猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建论

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猪O型口蹄疫疫苗免疫效果试验报告

１材料与方法
１１试验时间与试验动物．
型口蹄疫抗体间接正向血凝试验试剂盒说明书进行
记录。结果判定：根据农业部下达的标准，检测猪口蹄疫免疫抗体滴度 ≥５为合格，５为不合格，＜并经过重复检验，确定抗体滴度。
１５试验猪分组与试验方法．
３３０）６００
文章编￣：０２１５（０２０ — １３０－１０ — ９７２１）３０１ — ２
摘要：随机选择规模猪场４２日龄左右的仔猪３０头和散养户的８６日龄散养猪６头，分别进行两次０型口蹄疫灭活疫苗免疫，间接正向血凝检测口蹄疫免疫抗体。结果显示，用规模猪场的仔猪免疫抗体检测，首免后２均滴度超过５３均为合格；８ｄ平－，二免后２均滴度超过８１均为合８ｄ平．，格。散养猪只免疫抗体检测，首免后２８ｄ平均滴度３２为不合格；．，５二免后２８ｄ平均滴度９１，．为７合格。试验表明，０型口蹄疫灭活疫苗经过两次免疫可获得满意效果。猪关键词：０型１蹄疫疫苗；：３免疫；抗体
１．采血次数与时间６
１．规模猪场首免当天（．１６指未注射疫苗前当天）首免后第２天、８，免后第２，１２天二８天，前腔经静脉或耳静脉采血１，次分离血清，于抗体检测。用下简称中牧０型口蹄疫灭活疫苗），批号０００４９２０，
２１０２第３期
养猪ＳＮＲＵＴＯＷＩＥＰＯＤＣＩＮ

猪口蹄疫O型合成肽疫苗课件

疫苗的免疫机制
抗原识别
疫苗中的合成肽被免疫系统识别为外来抗原。
免疫应答
免疫系统针对这些抗原产生特异性抗体和记忆细胞，当再次接触相同抗原时，迅速并有效地产生免疫应答。
免疫记忆
记忆细胞能够在体内长期存活，当再次接触相同病原体时，能更快地启动免疫反应，提高免疫力。
02
CATALOGUE
疫苗的制造与生产
对生产过程中产生的废弃物进行无害化处理，防止对环境和
人类造成危害。
03
CATALOGUE
疫苗的接种与使用
疫苗的接种对象
健康猪
为了预防口蹄疫，健康猪是疫苗接种的主要对象。
易感猪
对于容易感染口蹄疫的猪，如幼猪和老年猪，应优先接种疫苗。
受威胁猪
处于口蹄疫高发区的猪或与患病猪接触过的猪也应接种疫苗。
猪群健康。
提高生产效益
接种疫苗能够预防疾病，减少治疗成本，提高养殖生产效益。
04
CATALOGUE
疫苗的安全性与有效性
疫苗的安全性评价
临床试验
在疫苗上市前，需进行大量临床试验，评估疫苗的安全性，确保无严重不良反应。
免疫原性
评价疫苗的免疫原性，即疫苗引发机体产生免疫应答的能力，确保疫苗能够刺激机体产生足够的免疫力。
预防和控制猪口蹄疫
猪口蹄疫是一种高度传染性疾病，对养猪业造成巨大损失。猪口蹄疫O型合成肽疫苗可以有效预防和控制该病的发生和传播。
提高猪群健康水平
通过接种疫苗，可以提高猪群的免疫力，减少其他疾病的感染风险，从而整体提高猪群的健康水平。
降低治疗成本
预防疾病的发生可以减少猪只治疗费用，降低养殖成本，提高经济效益。
疫苗的质量控制

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达载体构建

面。在已发现的Ｏ型５个抗原位点中，３个位于有
１４引物设计合成．
参照基因库已发表的Ｏ型ＦＶ基因序列，ＭＤ在
Ｖ１其中第１０Ｐ上，４位～第１０６位氨基酸处的Ｈ
环是最主要的保护性抗原位点【，间构象比较复保守区域设计１对目的片段包含Ｖ１因在内的 ‘空］Ｐ基
１材料与方法
１１细胞和病毒－
ＢＨＫ－１仓鼠肾细胞）军事医学科学院惠赠；２（，
制约经济发展。口蹄疫发病特征为口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱，是动物中传染性最强的疾病。
被世界动物卫生组织（Ｉ）ＯＥ列为Ａ类疾病，国际生
（．１首都师范大学生命科学学院，北京１０３Ｉ．００７２北京市农林科学院畜牧兽医研究所・北京１０８）００９
中圈分类号：８２６９６￥５．５．
文■标识码：Ａ
文章一号：０７５３（０６０—０００１０—０８２０）８０７＿３
ＦＶＯＫ型病毒株基因，Ｏ型口蹄疫流行毒ＭＤＩ为
株细胞培养毒基因，由上海市农业科学院惠赠。
．物武器公约会议也将它列为生物武器名录，是众所１２质粒和工程茼ｐＳＴ载体试剂盒和Ｔｐ０受态细胞为北Ｂ－ｏ１感周知的“ 经济政治病 ¨ 。该病历来被世界各国和地
它也是最重要的摘要：Ｔｉｌ取Ｏ型口蹄疫病毒免疫中发挥着重要的作用。同时，用ｒｏ提ｚ副，多年来在ＦＭ— ＲＡ，Ｎ根据已经公布的Ｏ型口蹄疫病毒核苷抗原位点及抗原变异的关键［因此，Ｖ分子流行病学调查、疫源的追踪、毒株分型、基酸序列，设计合成１对ＶＰ１基因的引物，通过Ｄ

猪口蹄疫O型合成肽疫苗及其主要特点

ｎａｔｉｏｎ，ａｎｄＳＯｏｎ．Ｆｏｏｔ — ａｎｄ — ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ，ｔｈｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｅｐｉｔｏｐｅｏｆｔｙｐｅ０ｆｏｏｔ — ａｎｄ — ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ，ａｎｄｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｓｔａｔｕｓｏｆｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｖａｃｃｉｎｅｏｆｔｙｐｅ０ｆｏｏｔ — ａｎｄ — ｍｏｕｔｈｄｉｓ —
Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｆｏｏｔ — ａｎｄ — ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｉＳｏｎｅｏｆｔｈｅａｎｉｍａｌｄｉｓｅａｓｅｓｗｈｉｃｈｓｅｒｉｏｕｓｌｙｅｎｄａｎ —
２０１４年第ｌ期
任巧玲：猪口蹄疫０型合成肽疫苗及其主要特点
５ｌ
猪口蹄疫Ｏ型合成肽疫苗及其主要特点
任巧玲，邢宝松，郭红霞
（河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州４５０００２）
摘
要：２蹄疫是当前严重危害我国养猪业的疾病之一，１长期以来免疫接种是我国预防该病的重要措施。近年
ｅｎｃｅｓｆｏｒｔｈｅｐｒｏｍｏｔｉｏｎａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｉｓｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．

猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联表达及活性鉴定

中图分类号：８２６￥５．５文献标识码：Ａ文章编号：０４２８２１）０— １６— ５１０ —３６（０１１０２０
ＴｎｅＥｘｒｓｉｎａｄＡｃｉｉａｙｉｏｔｅｅｔｅｏａｄｍｐｅｓｎｔｔＡｎｌｓｆＡｉｎＰｐｉｆｏｖｙｓｎｇｄ
果显示，达蛋白几乎全部以可溶形式存在。表达蛋白经Ｎｉ表 —ＮＴ树脂亲和纯化，ＤＡＳＳ—ＰＥＡＧ
显示纯化的目的蛋白在２Ｄ处有单一目的条带，有较高的纯度。ＥＳ检测结果显示，化７ｋ具ＩＡＩ纯
ｐｐｉｅｖｃｉｅｔ — ｏｙｇｎｓｓｎｈｓｚｄｕｉｇＥ．ｏｉｐｉｌｏｏｓａｃｒｉｐｅｅｗａｙｔｅｉｅｓｎｃｌｏｔｍａｄｎｃｏｄｎｏｔｅａ — ｃｎｃｄｓｑｅｃｆａｔｇｎｐｐｉｅＴｈｅｏｂｎｎｘｒｓｉｎｖｃｏＥＴ３ａＰ２ｗａｏｓｒｃｏａｉｅｕｎｅｏｎｉｅｅｔｄ．ｅｒｃｍｉａｔｅｐｅｓｏｅｔｒｐ２ — ｓｃｎｔｕ — ｔｄｂｌｎｎｗｏｃｐｅｅｏｎｉｅｅｔｅｉｔｈｒｋｒｏｉｅｐｅｓｏｌｓｄｐｅｙｃｏｉｇｔ — ｏｙｇｎｆａｔｇｎｐｐｉｎｏｔｅｐｏａｙｔｃｘｒｓｉｎｐａｍｉＥＴ３ａｄ２．

猪口蹄疫O型合成肽疫苗及其主要特点

猪口蹄疫O型合成肽疫苗及其主要特点任巧玲;邢宝松;郭红霞【摘要】At present, foot-and-mouth disease is one of the animal diseases which seriously endan-ger Chinese pig industry,,and vaccination is an important prevention methord for this disease. New-ly developed Synthetic peptide vaccine of O-type foot-and-mouth disease in swine has aroused great attention for its high immunogenicity, good biological safety, differentiate infection from vacci-nation, and so on. Foot-and-mouth disease virus, the antigenic epitope of type O foot-and-mouth disease virus, and the research status of synthetic peptide vaccine of type O foot-and-mouth dis-ease of swine and its main characteristic are discussed in this article In order to provide refer-ences for the promotion and the application of this vaccination.%口蹄疫是当前严重危害我国养猪业的疾病之一，长期以来免疫接种是我国预防该病的重要措施。

新型猪口蹄疫O型疫苗应用效果试验

个镇的３个规模猪场进行了分组试验，现将试验结果报告如下。
１．２试验方法
１．２．１试验猪选择
１材料和方法
１．１材料
１．１．１试验猪
分别在３个养殖场随机选择２５０头４５日龄健康仔猪作为对比试
０１０１２００４。定切实有效的生猪口蹄疫免疫程序，进一步提升生猪口蹄疫科学２猪Ｏ型口蹄疫抗体液相阻断ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒。生产厂家：中防治水平，２０１１年９月～２０１２年１０月，我们使用Ｏ型灭活苗（Ｏ，ＭＡＹ９８／ＢＹ／２０１０株）和０型合成肽疫苗在扬中市油坊、西来桥二国农业科学院兰州兽医研究所。批号：２０１２０９１９０１。
・１１８・
农威特生物科技股份有限公司。批号：Ｈ１１１２６８Ｊ。ｒａｉｎ离一０２０ａｒｉｎ，吸出血清，４￣Ｃ保存。选择２０１２年２月２７日试验猪猪口蹄疫０型合成肽疫苗。生产厂家：新疆天康畜牧生物技作为疫苗抗体跟踪组群，于二免后６周、９周、１２周，ｌ￣Ｐｌ０５日龄、１３０日龄、１５０日龄分别在前腔静脉采血５ｍｌ。血样以３０００ｒ／ｍｉｎ离术股份有限公司。批号：２０１１０２８。猪口蹄疫０型合成肽疫苗。生产厂家：中牧实业股份有限公卷

猪口蹄疫O型灭活疫苗质量标准

猪口蹄疫（O型）灭活疫苗质量标准本品系用口蹄疫O型病毒（猪源毒株）接种BHK－21细胞培养，收获培养物，经二乙烯亚胺（BEI）灭活后，加矿物油佐剂混合乳化制成。

用于预防猪O型口蹄疫。

【性状】外观为乳白色或淡粉红色的乳剂。

久置后，上层有少量油析出，振摇后呈均与乳剂。

剂型为水包油包水型。

用一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不多于0.5ml。

【安全检验】1．用小动物检验用体重350～450g的豚鼠2只，各皮下注射疫苗2ml；用体重18～22g的小白鼠5只，各皮下注射疫苗0.5ml。

连续观察7日，应不出现由疫苗引起的死亡或明显的局部和全身反应。

2．用猪检验用30～40日龄仔猪（细胞中和抗体效价不高于1:8、ELISA效价不高于1:8或乳鼠中和抗体效价不高于1:4）2头，各两侧耳根后肌肉分点注射2头份疫苗，逐日观察14日。

应不出现由疫苗引起的口蹄疫症状或明显的局部和全身不良反应。

【效力检验】用体重40kg左右的健康易感架子猪（细胞中和抗体效价不高于1:8、ELISA效价不高于1:8或乳鼠中和抗体效价不高于1:4）15头，分为3组，每组5头。

将疫苗分为1头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组，每一剂量组分别于耳根后肌肉注射5头猪。

接种28日后，连同对照猪2头，每头猪耳根)。

连续观察10日。

对照猪后肌肉注射猪O型口蹄疫病毒强毒1.0ml(含103.0ID50均应至少1蹄出现水泡或溃疡。

免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。

出现。

发病猪后要及时进行隔离。

按Reed－Muench法计算。

每头份疫苗应至少含6PD50【规格】（1）20ml/瓶（2）50ml/瓶（3）100ml/瓶。

【贮藏】在2～8℃保存，有效期为12个月。

【作用与用途】用于预防猪O型口蹄疫。

注苗后15日产生免疫力。

免疫期为6个月。

【用法与用量】根据厂家推荐的用法与用量使用。

口蹄疫PCR检测技术的建立

摘要：口蹄疫是我国比较多发的一类动物疫病，口蹄疫的检测诊断是做好口蹄疫防控工作的关键。

为了更好更快地检测和诊断口蹄疫，本研究在口蹄疫血清3ABC 检测阳性的基础上尝试建立一种快速灵敏的PCR 检测技术。

通过查询基因序列、引物设计、引物合成、PCR 反应条件摸索和优化、PCR 扩增、凝胶电泳成像，最终在待测样品中成功地扩增出A 型口蹄疫病毒预期大小的条带，可以快速检测出A 型口蹄疫病毒。

O 型和Asia I 型因没有阳性病原学样品或标准毒株，未能扩增出相应的目的条带。

关键词：口蹄疫；检测技术；聚合酶链式反应（PCR ）口蹄疫PCR 检测技术的建立张红梅1，王雅媛2,3，曹文琴1，白崇生1*，权富生3*（1.榆林市畜牧兽医服务中心陕西榆林719000；2.榆林市农业宣传信息中心陕西榆林719000；3.西北农林科技大学陕西杨凌712100）doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2023.08.003收稿日期：2022-12-10作者简介：张红梅（1981.7—），女，陕西榆阳人，本科，兽医师，主要从事畜牧兽医相关工作。

*通信作者口蹄疫（foot-and-mouth disease ，FMD ）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV ）引起的一种急性、烈性、水泡性病毒传染病，主要感染牛、羊、猪等70多种偶蹄科动物，典型的临床特征主要表现为机体发热，口腔黏膜、唇部、蹄部及乳房皮肤出现烂斑或水疱性病理变化[1-3]。

FMD 被世界动物卫生组织（WOAH ）和联合国粮农组织（FAO ）列为A 类传染病的首位。

我国亦将FMD 排在动物疫病病种名录的第一位[4]。

FMD 的诊断技术从大的方面分为临床诊断和实验室诊断。

单纯的临床诊断不能作为FMD 确诊的依据[5]。

目前，检测技术方法虽然层出不穷，但是，由于FMD 血清型种类繁多和FMDV 很容易发生变异，给本病诊断带来一定困难。

猪口蹄疫的免疫与疫苗应用

口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease Virus, FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性并可快速远距离传播的动物疫病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国规定为一类动物疫病。

其主要感染偶蹄兽，患病动物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位发生水疱，破溃形成烂斑。

1 FMD-畜牧业的大敌猪、牛、羊等主要的家畜均可感染此病，并能形成大规模流行，该病的发病率几乎达100%，犊牛、仔猪以及动物发生恶性病型时，死亡率可达50%～100%。

由于该病传染性极强，对病畜和怀疑处于潜伏期间的同群动物必须紧急处理，对疫点周围的广大范围必须隔离封锁，禁止动物移动和畜产品调运流通。

由此导致该地区甚至该国家的畜产品进出口贸易停止，造成巨大的经济损失和政治影响。

2010年，日本因该病造成直接经济损失10亿美元，韩国11.41亿美元，是发达国家近10年来最严重的疫情。

我国每年因口蹄疫造成的损失平均在110亿～120亿元之间，约占畜牧业平均增加量的17%～18%。

FMDV 宿主广泛，变异性强，危害公共卫生；引起疫源争论，社会秩序混乱，进出口限制，造成不良社会影响；还是国际禁止生物武器核查对象，有一定军事危害。

2 病原口蹄疫病原是口蹄疫病毒，属小RNA 病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthavirus)，病毒粒子直径为20～25nm，呈大致的圆形或六角形，无囊膜。

FMDV 有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia 1型7个血清型，猪口蹄疫的免疫与疫苗应用张淑刚，周绪斌（新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，乌鲁木齐 830023）每个血清型又包含若干个亚型。

该病毒不仅在各型间没有交叉免疫性，同血清型的各亚型之间也仅有部分交叉免疫性[1]。

口蹄疫病毒在环境中有一定的存活能力，病毒在干燥粪便中存活14 d，泥浆中存活6个月，尿中存活39 d。

兽医公共卫生-国内口蹄疫流行毒株及疫苗研究进展

对我国形成威胁的外来口蹄疫病毒主要来自东南亚、南亚和西亚- 中东等地区。
该 3 个区域是目前全球 FMD 疫情发生最为频繁的地区，主要流行O型、 A 型和Asia1 型。
全球口蹄疫流行圈和血清型分布来源：OIE
外来流行毒株与传入路线
（何继军等，中国动物检疫，2018）
源自东南亚毒株： A 型东南亚97（A/Sea97）毒株G1 分支和G2 分支，分别于2009 年和 2013 年传入我国；O 型缅甸 98 （O/Mya-98）毒株，于 2010 年传入我国。
猪口蹄疫 O 型、A 型二价灭活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013 株 +Re-A/WH/09 株）
Re-A/WH/09 株是利用高复制力型的 3'UTR 和 3D 基因构建了制苗种毒拯救框架，同时对 A 型 Sea-97 毒株结构蛋白 P1 基因进行突变修饰，改变了影响病毒结构稳定性的关键氨基酸编码，并将其克隆至上述病毒拯救框架，制备出 Sea-97 株重组病毒 Re-A/WH/09；
缺点：亚单位苗与全病毒疫苗比免疫原性差，需经多次免疫才能获得有效保护。
2. 核酸疫苗
将病原基因克隆入真核表达载体上，经筛选后，获得正确的重组质粒，免疫动物后，外源病原基因可在动物机体表达，激活针对该病原的免疫应答反应，这类疫苗称为核酸疫苗。
王晓虎等构建了单独含 FMDV VP1、 VP4基因及同时含两种基因的的重组核酸疫苗，将3 种核酸疫苗免疫动物后，检测免疫原性，结果显示，这3 种疫苗质粒均能刺激机体产生中和抗体，且具有一定的保护效力。VP1单表达组和联合组保护率均为28.6%，共表达组和融合表达组保护率均为 42.9%，灭活疫苗组保护率为100%，空载体组保护率为0。

猪O型口蹄疫的新型合成肽疫苗和传统灭活疫苗的比较

猪O型口蹄疫的新型合成肽疫苗和传统灭活疫苗的比较作者：史素云杨志彪来源：《农业开发与装备》 2015年第4期史素云1，杨志彪2*（1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.申联生物医药（上海）有限公司，上海 200241）摘要：猪口蹄疫是由猪口蹄疫病毒引起的一种烈性传染病，传染性强，发病率高，给养猪业带来巨大的危害。

目前我国猪O型口蹄疫预防用疫苗主要为传统的灭活疫苗和新型的合成肽疫苗，本文对两种疫苗的生产工艺、免疫方式和免疫效果的比较进行综述，以期望为疫苗的合理选择与使用提供帮助。

关键词：合成肽疫苗；灭活疫苗；口蹄疫；新型疫苗；传统疫苗口蹄疫（food-and-mouth disease，FMD）俗名“口疮”、“蹄癀”，是由口蹄疫病毒引起的一种急性发热性高度接触性传染病，它能感染猪、牛、羊等偶蹄哺乳家畜，亦能感染野牛、鹿、羚羊、骆驼等野生动物，同时还能传染给人类，是一种及其重要的全球性动物传染病，危害及其严重。

世界卫生组织将其列为A类传染病，我国也将其列为一类动物疫病[1]。

目前已知的口蹄疫病毒包括A、O、C、Asia-I、SATⅠ、SATⅡ 和SATⅢ等7个没有交叉免疫保护的血清型，在长期的互相传播感染中又形成60余个亚型[2]。

猪口蹄疫以患猪的口、蹄等部位发生水泡性病变为主要特征，传播速度快，途径广，发病率几乎达到100%，死亡率只有2～3%。

猪口蹄疫的爆发流行可造成巨大的经济损失，世界各国对其防治均十分重视，目前我国对猪口蹄疫的控制和扑灭，主要措施是强制免疫。

目前我国猪O型口蹄疫免疫用疫苗主要为灭活疫苗和合成肽疫苗。

我国农业部批准的口蹄疫疫苗指定生产企业有7家，分别是金宇集团、中牧实业股份有限公司兰州生物药厂、中牧实业股份有限公司保山生物药厂、天康生物、中农威特生物科技股份有限公司、必威安泰和申联生物医药（上海）有限公司。

该7家企业均通过GMP验收，生产的两种猪口蹄疫O型疫苗均能够有效的防治猪O型口蹄疫。

O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用[发明专利]

专利名称：O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用专利类型：发明专利
发明人：郭利,杨勇,杨艳玲,孙娜,程世鹏,任静强,席娜,李家伟,刘莹,林鹏,宁浩然
申请号：CN201510213353.4
申请日：20150430
公开号：CN104873967A
公开日：
20150902
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用，属于基因工程学和免疫学领域，解决了现有灭活口蹄疫疫苗存在的安全性差、使用效果不理想的问题。

该疫苗的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

该疫苗免疫后可诱导动物同时产生抗O型口蹄疫的抗体，该疫苗是以病毒样颗粒形式存在，口蹄疫病毒VP1表位在病毒样颗粒的表面，本发明提供了构成病毒样颗粒疫苗的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列，且所述的核苷酸序列含有能够在表达中自我组装成病毒样颗粒的外壳蛋白全部基因。

本发明提供的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗制备安全性好，无病毒返强、散毒的可能性；免疫有效期长，运输储存方便。

申请人：中国农业科学院特产研究所
地址：130112 吉林省长春市净月经济开发区聚业大街4899号
国籍：CN
代理机构：长春菁华专利商标代理事务所
代理人：王丹阳
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目录摘要 (III)关键词 (III)Abstract (III)Key words (IV)英文缩略词表 (IV)1前言 (1)1.1口蹄疫的基本特征 (1)1.1.1口蹄疫病毒基本概念 (1)1.1.2口蹄疫病毒生物学特征 (1)1.1.3口蹄疫病毒危害 (1)1.2泛素蛋白及其对抗原的影响 (2)1.3 siRNA干扰机制 (3)1.4 γ干扰素与口蹄疫免疫 (4)1.5 FMD疫苗研究进展 (5)1.6本实验研究的目的与意义 (6)2实验材料 (6)2.1菌种、毒株、载体与质粒 (6)2.2主要药品与试剂 (6)2.3主要培养基及配制 (7)2.4缓冲液及其配制 (7)2.5其他溶液 (7)2.5空斑筛选与纯化相关试剂 (8)2.6寡核苷酸引物 (8)3实验方法 (8)3.1转移载体PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建策略 (8)3.1.1限制性内切酶酶切反应 (9)3.1.2酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测 (9)3.1.3酶切产物的回收 (9)3.1.4回收产物的去磷酸化反应 (9)3.1.5目的基因与载体的酶连反应 (10)3.2 感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化 (10)3.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法） (10)3.2.2质粒的转化 (10)3.2.3质粒的小量制备（OMEGA试剂盒） (10)3.2.4质粒的大量制备（OMEGA试剂盒） (11)3.2.5阳性质粒的酶切鉴定 (12)3.3以PRV为载体表达FMDV抗原蛋白基因P1，泛素蛋白与抗原P1的融合基因Ubi- P1，RNA干扰基因shRNA，干扰素基因IFN-γ的重组病毒的构建 (12)3.3.1细胞的培养、冻存与复苏 (12)3.3.2 PRV TK-/gE-/LacZ+基因组DNA的提取 (12)3.3.3脂质体介导的共转染 (13)3.3.4重组病毒空斑纯化和PCR鉴定 (13)3.3.5鉴定用PCR模板处理 (14)3.3.6重组病毒PCR鉴定 (14)4结果与分析 (15)4.1转移质粒PIECMVUbiP1的构建 (15)4.2转移质粒PIECMVUbiP1P1的构建 (15)4.3转移质粒PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建 (16)4.4共转染产物接毒第三代PCR鉴定 (17)4.5重组病毒的空斑纯化及PCR鉴定 (18)4.5.1空斑的形成 (18)4.5.2在PK-15细胞上的第一轮空斑筛选 (19)4.5.3在Vero细胞上的第一轮空斑筛选 (20)4.5.4 重组病毒的空斑筛选结果 (20)5讨论 (20)5.1 载体的构建 (20)5.2 细胞的传代培养 (21)5.3 空斑筛选实验 (21)5.3.1 空斑筛选细胞的选择 (21)5.3.2 RNA干扰对空斑筛选结果的影响 (22)5.3.3干扰素γ对空斑筛选结果的影响 (22)参考文献： (22)致谢 (24)猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建The construction of recombinat Virus for Generating a Novel Genetic Engineering Vaccine Agansit O Type FMDV ofPig摘要口蹄疫是一种急性、高度传染性的病毒性传染病，虽自20世纪初口蹄疫疫苗已经在世界部分地区应用，但目前全球口蹄疫疫情依然严重，也构成了世界动物及动物产品贸易的障碍。

由本实验室构建的猪伪狂犬病毒基因缺失株PRV TK-/gE-/LacZ+作为一种病毒载体，具有安全性好、容量大、重组效率高等优点，本研究用人工合成的O型口蹄疫P1基因作为抗原基因，用和泛素（Ub）融合的UbiP1作为另一个抗原基因同时达到增强细胞免疫效果，再将针对口蹄疫3B基因设计的shRNA和具有抗病毒及免疫调节效果的猪IFN-γ与以上两个功能基因串联，构建了具有四个功能基因的转移载体，将此转移载体和PRV缺失株TK-/gE-/LacZ+共转染细胞，发生基因重组后进行了空斑纯化，经鉴定，初步得到了含有P1基因、UbiP1、shRNA、IFN-γ四个功能基因的重组伪狂犬病毒，为进一步构建新型基因工程疫苗打下基础。

关键词：抗原基因；泛素蛋白基因；干扰素基因；重组病毒AbstractFoot and mouth disease (FMD) is an acute, highly contagious virul infection disease. Although vaccines, available since the early 1900s, have been used in parts of the world, the disease still is a serious globe outbtreak and become sanitary barrier to the commerce of animals and animal products. The vector virus PRV TK-/gE-/LacZ+ , constructed by our laboratory , has the advantages of safety, high capacity, high restructuring efficiency. This study we selecte synthetic O type FMDV P1 gene as antigen gene, P1 and ubiquitin (Ub) fusion gene UbiP1 as another antigen gene to enhance cellular immune effect. Then use shRNA designed for 3B gene of FMD, IFN-γ gene of porcine has anti-viral and immunomodulatory effects tandem with the above two function gene, constructed transfer vector with four functional gene. Making the transfer vector and the PRVTK-/gE-/LacZ+ cotransfected in cells. After the occurrence of recombinant, plaques were purified, identified, initially received recombinant pseudorabies virus with four functional genesof P1 gene, UbiP1, shRNA and IFN-γ, in order to further build a new foundation for the construction of genetic engineering vaccine.Key words：antigen gene; ubiquitin; interferon gene; recombinant virus英文缩略词表AbbreviationFMDV Ub UPS RNAi siRNA shRNA SIF IFNγPRV NCS Amp DMEM LB PBS PCR SDS EB OD EDTA PK Vero DMSO MEM Foot-and-Mouth disease virusUbiquitinUbiquitin-proteasome systemRNA interferenceRNA interference geneRNA interference geneInterference gene fragmentγ-interferon genePseudorabies virusNewborn calf serumAmplicillumDulbecco's Modified Eagle MediumLuria-Bertani mediumPhosphate buffer solutionPolymerase chain reactionSodium dodecylsulphateEthidium bromideOptical densityEDTA Disodium SaltPig kidney cellsAfrican green monkey kidney cellsDimethyl sulfoxideMinimal Essential Medium口蹄疫口蹄疫病毒泛素泛素蛋白酶系统小RNA干扰小RNA干扰基因小RNA干扰基因干扰基因区段γ干扰素基因伪狂犬病病毒新生牛血清氨苄青霉素改良Eagle培养基LB培养基磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应十二烷基磺酸钠溴化乙锭光密度乙二胺四乙酸猪肾细胞非洲绿猴肾细胞二甲基亚砜微小型培养基1前言1.1口蹄疫的基本特征1.1.1口蹄疫病毒基本概念口蹄疫(Foot-and-month disease, FMD)是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus, FMDV）感染引起的人畜共患的急性、烈性传染病，该病全世界分布广泛，主要感染偶蹄类，一旦爆发常造成巨大的经济损失。

由于存在制作灭活苗灭活不彻底和毒力返强造成的潜在危险，开发新型基因工程疫苗已引起人们的重视。

1.1.2口蹄疫病毒生物学特征口蹄疫病毒呈球形，正二十面体结构，直径20-25nm;无囊膜，对酸碱敏感，口蹄疫病毒粒子由衣壳和病毒核酸构成，衣壳由60个不对称的亚单位组成，每个亚单位含一分子的VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP4位于病毒颗粒内部。

FMDV属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，有7个血清型，即O，A，C，SAT 1, SAT 2, SAT 3和AsiaⅠ型(Rodriguez and Grubman, 2009)，各个血清型间无交叉反应（陆承平等，2005），病毒的这种特性，给其检疫、防疫带来极大的困难。

FMDV基因组为具有感染性的单股正链RNA，大小约8.5kb，只有一个开放的读码框(open reading frame, ORF)，两侧各有一个非编码区(non coding region, NCR)。

开放读码框首先翻译为一个多聚蛋白，经过蛋白酶切割为成熟的结构和非结构蛋白以及一些中间体。

FMDV基因组P1区编码结构蛋白，P12A前体物在3C蛋白酶作用下形成由VP4-VP2，VP3和VP1组成的原体。