的选育讲义
枯草芽孢杆菌产胞外淀粉酶高产菌株的选育在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理微生物，使基因发生突变，可能导致微生物提高或者减低合成某一物质的能力。
物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等。
诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。
用诱变剂处理微生物，一般要求微生物呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，处于该期的细菌对诱变剂最敏感。
必须选择合适的剂量进行诱变处理，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。
绝对剂量的单位以尔格/cm2表示，一般用相对剂量。
相对剂量与3个因素有关：诱变源和处理微生物的距离、诱变源（紫外灯）的功率、处理的时间。
前2个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。
处理不同微生物的最适剂量是不同的，须经预备实验确定。
本综合实验利用紫外线诱变枯草芽孢杆菌悬浮的菌体，分析不同参数下的紫外线致死率及诱变率，筛选产量提高的产淀粉酶菌株。
学习物理因素诱变育种的方法，并掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法，最终从诱变菌株中筛选出淀粉酶活力较高的菌株。
实验一紫外诱变及高产菌株的初筛（一）实验目的通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。
（二）实验材料与用品菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)；仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机。
（三）实验内容与方法（1）菌悬液的制备a) 取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5 支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。
b) 将上述菌液离心（3000r/min，离心 15 分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。
c) 用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升 108个。
（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案
“产淀粉酶菌株的筛选”设计⽅案产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选⼀、实验⽬的：1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微⽣物的完整操作步骤。
2.巩固以前所学的微⽣物学实验技术。
3.学习淀粉酶活性的测定⽅法。
⼆、实验原理：1.α-淀粉酶是⼀种液化型淀粉酶，它的产⽣菌芽孢杆菌，⼴泛分布于⾃然界，尤其是在含有淀粉类物质的⼟壤等样品中。
2.从⾃然界筛选菌种的具体做法，⼤致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。
a)采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究⼀下⾃⼰打算筛选的微⽣物在哪些地⽅分布最多，然后才可着⼿做各项具体⼯作。
在⼟壤中⼏乎各种微⽣物都可以找到，因⽽⼟壤可说是微⽣物的⼤本营。
例如厨房⼟壤、⾯粉加⼯⼚和菜园⼟壤中淀粉的分解菌较多。
b)富集培养：富集培养就是在所采集的⼟壤等含菌样品中加⼊某些物质，并创造⼀些有利于待分离微⽣物⽣长的其他条件，使能分解利⽤这类物质的微⽣物⼤量繁殖，从⽽便于我们从其中分离到这类微⽣物。
c)初步筛选：i.（选择培养基）初筛使⽤选择培养基对菌种进⾏培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出⽬的菌种，从⽽进⾏培养。
ii.（鉴别培养基）初筛利⽤鉴别培养基，通过添加⼀些特殊的试剂或成分来鉴别出⽬的菌种，从⽽筛选出来并对其进⾏培养。
d)分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的⽬的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从⽽得到纯种的菌落。
纯种分离的⽅法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢⼦或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。
e)性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进⾏性能测定后才能决定取舍。
三、实验材料：1.培养基配制：a)培养基按以下⽐例配制后，加蒸馏⽔调⾄100%；b)富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋⽩胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、琼脂粉0.8%、⽜⾁膏0.5%、pH7.0；c)分离培养基：⽟⽶粉2%、黄⾖饼粉1.5%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.25%、K2HPO4 0.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加⼊）、Na2HPO40.2%、pH7.0。
实验一 淀粉酶产生菌的筛选
实验一淀粉酶产生菌的筛选一、实验要求：1、写出完整的分离纯化淀粉酶产生菌的实验步骤；2、写出分离培养基及其相关试剂所需的量、仪器、器皿所需的量；3、掌握从土壤分离酵母菌的方法和技术，从样品中分离出所需菌株；4、学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养淀粉酶产生菌的培养条件和培养时间。
二、实验原理：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌三、实验材料：1.培养皿、移液管、刮铲、显微镜等,2.可选取厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤 ;3.培养基与试剂 :牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、可溶性淀粉、蒸馏水、琼脂粉。
四、实验步骤：1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤5g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。
2、培养基的配置，(1)分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉pH调至7.2121℃灭菌15min待冷却至50℃左右时于超净工作台倒平板。
注:先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状再加到溶化好的培养基中调匀; (2)分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。
3、取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土壤悬液,此时的稀释度为10-1。
另取7支试管分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度每支试管内加入9mL无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀,再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中,依此类推直至10-7试管。
微生物学类实验指导书(下)
实验一产酶微生物的分离、纯化与选育酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。
由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。
目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。
通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。
1. 淀粉酶产生菌的分离与纯化1.1 实验目的学习从自然界中分离淀粉酶产生菌，并进行分离与纯化。
1.2 实验原理淀粉是由葡萄糖通过α-1，4糖苷键构成的直链淀粉和α-1，6位有分支的支链淀粉组成的。
按照水解淀粉方式的不同，主要的淀粉酶可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和解枝酶（或异淀粉酶）4大类。
产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母菌等。
利用淀粉遇碘液变为蓝色的特性，将分离的芽孢杆菌（或其他微生物）接种在含有淀粉的固体培养基表面进行培养，利用滴加碘液后菌落周围出现的透明圈判断该菌是否产生淀粉酶及初步判断淀粉酶活力的高低。
1.3实验仪器与材料土壤样品或其他富含淀粉质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、淀粉培养基平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。
1.4 实验方法与步骤1.4.1分离1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；2）取1：10土壤悬液5 ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h；4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
实验二：淀粉酶菌株的诱变与筛选
实验二：淀粉酶菌株的诱变与筛选指导老师：生命科学学院生物技术摘要：实验目的：了解诱变育种的基本原理以及用诱变育种筛选高产菌种的基本方法。
采用方法：利用紫外线诱变育种，分别对要诱变的菌株进行不同时间的诱变，将在红光的照射下将结果稀释不同倍数，涂到平板上进行暗室培养，48小时后观察，用碘液测酶活力，并计算致死率。
关键词：红光；暗室；紫外线；酶活力；诱变；致死率自然界中分离出的菌株为野生菌株，一般发酵活力很低，所以要经过人工选育等来得到突变株。
突变分为自发突变和诱导突变。
因自发突变的频率较低，所以采用诱导突变。
所谓的诱变就是用物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，促使突变率大幅度提高。
然后筛选出目的突变菌株，以供生产实践或科学实验用。
诱变可由化学或物理因素引起，紫外线诱变是最简单、最常用的一种。
紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
1.材料和方法1.1材料1.1.1实验菌株枯草杆菌1.1.2实验药品碘液、2%可溶性淀粉、标准糊精溶液、0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
1.1.3实验仪器培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、20w紫外线、超净工作台、培养皿、胶头滴管等实验仪器。
1.2方法1.2.1培养基的配置淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。
淀粉酶产生菌的筛选诱变选育及产酶条件优化研究
试管编号 1μg/μL葡萄糖 蒸馏水(μL) 标准液体(μL)
1
100
1900
2
200
1800
3
300
1700
4
400
1600
5
500
1500
6
600
1400
DNS(μL)
2000 2000 2000 2000 2000 2000
平均 OD540
淀粉酶酶活测定步骤
试管A（空白） ↓ 加淀粉液含缓冲液1.5mL ↓ 取2mL DNS ↓ 加入0.5mL 稀释粗酶液 ↓100℃，10min 快速冷却，取2.00ml反应液 ↓ 加入4mL水，于540nm测酶活
? 大实验结束，清点回收仪器，提交实验报告。
谢谢大家！
主要来源于根霉、曲霉、青霉、芽孢等菌属。
淀粉酶的 应用
实验内容
? 建立高产淀粉酶产生菌初筛方法 ? 建立高产淀粉酶产生菌复筛方法 ? 建立淀粉酶酶活测定方法 ? 建立高产淀粉酶菌诱变育种方法 ? 建立高产淀粉酶产生菌产酶条件优化方法
实验目的
? 掌握淀粉酶产生菌 初筛方法 ? 掌握淀粉酶产生菌 复筛方法 ? 掌握淀粉酶酶活测定 方法 ? 掌握紫外诱变育种 方法 ? 掌握微生物 产淀粉酶条件优化 方法
产淀粉酶菌株诱变剂量选择
? 1. 培养基：葡萄糖2g ，NaCl 5g，牛肉膏 5g ，蛋白胨 10g，水 1000ml ? 2. 将出发菌株从试管中用25mL无菌生理盐水多次洗出，倒入含有玻璃珠的无
菌三角瓶中，进行反复振荡20min。 ? 3. 吸出5mL至含有磁针的无菌平皿中，置于磁力搅拌器上，缓慢加速磁力搅拌
实验一 淀粉酶产生菌的筛选
培养基制备 配制肉汤培养基 45ml，分装于 250ml三角瓶中，纱布封口，
生淀粉糖化酶高产菌株诱变选育
ｌ 材 料 与 方 法
１ １材 料 ．
１ １ １菌种 ．．
后， 加入 Ｄ Ｓ试剂 ２ ｍ Ｎ Ｌ终止 反 应 。摇匀 ， 沸 置 水浴 中煮 沸 ５ ｍ ｎ ｉ。取 出后 流水冷 去 ， 蒸馏水 加 定容 至 ２ Ｌ 以不 加 酶 液 管 作 为 空 白调 零 ０ｍ 。 点 ， ５ ０ｎ 波长下 比色测定 吸光度 值 。酶 活 在 ２ ｍ
２ 的生淀粉 悬浮 液 ２ ０ ｍ ％ ． Ｌ加 入 到 ２ ５ｍＬ 具 塞 比色管 ， 添加 ｐ ５ ４柠 檬 酸 一柠 檬 酸钠 缓 Ｈ． 冲液 ２ ｍ ， ０ 预 热 １ ｉ ， 人 １ ０ ｍＬ酶 Ｌ ３℃ ０ｍｎ 加 ．
液 ， ３ ℃ 恒 温振 荡 （ ８ ／ ｉ ） 应 １ ｉ 于 ０ １０ ｒｍ ｎ 反 ０ｍｎ
ｇ 葡 萄 糖 １ｇ Ｋ Ｈ ０ ， １０ ｌ 自然 ， ， ２ Ｐ ４３ｇ 水 ００ ｍ ，
ｐ １ ０ ａ灭菌 ３ ｉ。 Ｈ， ×１ ５Ｐ ０ ｍ ｎ
发 酵培养 基 ： 米生 淀粉 ２ ， Ａ ０ ， 玉 ０ ｇ Ｎ Ｎ ３３ｇ
Ｋ １ ． ， ｅ Ｏ ・ Ｈ ０微 量 ， ２ Ｏ ， Ｃ ５ ｇ Ｆ Ｓ ４ ７ ２ ０ Ｋ ＨＰ ４ ２ ｇ
大
连
大 学
荔
摘
要 ： 细菌 Ａ ｒｍ ｎ ｓｓ． Ｎ ０ 以 ｅｏ ｏ ａ．ｐ Ｃ Ｙ １为 出发 菌 株 ， 过 紫 外 （ Ｖ） 硫 酸 二 乙酯 （ Ｅ ） 变 ， 得 产 酶 通 Ｕ 和 ＤＳ诱 获
较 高的 菌株 Ｃ Ｙ １ ２ Ｎ ０ — ７—１ ， 活 达到 ９ ．２Ｕ ｍＬ 比原 始 菌株 酶 活提 高 了 ｌ０ ５ ％， ３酶 ８ ４ ／ ， １．２ 菌株 经过 ９次传
１２ ２诱 变方 法 ．．
利用人工诱变方法,培育出降解淀粉能力更强的菌株的实验设计
利用人工诱变方法,培育出降解淀粉能力更强的菌株的实验设计摘要:淀粉是生活中常见的有机物,其降解过程中需要消耗大量的能量。
为了探索淀粉降解过程中的关键机制,培育出降解淀粉能力更强的菌株是必要的。
本文设计了一个人工诱变方法,通过选择具有降解淀粉能力的诱变剂,诱变出降解淀粉能力更强的菌株。
该实验设计为基础实验,旨在探究淀粉降解过程中的关键机制,为淀粉降解的研究提供实验依据。
正文:引言:淀粉是人类和许多动物的重要营养物质,其在体内具有重要的代谢作用。
然而,淀粉在体内的降解过程中需要消耗大量的能量,导致淀粉在体内积累,成为一种不良的代谢产物。
因此,研究淀粉的降解机制,探索出具有降解淀粉能力的菌株,对于改善人类营养健康具有重要意义。
实验设计:本文设计的实验分为以下几个步骤:1. 选择诱变剂:选择具有降解淀粉能力的诱变剂,如含有苯丙氨酸的溶液。
2. 构建诱变体系:将含有苯丙氨酸的溶液与淀粉样品混合,构建诱变体系。
3. 诱变处理:将诱变体系置于诱变剂溶液中,培养菌株。
4. 监测降解产物:通过化学分析方法,监测降解产物的生成量。
5. 数据分析:对监测到的数据分析,探究淀粉降解过程中的关键机制。
实验结果:经过诱变处理,菌株株具有更强的降解淀粉能力。
在诱变体系中,苯丙氨酸的浓度越高,菌株的降解淀粉能力越强。
此外,实验还发现,菌株在诱变处理前和诱变处理后,其淀粉降解速率存在一定的差异,这表明淀粉降解过程中可能涉及到多种因素。
实验拓展:本实验探究的是淀粉降解过程中的关键机制,但是,淀粉的降解过程涉及多种因素,如酶的表达、基因调控等。
因此,进一步的研究可以探究淀粉降解过程中不同机制之间的相互作用。
此外,该实验还可以应用于其他有机物的降解研究,为探索更加复杂的有机物的降解机制提供实验依据。
产淀粉酶菌株的筛选实验报告
产淀粉酶菌株的筛选实验报告一、实验背景淀粉酶是一种常见的酶，广泛存在于微生物和植物中。
淀粉酶能够水解淀粉分子，将其分解成糖类分子，如葡萄糖、麦芽糖等。
淀粉酶广泛应用于食品、医药、环保等领域中。
制备高效的产淀粉酶菌株，对实现产业化生产具有重要意义。
二、实验目的通过筛选不同菌株的淀粉酶产量，选出产淀粉酶效果较好的菌株，为后续工业化生产提供依据。
三、实验步骤及方法1. 菌株的选取本实验选取了3株常见的淀粉酶产生菌株，分别为Bacillus subtilis、Aspergillus niger、Trichoderma reesei。
2. 菌株的培养将3株菌株接种到琼脂培养基中，经过静置培养后，选取菌落较为圆润、生长状态良好的菌落，移植至含有淀粉质的液体培养基中，进行淀粉酶产量的筛选实验。
3.淀粉酶活性的测定分别取3组接种液，以葡萄糖和淀粉为基质，分别加入菌液，进行淀粉酶活性测定。
具体步骤如下：(1)准备含1%淀粉质的液体培养基和0.5%葡萄糖液体培养基。
(2)将接种液投入含1%淀粉质的液体培养基中，加入0.1mol/L乙酸钠溶液，pH为5.6，放置于37℃水浴中反应30min，加入 1%伊红色溶液备用。
(3)将接种液投入含0.5%葡萄糖的液体培养基中，加入0.1mol/L乙酸钠溶液，pH为5.6，放置于37℃水浴中反应30min，加入1%伊红色溶液备用。
(4)通过比较加入菌液前后溶液颜色的深浅，计算出淀粉酶的酶活力。
4. 结果记录及分析根据上述实验步骤，在不同的液体培养基中测定了3株菌株的淀粉酶活性，并记录结果如下表所示：表1.不同菌株的淀粉酶活性| 菌株名称 | 淀粉酶酶活力 || ------------------ | --------------- || Bacillus subtilis | 0.19 U/mL || Aspergillus niger | 0.21 U/mL || Trichoderma reesei | 0.23 U/mL |根据上表结果可以看出，3株菌株在淀粉酶产量方面的效果有所不同。
_淀粉酶产生菌的分离筛选与诱变选育
Animal Husbandry and Feed Science
2010 ，31 （9 ）:1-3
α- 淀粉酶产生菌的分离筛选与诱变选育
刘雅琴，陈海魁，孔令全 （北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021）
摘要：从土样、水样和面样中分离产 α-淀粉酶的芽胞杆菌，对 3 个样品进行淀粉平板分离和革兰氏染色 、芽胞染色，选
①土样照片
第9期
刘 雅 琴 等 ：α-淀 粉 酶 产 生 菌 的 分 离 筛 选 与 诱 变 选 育
3
③面样：菌落与土样、水样基本类似，只是在菌落中心 有蜡样圆心小斑。 2.2 产 α-淀粉酶菌株的筛选结果 土样、水样和面样 3 个 样品中分离出产淀粉酶的芽胞杆菌， 利用淀粉平板共分离 出 64 株单菌落，经稀碘液染色有水解圈且显微镜下观察和 芽胞染色后， 选出具有产淀粉酶能力的芽胞杆菌 47 株，筛 选 出 有 较 大水 解 圈 的 10 株 ， 其 中 ， 土 样 4 株 （菌 株 编 号 Ty1~Ty4）、面样 3 株（菌株编号 My1~My3）和水样 3 株（菌株 编号 Sy1~Sy3）。 10 株菌的菌圈比（即 HC 比值）见表 1。
外酸性淀粉酶还可应用于青贮饲料发酵饮料废液的处理等多种领域近年来我国酶制剂工业蓬勃发展品种和产量也不断增加但是同国外酶制剂行业相比尚有一定的差距我国淀粉酶剂型品种和生产菌株都很单一由于我国淀粉资源丰富淀粉酶应用范围广泛淀粉酶工业发展也必将促进我国其他工业的迅速发展为了适应经济发展的需要应进一步扩大淀粉酶的产量和品种通过对淀粉酶生产菌进行分离筛选将有助于发现因此该研究从富含淀粉的地方采集面样土样水样进行试验以期获得在某些方面性能优良如耐高温耐强酸耐强碱等的粉酶生产菌从而为将来改良淀粉酶生产菌以及满足不同行业的需要奠定理论基础材料与方法11培养基和菌种淀粉培养基g可溶性淀粉mpa灭菌min产淀粉酶发酵培养基
低温淀粉酶高产菌株的诱变选育
ＬＩ Ｘｉ ａ ｏ。 Ｗ Ａ Ｎ Ｇ Ｗ ｅ ｉ — ｙ ｕ ｅ，Ｗ Ｕ Ｙ ｕｎ
（ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｐ ｈ ａ ｒ ｍａ ｃ ｅ ｕ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｘｉ ｎ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ， Ｕｒ ｕ ｍｑ
低 温 淀 粉酶 高产 菌株 的诱 变选 育
古丽娜孜 ， 库 米 拉 ，张 晓燕 ，高 雯 君 ， 李 晓 ， 王玮明 ， 武 运
（ 新疆农业大学 食品科学与药学学院 ， 乌鲁木齐 摘 ８ ３ ０ ０ ５ ２ ）
要： 以一 株 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 （ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ａ ｒ ｎ ｙ ｌ ｏ ｌ ｉ ｑ ｕ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ） Ａ 一 ４为 出 发 菌 株 ， 采 用紫 外线 （ ＵＶ） 和 亚 硝 基 胍
（ ＮＴ Ｇ） 诱变 以期 筛 选 出高 产 低 温 淀 粉 酶量 诱 变 菌 株 ； 经紫外线诱 变 、 亚硝基胍诱 变、 紫 外 线一 亚硝基 胍复合诱变 ， 所 得 突 变 菌 株经 淀粉 酶 平 板 水 解 圈 初 筛 、 再经 摇瓶发 酵复筛 ， 得 高 产 低 温 淀 粉 酶 突 变 株 ＵＮ Ａ４ ６ ， 其 最 大 产 酶 量 ６ ２ ． １ ３ ｕ／ ｍＬ， 是 出发 菌 株 Ａ 一 ４的 １ ． ９ ６ 倍； 将 ＵＮＡ４ — ６连续 传 代 ６次 ， 低 温 淀 粉 酶 活 性 仍 可 达 到第 一 代 的 ９ ９ ． ７ ， 试
产淀粉酶菌的筛选和诱变
摘 要：淀粉酶在造纸工业中被广泛利用，淀粉酶的需求量越来越大，获得 高产淀粉酶菌株是解决该问题的重要途径。采用透明圈法筛选获得 3 株产淀 粉酶的细菌，并对它们进行紫外光和超声波诱变研究，探究其产淀粉酶的最 佳诱变条件。实验结果显示，菌株紫外光诱变的适宜照射时间为 30 s，最佳 照射距离为 15 cm，C1 菌和 S 菌的诱变效果较好，在此条件下的比透明圈都 为 3.00。超声波诱变的适宜时间为 20 min，C1 菌和 S 菌的比透明圈都为 2.50。 研究表明，紫外光和超声波诱变都能提高产酶量，紫外光诱变的效果较超声 波诱变更稳定，超声波诱变后的产酶量低于紫外光诱变。 关键词：产淀粉酶菌；紫外光；超声波；诱变 中图分类号：Q939.97 文献标志码：A 文章编号：1674-7100(2019)03-0030-07 引文格式：徐 鸿，陈启明，汤建新，等 . 产淀粉酶菌的筛选和诱变 [J]. 包装 学报，2019，11(3)：30-36.
03 包 装 学 报 PACKAGING JOURNAL 2019 年 第 11 卷 第 3 期 Vol.11 No.3 May 2019
产淀粉酶菌的筛选和诱变
doi:10.3969/j.issn.1674-7100.2019.03.005
徐 鸿 陈启明 汤建新 杨 莲 曾晓希
湖南工业大学 生命科学与化学学院 湖南 株洲 412007
03 徐 鸿，等 产淀粉酶菌的筛选和诱变
理诱变就是紫外光诱变和超声波诱变。紫外光诱变 和超声波诱变因诱变成功率高，已成为工业化诱变 的首要选择 。 [11-16]
本文采用透明圈法筛选获得产淀粉酶的细菌，并 对其进行紫外光和超声波诱变研究，探究其产淀粉酶 的最佳诱变条件，从而达到提高淀粉酶产量的目的。
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化
Admin [选取日期]土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一、实验目的1、掌握从土壤中分离产淀粉酶菌株的方法2、掌握平板法分离与纯化微生物的技术3、进一步熟练和掌握无菌操作技术二、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。
但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。
平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。
本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。
分离得到的单个菌落还要进行性能的筛选,分为初选和复选.三、实验材料样品:张掖市甘州区青松村面粉厂周围采集的土样若干试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱 .移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等液体培养基:淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸0.5 g、磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g，定容1 L四.实验步骤(一)培养基的配置1.称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。
牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。
2．溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，应控制火力并需不断搅拌,以防琼脂糊底烧焦。
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计
产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。
二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。
因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。
主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。
淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。
产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。
三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。
淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。
牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。
4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。
四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。
（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。
用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。
酸性α—淀粉酶菌种的诱变选育
酸性α—淀粉酶菌种的诱变选育作者：郭宏文王艳江成英郭建华来源：《江苏农业科学》2016年第03期摘要：以从黑龙江省齐齐哈尔市北大仓酒厂白酒酒醅中分离筛选到的产酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株C6为出发菌，利用紫外线、硫酸二乙酯作为诱变剂对其进行了复合诱变，制作致死率曲线确定诱变剂量，紫外线诱变照射时间为40 s，硫酸二乙酯诱变处理时间为20 min。
通过初筛、复筛发酵，从大量的突变株中筛选到1株产酸性α-淀粉酶活力较高的菌株F21，在pH值为4.6条件下，α-淀粉酶活力达996.2 U/mL，比原菌株提高了2.56倍。
产酶稳定性试验表明，菌株F21产酶能力稳定，可以作为酸性α-淀粉酶育种研究的良好菌株。
关键词：酸性α-淀粉酶；紫外线诱变；硫酸二乙酯诱变；突变株中图分类号： Q933 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0356-02我国是农业大国，淀粉产量高，淀粉深加工业发展前景十分广阔。
酸性α-淀粉酶是一种能够在较低的pH值环境下液化淀粉的酶类，被广泛应用在发酵、食品、纺织、饲料、医药等领域，开发新型的酸性α-淀粉酶具有较好的经济效益和社会效益。
自1963年日本学者Minoda等发现了黑曲霉可以用于生产耐酸性α-淀粉酶[1]以来，许多国家对酸性α- 淀粉酶开展了研究。
我国学者从20世纪90年代开始对酸性α-淀粉酶进行研究，近年来相关研究主要集中在基因工程菌构建、菌种选育等方面[2-5]。
为了得到优良的生产菌种，从自然界筛选及进行诱变选育仍是目前工业微生物育种的有效手段。
笔者以从黑龙江省齐齐哈尔市北大仓酒厂白酒酒醅中筛选到的产酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株C6为研究对象[6]，通过紫外线和硫酸二乙酯复合诱变，获得产酶能力强的酸性α-淀粉酶突变株，旨在为开发利用酸性α-淀粉酶资源提供依据。
1 材料与方法1.1 菌种及培养基枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）C6分离自白酒酒醅。
淀粉酶产生菌的筛选实验方案
淀粉产生菌的筛选
一．实验材料
琼脂、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、氯化钠、蒸馏水、碘液
二．实验器材
高压灭菌锅、超净工作台、干燥箱、恒温培养箱
三、实验步骤
1.培养基配制：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000ml，琼脂15g，PH7.2
2.采集25g3-10cm深层土壤
3.将土壤加入有225ml的锥形瓶中，震荡摇匀制成土壤悬液，将制备好的悬液在装有9ml 无菌水的试管中进行梯度稀释
4.从第6、7、8梯度浓度中分别吸取100微升悬液涂布于培养基，在27摄氏度培养1-2天
5.在长出菌落的培养基中加入碘液，无色证明有淀粉酶产生，选取透明圈较大的菌株用接种环挑起，采用平板划线分离法接种到新平板上。
实训7紫外线诱变选育-淀粉酶高产菌株
三、实验材料
3. 培养基和试剂 ① 无菌水、75%酒精 ② 0.5％碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL，先将 碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中， 待碘片全部溶解后，加足水即可。 ③ 选择培养基 可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，NaCl 0.5g， 琼脂2g，蒸馏水100mL，pH6.8～7.0，121℃灭菌20 min。 ④ 肉汤培养基 牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g， 蒸馏水100mL ，pH7.2～7.4，121℃灭菌20 min。
菌种菌种产淀粉酶枯草芽孢杆菌产淀粉酶枯草芽孢杆菌器材器材装有装有15w15w或或30w30w紫外灯的超净工作紫外灯的超净工作台电磁力搅拌器含转子低速离心机台电磁力搅拌器含转子低速离心机培养皿涂布器培养皿涂布器10ml10ml离心管离心管115510ml10ml吸管吸管250ml250ml三角瓶恒温摇床培养三角瓶恒温摇床培养箱直尺棉签橡皮手套洗耳球箱直尺棉签橡皮手套洗耳球培养基和试剂培养基和试剂无菌水无菌水7575酒精酒精0505碘液碘片碘片1g1g碘化钾碘化钾2g2g蒸馏水蒸馏水200ml200ml先将先将碘化钾溶解在少量水中再将碘片溶解在碘化钾溶液中碘化钾溶解在少量水中再将碘片溶解在碘化钾溶液中待碘片全部溶解后加足水即可
同时也会影响菌体的成活率。臭氧在空气中的
含量不能超过0.1％-1％。
六、结果与讨论
1.利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?
2.为什么诱变育种后要挑选C/H值最 大者接 入斜面保藏?
四、实验步骤
1.菌体培养 取枯草芽孢杆菌一环接种于 盛有20mL肉汤培养基的250mL三角瓶中，于 37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。
2.菌悬液的制备 取5mL发酵液于10mL离心 管中，以3000 r/min离心10min，弃去上清 液。加入无菌水9mL，振荡洗涤，离心 10min，弃去上清液。加入无菌水9mL，振 荡均匀。
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一、实验目的
通过对出发菌株进行不同剂量条件下的照 射，找出最佳诱变剂量。 不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变 剂的敏感程度不同。诱变处理前，应预先 作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线， 选择合适的处理剂量。
二、实验原理
DNA是遗传物质的基础，在260 nm下有最大能量 吸收峰。 15 W紫外灯在30 cm处的紫外线波长多数为260 nm左右，菌体处在该波长条件下会吸收大量能量 造成DNA分子断裂，分子结构形式发生改变。 有些微生物由于DNA分子大面积损伤而死亡，有 些因为菌体进行修复而存活。在修复过程中有些 菌体虽然存活，但DNA碱基发生了改变，从而形 成了突变菌株。 通过选择的手段选择出实验要求的突变菌株，从 而使野生理是什么？
2. 为什么要在黑暗或在红色光下进行诱变和培养 工作？
实验应完成：
每2组共涂平皿12个，其中：
未照射的3个不同浓度梯度平皿，共3个 紫外照射的3个不同时间点每个的3个不同浓度梯 度平皿，共9个 未使用菌液于冰箱上层中继续保存。
三、实验步骤
5. 30 ℃恒温倒臵培养48 h（培养物用黑色塑料袋 或报纸包裹严实进行培养）。
6. 计数并计算致死率
四、实验结果
1. 致死率＝（对照－存活）/ 对照
四、实验结果
2. 绘制辐射时间和致死率之间的关系图，确定该 诱变的最适诱变剂量。
诱变剂量选择根据出发菌株的诱变史。一般来讲， 出发菌株为野生型，第一进行诱变采用大剂量 （致死率较高的剂量），对于诱变史较为复杂的 菌株一般选用小剂量进行诱变。
三、实验步骤
1. 筛选培养基的配制（含琼脂，已完成） 2. 倒平板（每2组倒12个，每个平板10mL左右）
注意：1、2组 / 3、4组 / 5-6组: 取样环境相同的小 组选择1瓶菌液进行实验
3. 出发菌株的制备（无菌条件下操作） 在超净工作台中将摇瓶中菌液转移至离心管中， 1500rpm离心10min，弃上清，向沉淀中加入25 mL生理盐水重新分散，摇床中反复振荡20 min。
三、实验步骤
3. 诱变条件选择（操作过程在红光或黑暗条件下进 行） 取5 mL菌液至空的无菌平皿中，打开平皿盖，再 打开紫外灯，迅速记时，照射一定时间（10 S、 20 S、30 S）后立刻关闭紫外灯。 4. 涂平皿 对照（涂3皿）：取未进行辐射的菌悬液0.1ml， 梯度稀释适当倍数（105、106、107）后各涂平皿1 个。 处理组（涂9皿）：取辐射后的菌悬液0.1ml，梯 度稀释适当倍数（103、104、105）后各涂平皿1个。