黑曲霉产果胶酶的分离提取及活力测定

二实验材料与试剂： 菌株：黑曲霉 试剂及材料：果胶， D-半乳糖醛酸，3· 5-二 硝基水杨酸，葡萄糖，乙酸-乙酸钠缓冲液， 无水亚硫酸钠，酒石酸钾（C4H4KNaO6·4H20）， NaOH,苯酚; 仪器：分光光度计，PH计，恒温培养箱，超 低温冰箱，光学显微镜，冻干机，血球计数 板，水浴恒温振荡器，电子天平，透析袋， 滤纸； 培养基：1斜面培养基：马铃薯培养基和查氏 培养基。2基础发酵培养基：麸皮15g，
③果胶底物（5g /L）：称取0.5g果胶，用 ph=4.8的缓冲液溶解，充分搅拌后用缓冲液 定容至100ml，置于冰箱冷藏（2~5℃）。 ④D-半乳糖醛酸（1mg/ml）：精确称量 1.000gD-半乳糖醛酸，用缓冲液定容1000ml。 4粗酶液的制备：发酵结束后，在三角瓶中 加入培养基总量5倍体积的生理盐水，置于 40℃水浴中，120r/min浸提1h，一层滤纸过 滤得粗酶液。
(NH4)2SO4 0.3g,水15ml，三角瓶分装，0.1Mpa 灭菌25min。 三实验步骤： 1果皮粉的制备 ： 将果皮粉60℃烘干，用粉 碎机粉碎后经100目筛得到的粉末即为试验所 用的果皮粉（促进黑曲霉产酶）。 2孢子悬液的制备：取新鲜的活化的PDA(马铃 薯葡萄糖琼脂）斜面，加10ml生理盐水，洗 下孢子至装有玻璃珠的三角瓶中，震荡10分 钟，用血球计数板计数，调整孢子浓度大于 1.8×107个/ml，在适宜条件下放入发酵培养 基中进行发酵培养。
*果胶底物用量选择：设置果胶底物用量分别 为0.2,0.5,0.8,1.0,1.5ml，根据酶活力的测定结 果确定最适的果胶 用量。 ②活力测定：于甲乙两支25ml试管中分别加 入一定量果胶底物（已确定的果胶用量）， 在48℃水浴中预热5min；于甲乙管中分别加 入4mlph=4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，甲管中加 入1ml稀释酶液，立即摇匀，在48℃水浴中准 确反应30min，在向乙管中加1ml稀释酶液，
*波长的选择：1号管为标准空白样，任选其 他一支（如6号）在450~550nm处每隔10nm 测溶液吸光值，再以蒸馏水为空白样，在 450~550nm的范围内每隔10nm测定1号试管 吸光值。选取最适 波长，在此波长下以1号 为对照，测定其他试管OD值，利用回归分析 求得标线方程和相关系数。 *DNS试剂用量的选择：如表1，其他试剂用 量不变，将DNS试剂设三种处理即1.5,2.5,5.0， 然后在最适波长下测定OD值，通过回归方程 求得标线方程及相关系数。根据相关系数确 定DNS最适用量。
果胶酶的应用：
一果汁果酒澄清； 二蔬菜汁的过滤； 三水果和蔬菜的浸解，液化，生产单细 胞果汁和菜汁； 四果实脱皮； 五木材防腐； 六麻类脱胶； 七棉织物精炼加工。
一实验原理（DNS法）：
该 方法 是利 用 果胶 酶 在一定 温度 、时 间 等条 件 下水 解 果 胶 ， 释 放 出还 原 性 D半 乳 糖 醛 酸 ，与3，5- 二 硝 基 水 杨 酸 共 热 产 生 棕 红 色的 氨 基 化 合 物 ， 即 发 生 显 色 反 应 。在 一 定 范 围 内 ， 水 解 生 成 D-半 乳 糖 醛 酸 的 量 与 吸 光 度 成 正 比 ， 与果 胶 酶 活 力 成 正 比 ， 通 过分光 光度计测定吸光度，可以计算出果胶 酶 的 活 力 。该 方 法 ( 又 称 分 光 光 度 计 法)。
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5酶液稀释：将获得的粗酶液用缓冲液稀释10 倍，100倍，1000倍，作为待测样品。 6酶活力测定： ①标准曲线的绘制 ： 准确配置1mg/ml D-半 乳糖醛酸溶液为标准样，取十只25ml刻度试 管并编号，按表一在各管中加样。
表一标准样的配置：
管号 标准样（ml） 蒸馏水（ml） DNS试剂（ml） 0 0 4 2.5 1 0.2 3.8 2.5 2 0.4 3.6 2.5 3 0.6 3.4 2.5 4 5 0.8 1 3.2 3 2.5 2.5 6 1.2 2.8 2.5 7 8 9 1.4 1.6 1.8 2.6 2.4 2.2 2.5 2.5 2.5
3试剂配制: ①乙酸-乙酸钠冲液（ph=4.8）。首先制备 0.2mol/L的乙酸aq和0.2mol/L的乙酸钠aq，后 将0.2mol/L的乙酸aq410ml与0.2mol/L的乙酸 钠aq590ml混合均匀，用酸度计测定。 ②DNS试剂(3g/L）：称取3.00g 3· 5-二硝基水 杨酸溶解于500ml蒸馏水中。逐步加入 10.4gNaOH，91gC4H4KNaO6.4H2O,2.5g苯酚 和2.5g无水亚硫酸钠温水浴（不超过48℃） 中不断搅拌，直至溶液澄清透明。冷却后用 蒸馏水定容至1000ml，保存于棕色试剂瓶中。
黑曲霉产果胶酶的分 离提取及活力测定
果胶酶，分解果胶的一个多酶复合物，
通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、 果胶酸酶。通过它们的联合作用使果胶 质得以完全分解。天然的果胶质在原果 胶酶作用下，转化成水可溶性的果胶； 果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基 团，生成果胶酸；果胶酸经果胶酸水解 酶类和果胶酸裂合酶类最终降解生成半 乳糖醛酸。
用测得的OD甲-OD乙值在标准曲线上查得 相应的D-半乳糖醛酸的量，代入下列公 式计算果胶酶活力。
7计算：果胶酶活力（U）=Y· 2/t； N· 其中OD甲：酶样吸光值 ; OD乙：空白样 吸光值 ;Y：酶作用生成的D-半乳糖醛酸 （mg）; N-样品稀释倍数；2-测定没活 力时取了反应液的½ ;t-反应所用时间 （h）。
四注意事项：
* 3· 5-二硝基水杨酸有毒性，实验时需戴 口罩及手套。 *实验结束后需把装过菌种的仪器高压灭 菌。 *DNS试剂见光易分解，实验操作时应尽 快进行。 *
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并立即放入沸水浴中煮5min，终止反应 并冷却；分别取甲乙管的反应液2ml于 两支试管中，在分别给甲乙两管加2ml 蒸馏水，加一定体积的DNS试剂（已确 定的最适用量），混合，沸水浴5min， 取出，立即冷却。加蒸馏水定容至25ml： 以标准空白为基准调零，在最适波长下 测得OD值.由于稀释酶液为三个梯度， 可分成三组进行测量，最终选取最适浓 度进行酶活计算。