DNA_ladder_protocol细胞凋亡操作步骤
细胞凋亡实验详细步骤及说明
细胞凋亡实验详细步骤及说明
细胞凋亡是细胞在正常发育或应激条件下程序性死亡的过程。
为了深入了解细胞凋亡的机制和影响因素，以下是细胞凋亡实验的详细步骤及说明：
步骤一：培养细胞
1. 准备培养皿并涂覆培养基，确保培养基的成分适合所使用的细胞类型。
2. 从培养细胞的主要来源（如细胞培养库）中获取细胞。
3. 将细胞转移到培养皿中并在适当的温度和湿度下孵育。
步骤二：处理实验组
1. 将培养的细胞分为实验组和对照组。
实验组是要进行细胞凋亡诱导的组，而对照组则用于对比分析。
2. 选择适当的方法诱导细胞凋亡，例如化学诱导剂（如某种药物）或物理刺激（如辐射）。
3. 根据实验需要，在指定的时间间隔内观察细胞凋亡的现象和变化。
步骤三：检测细胞凋亡
1. 使用合适的细胞凋亡检测方法，如细胞染色和流式细胞术。
这些方法可用于分析各种细胞凋亡标志物的表达。
2. 准备相应的染色试剂或抗体，并按照说明溶解或稀释。
3. 按照实验需求，将细胞标本与染色试剂或抗体共孵育，并进行相应的分析和读数。
步骤四：数据分析与结果
1. 对实验和对照组的数据进行统计学分析，如均值和标准差计算。
2. 进一步分析和解释实验结果，评估细胞凋亡发生的程度和影响因素。
3. 根据实验结果撰写实验报告，包括方法、结果和结论，并进行讨论和对比分析。
以上是细胞凋亡实验的详细步骤及说明。
通过进行这些实验，
我们可以更好地理解细胞凋亡的机制以及可能对其产生影响的因素。
请根据具体实验的要求和细胞类型的特点，调整实验步骤和方法，
并确保实验过程中的安全性和可重复性。
凋亡DNA Ladder快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书
凋亡DNA Ladder快速提取试剂盒目录号：DN16目录编号包装单位DN1601 20次DN1602 50次适用范围：适用于快速提取凋亡DNA Ladder试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存20次50次裂解/结合液CB 室温 6 ml 15 ml漂洗液WB 室温6 ml 15 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液EB 室温15ml 15 ml吸附柱AC 室温20个50个收集管（2ml）室温20个50个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:1.裂解/结合液CB低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：细胞发生凋亡时，染色质DNA在核小体之间发生断裂，最终形成200bp整数倍的DNA片段，这些DNA片段被提取后，经电泳及溴化乙锭染色后形成梯子状外观，谓之DNA Ladder。
血液和组织培养细胞在裂解/结合液中裂解后，释放出来的DNA片段在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将DNA Ladder 片段从硅基质膜上洗脱。
产品特点：1.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
2.本公司独有的裂解/结合液配方有效裂解细胞，使用本试剂盒不需要加入昂贵的蛋白酶K处理，大大降低了使用成本和加快了处理速度。
3.节省时间，简捷，单个样品操作一般可在10分钟内完成。
注意事项1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
3.裂解/结合液CB含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。
(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项
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常见细胞凋亡检测的方法与注意事项大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式，大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来，细胞凋亡检测的方法不少，这里就总结下几种常用的检测方法.细胞凋亡检测更多详情，点击查看不可不知的细胞检测方法——MTT一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜（1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落.(2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。
三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
简述细胞凋亡的检测方法
简述细胞凋亡的检测方法
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细胞凋亡检测方法简述如下：
①形态学检测：利用光学显微镜、荧光显微镜乃至透射电子显微镜观察细胞形态变化，如细胞收缩、核染色质浓缩等。
②Annexin V标记：利用Annexin V与磷脂酰丝氨酸特异性结合的特性，荧光标记的Annexin V可检测早期凋亡细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸，结合PI可区分早晚期凋亡与坏死细胞。
③TUNEL染色法：检测细胞DNA断裂情况，通过标记末端脱氧核苷酸转移酶介导的DNA缺口，荧光显微镜下观察凋亡细胞的DNA片段化。
④Hoechst染色：使用荧光染料如Hoechst 33342染色细胞核，观察凋亡细胞核形态的改变，如浓缩、碎裂。
⑤DNA Ladder电泳：提取细胞DNA进行凝胶电泳，凋亡细胞DNA呈现特征性的梯状条带，反映DNA在核小体间的特定位置断裂。
DNALADDER的检测
DNALADDER的检测细胞凋亡的检测方法——DNA ladder的检测细胞凋亡是指由于细胞内部程序激活而发生的自杀性死亡，是增殖的淋巴细胞被清除的主要方式，是由生理或病理信号引发的自主性的细胞清除过程。
生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下，其死亡途径被激活，并在有关基因的调控下发生的程序性死亡，为程序性死亡过程的一种主要形式，强调的是形态学上的改变。
它涉及染色质凝聚和外周化、细胞质减少、核片段化、细胞质致密化、与周围细胞联系中断、内质网与细胞膜融合，最终细胞片段化形成许多细胞凋亡小体，被其他细胞吞入。
通过死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程, 是细胞生理性死亡的普遍形式。
凋亡过程中DNA发生片段化，细胞皱缩分解成凋亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，不发生炎症。
根据细胞凋亡过程中细胞发生的各种变化，从而有了针对各种症状的检测方法和手段。
如针对形态学上的变化，从而产生的形态学的检测方法。
运用光学显微镜，倒置显微镜，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，透射电子显微镜观察细胞形态的变化。
由于细胞凋亡过程中出现的一些特异性的分子结构变化，也产生出了针对这些变化的检测方式。
如细胞凋亡过程中，细胞膜的磷脂酰丝氨酸会从膜内层翻出，因此，通过检测细胞表面的磷脂酰丝氨酸残基，也能反应出细胞正在凋亡或者已经凋亡。
其他的方法，如线粒体膜势能的检测，以及caspase酶活性的检测，等等这些方法都是基于细胞凋亡过程中的信号转导机制所产生的应对特定的信号分子的检测方法。
我觉得以上所述的这些方法都各自有其优缺点。
有时，仅仅运用一种方法也不能肯定的判断细胞是否发生凋亡。
这种情况下，大多需要用运用其他方法进一步来验证作为补充，以得到肯定的结果。
在众多检测细胞凋亡的方法中，我个人比较倾向于生化方法，也就是DNA 分子片段的检测。
细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。
细胞凋亡的六种检查方法
细胞凋亡的六种检查方法一、引言细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在生物体的正常发育和疾病的发生中都起到了重要作用。
因此，对于细胞凋亡的检测方法也成为了科学家们关注的焦点之一。
本文将介绍六种常见的细胞凋亡检测方法。
二、TUNEL法TUNEL法是一种常见的检测DNA断裂和凋亡细胞数量的方法。
它利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)标记DNA断裂末端，并通过荧光或酶标记来检测。
操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 用缓冲液进行处理，使得DNA断裂末端暴露出来；3. 加入TdT和dUTP标记物，使得dUTP与DNA断裂末端连接；4. 洗涤样品，并加入抗dUTP抗体标记物；5. 洗涤样品，并观察荧光或颜色变化。
三、Annexin V染色法Annexin V染色法可以同时检测早期和晚期凋亡细胞。
它利用细胞表面磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)的变化，通过Annexin V结合检测细胞凋亡。
操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 加入Annexin V标记物，使得其与PIP2结合；3. 加入PI染色剂，使得细胞核染色；4. 观察荧光或颜色变化。
四、Caspase活性检测法Caspase活性检测法可以检测细胞内Caspase的活性水平，从而判断凋亡的程度。
操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 加入Caspase底物和缓冲液，使得Caspase底物被水解；3. 观察荧光或颜色变化。
五、DNA Ladder分析法DNA Ladder分析法可以检测DNA的断裂情况，从而判断凋亡的程度。
操作步骤如下：1. 取出样品，并提取其中的DNA；2. 用琼脂糖凝胶电泳分离DNA，并观察条带形态。
六、电子显微镜观察法电子显微镜观察法可以直接观察细胞的形态和结构变化，从而判断凋亡的程度。
操作步骤如下：1. 取出样品，并进行适当处理；2. 用电子显微镜观察细胞形态和结构变化。
七、总结以上六种方法是常见的细胞凋亡检测方法，每种方法都有其特点和优缺点。
细胞凋亡实验详细步骤及说明
细胞凋亡实验详细步骤及说明实验概述本实验旨在研究细胞凋亡的过程和机制。
细胞凋亡是一种正常的细胞死亡方式，对于维持组织的稳态具有重要作用。
通过本实验，我们可以了解细胞凋亡的特征和调控通路，以及一些常用的检测方法。
实验材料- 培养皿- 细胞培养基- 不同处理条件下的细胞（例如药物处理、基因敲除等）- Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒- 显微镜实验步骤1. 培养细胞：将细胞按照常规方法培养至适当的细胞数目。
2. 细胞处理：根据实验设计，在细胞培养基中添加不同处理条件下所需的药物。
3. 收集细胞：根据实验设计决定收集细胞的时间点，使用适当的方法将细胞收集到离心管中。
4. 染色试剂处理：根据实验需求，使用 Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒中的染色试剂进行细胞染色，按照试剂盒说明书的操作步骤进行。
5. 检测细胞凋亡：将染色后的细胞标本放置在显微镜下观察，并使用适当的过滤器和荧光镜头进行观察。
6. 数据分析：根据观察结果，统计和分析不同处理条件下细胞凋亡的数量和特征。
实验注意事项- 操作过程中应严格遵守实验室安全规范，确保个人和实验室安全。
- 细胞培养过程中，注意细胞接种密度和培养基条件的控制，以维持细胞的正常生长状态。
- 在染色试剂处理过程中，按照试剂盒说明书的要求进行操作，避免试剂污染和误操作。
- 在显微镜观察过程中，注意调整适当的放大倍数和聚焦，以获得清晰的细胞图像。
实验结果与讨论根据实验结果可以获得不同处理条件下细胞凋亡数量和特征的数据。
结合相关文献和已有知识，可以对细胞凋亡的机制和调控通路进行深入的讨论。
实验结果可以为进一步研究细胞凋亡的相关领域提供有价值的数据基础。
以上是细胞凋亡实验的详细步骤及说明。
希望对你的研究有所帮助！。
DNA ladder实验步骤
1.105-107个细胞0.5ml 胰酶消化后，转入2.0ml离心管，加冰冷的PBS至1.5ml，1600rpm离心5min，弃上清，收集细胞。
2.细胞重悬于1ml冰冷的PBS，转入1.5ml离心管。
1600rpm离心5min，漂洗2次，离心收集。
3.加入0.5ml含100ug/ml蛋白酶K和20ug/ml RNase A的DNA提取缓冲液（蛋白酶K和RNase A用前加），混匀，50℃水浴3h或37℃过夜，期间不时旋转混匀。
裂解液配方：Tris-cl 10mMEDTA 0.1M DNA提取缓冲液1.5mlSDS 0.5%蛋白酶K母液（20mg/ml）7.5ulRNase A母液（10mg/ml） 3 ul4.冷却到室温后加等体积的（酚，氯仿，异戊醇25:24:1），缓慢颠倒混匀5-10min。
5.6600r/min离心15min，取上清。
6.用等体积的（氯仿，异戊醇24:1）抽提一次，取上清。
若蛋白多可重复抽提1-2次。
7.加入0.1倍体积的3mol/L 乙酸钠（pH 5.2）与2倍体积-20℃预冷的无水乙醇。
-20℃放置20min-1h。
8.12000r/min，室温离心20min，弃上清。
9.用1ml 70%的乙醇洗沉淀2次（12000rpm离心2-5min），室温下干燥5-15min。
（不做其它实验此步可省）。
10.溶于50 ul TE 中。
11.用1.2%的琼脂糖凝胶（0.3g琼脂糖+25ml TAE配制）检测DNA质量。
一般样品上样量5 ul + 1 ul loading buffer；Marker上样量5ul。
注意：1.枪头剪掉一截，防止移液时DNA断裂。
2.所配试剂pH要准确，酚的pH值必须接近8.0.以防离心后DNA滞留于水酚双相的交界面（主要为蛋白质）上。
3.测定DNA样品在260nm和280nm处的光吸收，A260/A280之比应大于1.75，低于此值表明制备物中存留有显著的蛋白质。
细胞凋亡实验步骤及注意事项细胞爬片制备详细过程肿瘤细胞侵袭实验
细胞凋亡实验步骤及注意事项细胞爬片制备详细过程肿瘤细胞侵袭实验细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。
凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。
它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。
细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。
在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。
在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。
在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。
核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。
如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。
相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。
细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。
一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。
三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。
研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。
DNA LADDER检测细胞凋亡的讨论
DNA LADDER检测细胞凋亡的讨论例一gongyulai：我用的是药物诱导癌细胞凋亡，做DNA Ladder（用的是北京鼎国的动物细胞凋亡梯子提取试剂盒）。
跑出来的电泳不是一条条带，而是每条很长的拖尾现象，Marker到是出来了。
我是按说明书上0。
8%的琼脂糖。
我用的是60v电压。
不知道什么原因？郁闷。
说明书上说混合温和是什么意思，我又没用力摇。
我还想问收集凋亡细胞时离心时转速多少比较好？chujun_hust：（1）“跑出来的电泳不是一条条带，而是每条很长的拖尾现象”：可能是由于你点样时，时间太长了，导致样品扩散；还有一个原因是你设置的电压太高，最好是2~4v/cm，跑4～6小时比较合适（2）“我是按说明书上0。
8%的琼脂糖”：凝胶浓度太低了，把凝胶浓度加大到2％，放心做，没问题的（3）“说明书上说混合温和”：那是怕你混匀太剧烈导致细胞基因组DNA断裂啊，注意很轻轻的混匀（4）“收集凋亡细胞时离心时转速”：我在实验室中是5000rpm，离心5min，我觉得足已mmyycc：我的ladder总是只有一条带，与对照组差别不大，用的是100v,1-1.5h,不知道是不是这个原因？溴酚兰跑到什么位置合适呢？chujun_hust：电压设置太高了啊，溴酚兰一般跑到蓝色离胶顶2cm左右吧。
附上我刚刚做的DNA LADDER图象，我用的不是试剂盒，是按照《细胞实验指南》上做的，效果不错啊具体见：/bbs/post/view?bid=66&id=495351&sty=1&tpg=1&ppg=2&age=0#518411lwk2003：请问做DNA LADDER时选择处理后细胞多长时间就可以提取细胞DNA比较合适？我看有的文献是处理细胞3天后提取DNA的，是不是时间太长了？gongyulai：我觉的根据不同情况吧。
如果我是同一浓度不同时间测和不同浓度同一时间应该不一样的。
细胞凋亡及检测方法
细胞凋亡细胞凋亡是指由基因所决定的细胞自动结束生命的过程，由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以也常常称为细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD)。
具体指细胞遇到内、外环境因子刺激时，受基因调控启动的自杀保护措施，包括一些分子机制的诱导激活和基因编程，通过这种方式去除体内非必需的细胞或即将发生特化的细胞。
例如，蛙的个体发育过程中，四肢的形成过程中尾巴消失等现象，都涉及细胞的自动死亡。
在形态学上把细胞凋亡分为三个阶段：第一个阶段是凋亡的开始，此阶段只是进行数分钟，细胞中所表现的特征是：微绒毛消失，细胞间接触消失，但是质膜保持完整性，线粒体大体完整，核糖体逐渐与内质网脱离，内质网囊腔膨胀，并与质膜发生融合，染色质固缩等等;第二阶段是形成凋亡小体，核染色质发生断裂，形成许多的片段，与一些细胞器聚集在一起，然后被细胞质膜包围，形成凋亡小体；第三阶段是凋亡小体被吞噬细胞所吞噬，而其残留物质被消化后重新使用。
细胞凋亡是一个主动性自杀过程，所以它是一个耗能的过程，需要ATP提供能量。
【细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。
细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
细胞发生凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，对于这种生物学观察，借用希腊“Apoptosis”来表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细胞凋亡。
人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点，到目前为此，人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡(apoptosis)。
细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式。
DNA-ladder-protocol细胞凋亡操作步骤
也希望大家批评指正!注:黑色字体部分为<细胞实验指南>P108~109的内容(完全一样),其中红色部分为我的改动以及一些建议,希望您能成功!三、DNA裂解分析凋亡的标准特征之一，是基因组DNA断裂为180-200bp的多条寡核小体片段。
此现象可用常规琼脂糖凝胶电泳检测，是凋亡的特征。
由于该技术只能提供细胞死亡的定性分析，一般要结合定量的方法以确定样品的凋亡程度。
另有需注意的重要之处，一些细胞类型或细胞系(如K562，10T1/2，Raji)在凋亡时不是以此种方式断裂DNA，另外在坏死细胞中也不发生这样的DNA裂解。
这不是凋亡细胞的限定性试验，但不论在何系统中，这都是确定细胞死亡有用的特性。
DNA裂解测量有几种方法，包括FACS分析和完整的标记DNA的检测。
另一种方法TUNEL，需DNA末端标记，用于单个细胞DNA裂解的测定。
凋亡常常伴随有DNA的裂解，这些技术在凋亡测量中都有意义。
(一)琼脂糖凝胶电泳1)将5×105细胞移人无菌的 Eppendorf管中，4℃ 2000 r／min离心5分钟，弃上清。
注意不要使用过多的细胞，否则随后的酶解可能不完全，形成很黏稠的DNA溶液。
储军注:①细胞接种数:我一般是将细胞按照5×105细胞/35mm平皿接种,然后培养两天(因为接种后的细胞有部分会死亡,所以培养一天的细胞可能会少,个人觉得培养两天比较合适,细胞不要太多了!!!!),然后再加药物处理,处理时间看您药物的类型和剂量,不过建议您做几个梯度,同时进行,这样可以看出剂量和时间对细胞凋亡的影响程度,我当时做的是每隔8h,测量一次,太累,建议您每隔12h或者24h测量一次②离心速度:我是4℃ 2000 r／min离心5分钟,按照我实验室离心机换算RCF(相对离心力)为367g③细胞收集:贴壁细胞需要把漂浮细胞和贴壁细胞（胰酶消化）一起收集，离心，然后用预冷的PBS再洗涤一次,注意丢弃上清液要小心,注意不要把细胞吸走了,我一般使用1ml和两个移液枪来操作的,1ml取走大部分上清夜,把剩余的小心取走!2)加入20µl溶解缓冲液[20 mmol/L EDTA，100 mmoll/L Tris，，％(w/v)SDS] 。
选择性凋亡DNALadder抽提试剂盒操作方式及步骤说明书
试剂盒组成、贮存、稳固性：注意事项：为维持活性方便运输，Enzyme B 客户收到时为冻干粉，收到后加500µl 灭菌水（25次）或1ml 灭菌水（50次）溶解后－20 ºC 保留。
Enzyme A 和Enzyme B 为酶溶液，应该幸免反复冻融降低活性，若是要分多次利用，最好依照每次利用量分装后－20 ºC 保留。
产品介绍：凋亡(apoptosis)或程序性死亡的细胞一个形态学的显著特点是染色体DNA 以核小体为单位（185 bp ）规律断裂形成长度约为n ×185bp (n=1,2,3,4…) 的DNA 片段，经琼脂糖凝胶电泳显示为阶梯状凋亡DNA Ladder ，是凋亡细胞最直观的特点。
本试剂盒选择性从组织和细胞中分离提取凋亡DNA ladder ，通过选择性分离基因组DNA 与凋亡DNA ladder ，最大限度的减少了基因组DNA 对凋亡DNA ladder 的观看干扰，因此显著的提高了检测灵敏度，反映可在微量离心管进行，小时完成，快速方便；无需有机抽提，检测灵敏度极高，可从约2000个凋亡细胞中检测到DNA ladder 。
推荐起始细胞量为5～10 × 105个，但投入的细胞量可在1 × 105~ 5 × 106之间转变。
原那么是总细胞中应含有至少约1～2 × 104个凋亡细胞。
多于2 × 104个凋亡细胞通常可取得十分清楚的凋亡DNA ladder 。
本试剂盒也可用于从组织中提取凋亡DNA ladder 。
但与培育细胞相较，整体动物组织凋亡细胞显现的时刻、部位、程度等规律性差往往造成难以准确取材，可能显著阻碍实验结果。
但只要组织确实发生凋亡，有体会的用户也能够利用本试剂盒从组织提取凋亡DNA ladder (参见说明4)。
试剂盒组成保存25次50次Extraction buffer 4 ºC 5 ml 10 ml 10% SDS 室温 500µl 1 ml Enzyme A -20 ºC 500µl 1 ml Enzyme B -20 ºC 500µl 1 ml Precipitant4 ºCml7 ml产品说明:1.溴化乙锭染色过度将降低DNA条带检测灵敏度，可用水冲洗凝胶10～30分钟。
DNA ladder法检测细胞凋亡
DNA ladder法检测细胞凋亡发生细胞凋亡时，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNA ladder）。
一、材料与试剂凋亡细胞；蛋白酶K（500μg/ml）8mol/L醋酸钾白细胞裂解液：pH8.0，10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1%SDS。
氯仿无水乙醇，70%乙醇；2%琼脂糖凝胶。
二、操作步骤1.收集凋亡细胞：取1～2×106个细胞，离心后，立即用70%酒精（-20℃）固定2h；2.洗涤：取出酒精固定的细胞，1000r/min离心5min，去掉上清液，PBS洗二次；3.裂解细胞：加400μl细胞裂解液，充分混匀再加蛋白酶K100μl，置65℃水浴消化2小时或过夜；4.蛋白处理：加75μl8mol/L的醋酸钾，4℃15min，再加750μl氯仿，充分混匀后，10000r/min离心10分钟后，将上清移至一新的Eppendorf管中；5.沉淀DNA：加入750μl无水乙醇，上下轻柔颠倒混合，即可见乳白色沉淀，若不明显时可置-20℃过夜，12000r/min离心10分钟，去上清；6.洗涤DNA：加1ml70%乙醇，混匀，10000r/min离心5min，去上清；7.溶解DNA：根据DAN沉淀的大小，加一定量的蒸馏水或TE，37℃溶解；8.测定DNA浓度；9.2%琼脂糖凝胶电泳80V2小时；三、结果判断出现梯状电泳条带，最小的条带为180～200bp，其他的条带为其整倍数大小。
坏死细胞则出现弥散的电泳条带，无清晰可见的条带。
正常细胞DNA基因条带因分子量大，迁移距离短，故停留在加样孔附近。
细胞凋亡实验步骤及注意事项 细胞爬片制备详细过程 肿瘤细胞侵袭实验
细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。
凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。
它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。
细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。
在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。
在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。
在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。
核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。
如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。
相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。
细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。
一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。
三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。
研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。
本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源：易生物实验浏览次数：197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
关键词：细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×）60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。
DNA_ladder实验步骤
1.105-107个细胞0.5ml 胰酶消化后，转入2.0ml离心管，加冰冷的PBS至1.5ml，1600rpm离心5min，弃上清，收集细胞。
2.细胞重悬于1ml冰冷的PBS，转入1.5ml离心管。
1600rpm离心5min，漂洗2次，离心收集。
3.加入0.5ml含100ug/ml蛋白酶K和20ug/ml RNase A的DNA提取缓冲液（蛋白酶K和RNase A用前加），混匀，50℃水浴3h或37℃过夜，期间不时旋转混匀。
裂解液配方：Tris-cl 10mMEDTA 0.1M DNA提取缓冲液1.5mlSDS 0.5%蛋白酶K母液（20mg/ml）7.5ulRNase A母液（10mg/ml） 3 ul4.冷却到室温后加等体积的（酚，氯仿，异戊醇25:24:1），缓慢颠倒混匀5-10min。
5.6600r/min离心15min，取上清。
6.用等体积的（氯仿，异戊醇24:1）抽提一次，取上清。
若蛋白多可重复抽提1-2次。
7.加入0.1倍体积的3mol/L 乙酸钠（pH 5.2）与2倍体积-20℃预冷的无水乙醇。
-20℃放置20min-1h。
8.12000r/min，室温离心20min，弃上清。
9.用1ml 70%的乙醇洗沉淀2次（12000rpm离心2-5min），室温下干燥5-15min。
（不做其它实验此步可省）。
10.溶于50 ul TE 中。
11.用1.2%的琼脂糖凝胶（0.3g琼脂糖+25ml TAE配制）检测DNA质量。
一般样品上样量5 ul + 1 ul loading buffer；Marker上样量5ul。
注意：1.枪头剪掉一截，防止移液时DNA断裂。
2.所配试剂pH要准确，酚的pH值必须接近8.0.以防离心后DNA滞留于水酚双相的交界面（主要为蛋白质）上。
3.测定DNA样品在260nm和280nm处的光吸收，A260/A280之比应大于1.75，低于此值表明制备物中存留有显著的蛋白质。
选择性凋亡DNALadder抽提试剂盒操作方法及步骤说明书
试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存25次50次Extraction buffer 4 ºC 5 ml 10 ml10% SDS 室温500µl 1 mlEnzyme A -20 ºC 500µl 1 mlEnzyme B -20 ºC 500µl 1 mlPrecipitant 4 ºC 3.5 ml 7 ml注意事项：为保持活性方便运输，Enzyme B客户收到时为冻干粉，收到后加500µl灭菌水（25次）或者1ml灭菌水（50次）溶解后－20 ºC保存。
Enzyme A和Enzyme B为酶溶液，应该避免反复冻融降低活性，如果要分多次使用，最好按照每次使用量分装后－20 ºC 保存。
产品介绍：凋亡(apoptosis)或程序性死亡的细胞一个形态学的显著特点是染色体DNA以核小体为单位（185 bp）规律断裂形成长度约为n×185bp (n=1,2,3,4…) 的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳显示为阶梯状凋亡DNA Ladder，是凋亡细胞最直观的特征。
本试剂盒选择性从组织和细胞中分离提取凋亡DNA ladder，通过选择性分离基因组DNA与凋亡DNA ladder，最大限度的减少了基因组DNA对凋亡DNA ladder的观察干扰，因此显著的提高了检测敏感度，反应可在微量离心管进行，2.5小时完成，快速方便；无需有机抽提，检测灵敏度极高，可从约2000个凋亡细胞中检测到DNA ladder。
推荐起始细胞量为5～10 × 105个，但投入的细胞量可在1 × 105 ~ 5 × 106之间变化。
原则是总细胞中应含有至少约1～2 × 104个凋亡细胞。
多于2 × 104个凋亡细胞通常可获得十分清晰的凋亡DNA ladder。
本试剂盒也可用于从组织中提取凋亡DNA ladder。
DNA_ladder实验步骤
1.105-107个细胞0.5ml 胰酶消化后，转入2.0ml离心管，加冰冷的PBS至1.5ml，1600rpm离心5min，弃上清，收集细胞。
2.细胞重悬于1ml冰冷的PBS，转入1.5ml离心管。
1600rpm离心5min，漂洗2次，离心收集。
3.加入0.5ml含100ug/ml蛋白酶K和20ug/ml RNase A的DNA提取缓冲液（蛋白酶K和RNase A用前加），混匀，50℃水浴3h或37℃过夜，期间不时旋转混匀。
裂解液配方：Tris-cl 10mMEDTA 0.1M DNA提取缓冲液1.5mlSDS 0.5%蛋白酶K母液（20mg/ml）7.5ulRNase A母液（10mg/ml） 3 ul4.冷却到室温后加等体积的（酚，氯仿，异戊醇25:24:1），缓慢颠倒混匀5-10min。
5.6600r/min离心15min，取上清。
6.用等体积的（氯仿，异戊醇24:1）抽提一次，取上清。
若蛋白多可重复抽提1-2次。
7.加入0.1倍体积的3mol/L 乙酸钠（pH 5.2）与2倍体积-20℃预冷的无水乙醇。
-20℃放置20min-1h。
8.12000r/min，室温离心20min，弃上清。
9.用1ml 70%的乙醇洗沉淀2次（12000rpm离心2-5min），室温下干燥5-15min。
（不做其它实验此步可省）。
10.溶于50 ul TE 中。
11.用1.2%的琼脂糖凝胶（0.3g琼脂糖+25ml TAE配制）检测DNA质量。
一般样品上样量5 ul + 1 ul loading buffer；Marker上样量5ul。
注意：1.枪头剪掉一截，防止移液时DNA断裂。
2.所配试剂pH要准确，酚的pH值必须接近8.0.以防离心后DNA滞留于水酚双相的交界面（主要为蛋白质）上。
3.测定DNA样品在260nm和280nm处的光吸收，A260/A280之比应大于1.75，低于此值表明制备物中存留有显著的蛋白质。
细胞凋亡实验原理及步骤
细胞凋亡实验原理及步骤细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
一、实验步骤：1. 凋亡细胞的制备2. 200 μl细胞悬液加入1 ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000 rpm 4 ℃离心10 分钟，弃上清。
3. 重复步骤2两次。
4. 将细胞重悬于200 μl标记缓冲液。
5. 加入10 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15 分钟或4 ℃反应30 分钟。
6. 加入300 μl标记缓冲液，立即上机（流式细胞仪）检测。
二、注意事项：1. 整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4 ℃下操作。
2. 反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变。
3. Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。
三、实验结果用荧光显微镜观察，凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环。
PS转移到细胞膜外不是调亡所特有的，也可发生在细胞坏死中。
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前言:由于实验室经费问题(我想很多实验室都有这个问题,毕竟很多时候我们没有老外足够的经费),我决定利用DNA LADDER来证明(当然还辅助其它的方法)经过药物处理的细胞发生了凋亡还是坏死,所以一直研究DNA LADDER方法,自己曾经看了文献中的很多方法,自己也尝试了一下,发现还是最经典的是最好的!在整个实验过程得到了wscoco78等战友的大力帮助和建议(下面方案中有一些是wscoco78的原话,表示感谢!),并最终成功了,回顾这一段经历,感觉对自己的科研态度和科研方法都很有启发,整理了一下资料,希望与大家共享!也希望大家能够把自己好的成功方法也贴上来,大家一起努力,相信没有做不好的实验!如果大家有什么这方面的问题,可以发信至:biochujun@,我会解答大家的问题的! 也希望大家批评指正!注:黑色字体部分为<细胞实验指南>P108~109的内容(完全一样),其中红色部分为我的改动以及一些建议,希望您能成功!三、DNA裂解分析凋亡的标准特征之一，是基因组DNA断裂为180-200bp的多条寡核小体片段。
此现象可用常规琼脂糖凝胶电泳检测，是凋亡的特征。
由于该技术只能提供细胞死亡的定性分析，一般要结合定量的方法以确定样品的凋亡程度。
另有需注意的重要之处，一些细胞类型或细胞系(如K562，10T1/2，Raji)在凋亡时不是以此种方式断裂DNA，另外在坏死细胞中也不发生这样的DNA裂解。
这不是凋亡细胞的限定性试验，但不论在何系统中，这都是确定细胞死亡有用的特性。
DNA裂解测量有几种方法，包括FACS分析和完整的标记DNA的检测。
另一种方法TUNEL，需DNA末端标记，用于单个细胞DNA裂解的测定。
凋亡常常伴随有DNA的裂解，这些技术在凋亡测量中都有意义。
(一)琼脂糖凝胶电泳1)将5×105细胞移人无菌的1.5-ml Eppendorf管中，4℃ 2000 r／min离心5分钟，弃上清。
注意不要使用过多的细胞，否则随后的酶解可能不完全，形成很黏稠的DNA溶液。
储军注:①细胞接种数:我一般是将细胞按照5×105细胞/35mm平皿接种,然后培养两天(因为接种后的细胞有部分会死亡,所以培养一天的细胞可能会少,个人觉得培养两天比较合适,细胞不要太多了!!!!),然后再加药物处理,处理时间看您药物的类型和剂量,不过建议您做几个梯度,同时进行,这样可以看出剂量和时间对细胞凋亡的影响程度,我当时做的是每隔8h,测量一次,太累,建议您每隔12h或者24h测量一次②离心速度:我是4℃ 2000 r／min离心5分钟,按照我实验室离心机换算RCF(相对离心力)为367g③细胞收集:贴壁细胞需要把漂浮细胞和贴壁细胞（胰酶消化）一起收集，离心，然后用预冷的PBS再洗涤一次,注意丢弃上清液要小心,注意不要把细胞吸走了,我一般使用1ml和0.1ml两个移液枪来操作的,1ml取走大部分上清夜,0.1ml把剩余的小心取走!2)加入20µl溶解缓冲液[20 mmol/L EDTA，100 mmoll/L Tris，pH8.0，0.8％(w/v) SDS] 。
用移液管尖混匀细胞沉淀。
小心：SDS(见附录5)不要形成强的旋涡，因为高分子量DNA可能被剪切。
储军注:①加入溶解缓冲液前:虽然上清液被丢弃,但是一般在管底还是有少量上清液,此时可以用食指轻弹管底,使得细胞沉淀尽可能融解,为加入溶解缓冲液后混匀创造条件。
②溶解缓冲液的配制:把EDTA,Tris-base,SDS放在一起搅拌混匀，使用pH计测得其pH值大概在8.0左右，根本不需要加HCL调pH值!只要你的试剂好（fluka、amresco、sigma），照这些经典方法基本上都不需要调pH值，真的很准，上下0.5而已。
③混匀细胞沉淀:有了①,这步应该可以很好做了,把枪尖浸入液面下，部分按下按钮(很重要,否则溶液里有很多气泡,导致溶解缓冲液没有充分混匀啊!)，只是形成暗流，在液面下涌动，气体不放出来自然无气泡!3)加10µl RNA酶A/T1混合液(分别为500U/ml，20000U／ml，Ambion Inc．)，轻弹管尖混匀，不要形成旋涡。
37℃孵育30-120分钟。
储军注:①混匀:方法同2)②我采用37℃孵育120min,也采用过90min,效果一样③RNA酶A/T1混合液:我只是配了500U/ml的RNA酶A,不需要T1,效果也是很好!,而且我的RNA酶也没有进行煮沸处理,不过最好是处理一下了!④将封口膜将EP管封好,以免EP管中的液体蒸发4)加10µl蛋白酶K(20mg/ml，Ambion)，轻弹管尖混匀，50℃孵育至少90min，也可过夜。
储军注:①在加蛋白酶K之前,轻轻将EP甩几下,使得贴在管壁和管盖上的水滴流至管底②我采用55℃水浴,时间曾用过3h,4h,6h,过夜,效果差不多,根据您自己的个人时间决定,比如你现在需要陪MM看碟了,就让它过夜吧,没关系的了!③加入蛋白酶K后，溶液立即出现絮状白色物，蛋白酶K是冷的缘故，加到37℃的裂解液自然会出现絮状物，再涌动涌动（同2））,然后再放入55℃一段时间就消失了，不是什么怪现象④将封口膜将EP管封好,以免EP管中的液体蒸发⑤做完后,轻轻将EP甩几下,使得贴在管壁和管盖上的水滴流至管底,这时可以进行电泳或在-20℃保存以后跑电泳5)加5µl 6×DNA加样缓冲液(30％甘油，0．25％溴酚蓝)，在含0.5µg/ml溴化乙锭TAE的1％-1.5％琼脂糖凝胶干孔中加DNA样品。
小心：甘油；溴酚蓝；溴化乙锭(见附录5)为了避免由于某些制备液黏稠而致DNA样品损失，推荐加样应在干孔中(电泳池中加入缓冲液之前)。
参考加样量为100bp大小。
储军注:①胶浓度:1%/1.5%的我都用过,但是发现效果不好,建议使用2%,我就是用的2%②电泳相关参数:最好选择2～4V/cm电压，用大的电泳槽（10cm以上）,我使用23cm电泳槽,电压为45V,跑6h30min③加样缓冲液:我一般每孔加20µl样品+4µl 10×loading buffer(加液缓冲液用量加倍了,主要是为了使样品中的DNA样品能否充分沉积在孔中)6)低电压电泳，可以促进DNA片段的分离(如35 V，4小时，或至染料泳动到2/3处)。
储军注:①当胶放入电泳槽后,小心加TAE,以免孔中的样品流到外面②跑电泳过程,注意不要跑歪了,不时调整一下电泳槽的水平7)DNA序列梯最后有紫外光显示，摄影。
凋亡细胞形成明显的DNA梯度，而坏死细胞为不清晰的成片条带(或无DNA裂解)。
活细胞DNA在胶顶部，是一个高分子量条带。
凋亡并不都能形成梯度，这取决于所研究的细胞类型。
另外，坏死细胞在某些情况下能产生梯度。
凋亡中如发生DNA裂解，通常会失去膜整合性。
如因生存力丧失梯度形成明显迟缓，则不像是凋亡发生。
储军注:我一般泡20min EB吧,然后将它在水龙头下轻轻漂洗4~5遍,然后开始照相了,最好使用凝胶成像系统进行拍照,这样效果好,数码相机效果不是特别好注意事项·建议使用宽口移液管移取基因组DNA，以避免DNA的剪切。
宽口吸头可从商业途径获得，或将200µl吸头尖切掉而制得。
吸头应高压灭菌，避免DNA酶污染。
可以不在琼脂糖凝胶中直接加入溴化乙啶，而是电泳后用含1µlg/ml溴化乙啶的TAE缓冲液染1小时，用水脱色后进行DNA显色。
储军注:我第一次做DNA LADDER实验时,是自己做的宽口吸头,但后来发现其实没必要,直接使用已灭过菌的tip头效果一样,只要在操作过程小心就行了!实验结果如下(一)细胞凋亡结果说明: 细胞为SP2/0（鼠骨髓瘤细胞），10ug/ml顺铂（终浓度）处理，每隔8h，进行分析.凝胶两端为lamda marker，从左至右分别为空白（未用顺铂处理），处理8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h，我可是连续奋斗了三个晚上啊，好累，不过值得，结果非常不错！：）随着时间的累积,细胞凋亡程度在加大,一切都很明显!(二)细胞坏死结果说明: 细胞为SPC-A1（人源肺癌细胞），10ug/ml顺铂（终浓度）处理，每隔8h，进行分析.凝胶两端为lamda marker，从左至右分别为空白（未用顺铂处理），处理8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h，我可是连续奋斗了三个晚上啊，好累，不过值得，结果非常不错！：）.随着时间的累积,细胞坏死程度在加大,一切都很明显!说明:本来不想将结果列出的,有点怕有人将我的结果当作自己的成果,我不希望有这种情况出现,毕竟造假是不道德的!祝大家新年快乐!实验顺利!储军2004-1-9于华中科技大学【求助】DNA琼脂糖凝胶电泳方法我准备做DNA琼脂糖凝胶电泳,请教下列几个问题:1.RNA酶－A/T1混合液中A/T1是什么,它有什么作用?2.离心后DNA是存在上清液中还是在沉淀中?3.将上清液在等体积的苯酚1氯仿（1:1）、苯酚1氯仿1异丙醇（25:24:1）和氯仿中各提取1次.这一步的作用是什么?4.在上清液中加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积的冷无水乙醇，－20℃静置过夜.这一步作用又是什么?另:如有全面的操作过程请公布一下!非常感谢!2.2.1.1 细菌中质粒DNA的制备碱裂解法小量制备质粒DNA1) 挑取培养基上的白色单菌落，接种于5ml含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；2) 取1.5ml菌液于小离心管中，13000rpm离心1-2min，富集菌体，重复一次；3) 菌体沉淀重悬于300ul溶液I中，振荡混匀；4) 加入新鲜配置的300ul溶液II,上下颠倒混匀，冰上放置10min；5) 加入300ul溶液III，轻轻旋转混匀，冰上放置5分钟；6）室温13000rpm离心15min；7) 取上清，加入等体积的Tris-中性酚,混匀后13000rpm离心10min；8) 取上清，再用等体积氯仿抽提一次；9) 取上清,加入2倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀至少5min,-20℃放置30min；10）13000rpm离心15min；11）弃上清, 抽干后溶于适量双蒸水中。
质粒提取所需的溶液：溶液I：50mmol/L Tris-Hcl (pH7.5)；10mmol/L EDTA(pH 7.5)；125ug/ml RNase A;溶液II：0.2mol/L NaOH; 1% SDS；溶液III：1.32mol/L KAC＂苯酚1氯仿（1:1）、苯酚1氯仿1异丙醇（25:24:1）和氯仿中各提取1次＂使蛋白质变性和抽提蛋白的作用．＂在上清液中加入1/10体积3mol/L醋酸钠＂使碱裂解变性质粒ＤＮＡ复性，而基因组ＤＮＡ由于过大而不能及时复性而和蛋白一起缠绕沉淀．＂２倍体积的冷无水乙醇，－20℃静置过夜＂是充分洗除残留的苯酚／氯仿和使质粒ＤＮＡ沉淀的作用．至于＂RNA酶－A/T1混合液中A/T1是什么,它有什么作用?＂中的A/T1我没有听说过，也不知道是什么东西．基本同意楼上的观点稍作补充：1.RNA酶－A/T1混合液应该是含有胰RNA酶（RNA酶A)的Tris溶液，胰RNA酶用于除去RNA的污染。