平滑肌细胞培养实验步骤解读
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。
方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。
结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。
结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。
【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞[Abstract]ObjectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed bymodified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys”morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis.[Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointima formation)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)密切相关[1~4]。
平滑肌细胞培养方法
平滑肌细胞培养方法
1.平滑肌细胞培养基本介绍
平滑肌细胞是一种广泛存在于人体的微小细胞，它们在舌头、咽喉、唾液腺、支气管、胃肠道等部位有分布。
主要作用是运输氧气，调节呼吸、控制血管压力，调节胃肠道收缩等。
平滑肌细胞在心血管病、恶性肿瘤、胃肠道疾病及甲状腺功能紊乱方面有诸多应用，因此，平滑肌细胞的培养方法十分重要。
2.平滑肌细胞培养步骤
（1）切取肌组织，从人体和动物肠道中切取肌肉组织，如舌苔腺或食管。
（2）洗涤组织：将取出的肌肉组织放置于容器中，加入能够破坏真菌等细菌的生物消毒液，用弱酸
洗涤细胞。
（3）离心：将洗涤过的肌组织穿过45μm滤网，净化血清及消毒液，用1000-3000×g的离心力、37℃的低温离心过滤和洗涤，保证细胞的活性。
（4）脱管：将离心过滤和洗涤过的细胞放入培养管中，用0.125%葡萄糖胰酶液将细胞脱管，然后20%牛血清 or 小鼠血清分散离细胞，取离心的物质收集细胞悬液。
3.平滑肌细胞培养培养基的配制
（1）细胞培养基的选择：具有细胞活力的DMEM、RPMI-1640等哺乳动物细胞培养基可以
分别作为基础培养基。
（2）培养基中添加抗生素：如卡那霉素、链霉素、林可霉素等，防止杂菌污染。
（3）添加特定生长因子：如胰岛素、EGF、HCF 等，以促进细胞生长。
平滑肌细胞培养实验步骤解读
平滑肌细胞培养实验步骤解读原代平滑肌细胞培养Protocol实验准备：器材：注射器（10mL），玻璃吸管，胶头（用于细脚吸管，吹匀组织块用），枪头（蓝色、黄色），移液器（1000μL，100μL），电动移液器，玻璃培养皿（2-3个），小烧杯（10 mL或5 mL），青霉素瓶（配鼠尾胶原），剪刀（大，小，弯）多把，镊子（大，小，弯）多把，纱布，六孔板（真空包装），托盘（放老鼠），酒精棉球，乳胶手套试剂：平滑肌细胞专用培养基，生理盐水，D-hank’s 液，鼠尾胶原，戊巴比妥钠（麻醉用），75%酒精步骤：1. 高压灭菌实验所需器材，超净台紫外照射30mins，吹风；2. 配制鼠尾胶原应用液，一般1:15-1:19稀释，六孔板中每孔加入1mL稀释液待用（可省去）；3. 大鼠（200g左右，一百五六十克较好）腹腔注射一定体积戊巴比妥钠（0.5mL/100g）麻醉，麻醉好后将大鼠全身（尤其是胸腹部）用酒精棉球擦拭干净，放入托盘置于超净台中紫外照射15mins左右，开始试验；4. 用已消毒的剪刀将大鼠腹部表皮剪开，充分暴露出整个胸部，再换用干净的剪刀打开胸腔。
将肝脏及肺脏等组织拨开（小心操作以避免伤到血管）。
用小弯镊及小直镊分离胸主动脉外壁贴附的结缔组织及外膜等。
分离干净后，用眼科剪小心剪断血管，去除血管中的血，置于干净玻璃培养皿中；5. 用生理盐水多次冲洗分离出来的血管。
冲洗干净后，将血管剪开，小心刮除血管内膜，去掉内皮细胞；6. 将处理好的血管放入平滑肌细胞专用培养基（约200μL）中，用眼科剪将组织尽量剪碎成1mm3大小的小块，用细脚吸管吹匀后，均匀种入加了鼠尾胶原的六孔板中；7. 用黄枪头小心吸弃多余的液体（避免将组织块吸起来），然后将六孔板盖好颠倒放在培养箱中约2h（待组织块粘牢培养板底）后，再加入培养基；8. 过3-4d后拿出细胞在显微镜下观察，看其是否已长出。
肺动脉平滑肌细胞原代培养原代培养
肺动脉平滑肌细胞原代培养操作流程一、实验准备1、健康雄性SD大鼠一只，4周大，重约200g。
2、 75％消毒用酒精2瓶，5%碘酒1瓶，无菌0.01MPBS溶液500ml，M199培养基100ml（含4mmol/L 的谷氨酰胺、15%胎牛血清、20万IU/L青霉素、20万IU/L链霉素）。
3、生物安全柜2个，解剖板1个（含4条固定用绳子），1L烧杯1个，培养皿5个，培养瓶5个，1ml 吸管20根，弯头吹打管10根，眼科剪3把，眼科镊3把，解剖镊3把，止血钳4把，手术刀1把，刀片若干，吸头若干、棉签纱布若干，口罩帽子及无菌手套若干。
二、操作步骤1、洗手，戴口罩帽子及手套。
2、酒精喷洒并擦拭生物安全柜1，放入培养皿1个（倒入PBS并盖好）、手术刀1把、组织剪1把、止血钳4把及纱布若干（均经蒸汽灭菌消毒）。
3、处死大鼠（断颈法），完全浸泡于盛有75%的1L烧杯中3min，碘酒酒精消毒解剖板（包括绳子），换手套，取出大鼠，固定于解剖板上，放入生物安全柜1，打开紫灯消毒30min。
4、酒精喷洒并擦拭生物安全柜2，于左侧放培养瓶、吸管及弯头吸管，眼科剪3把，眼科镊3把，中间放培养皿4个（打开，共8个，其中5个倒入PBS），以上物品均经蒸汽消毒灭菌，除培养皿外均应装入消毒饭盒内防止污染。
左侧放解剖镊1把（泡入酒精中，取吸管时用）。
打开紫灯消毒30min。
5、打开生物安全柜1，开吹风机10min，再一次消毒老鼠。
6、换手套，用手术刀、止血钳、解剖镊、组织剪等开胸，取出完整的心肺组织放入培养皿内，盖好。
7、打开生物安全柜2，开吹风机10min，放入装有心肺培养皿。
8、换手套，用眼科剪眼科镊仔细分离出肺动脉。
9、将取出的肺动脉（长约0.5cm）放入无PBS的培养基中，去除纤维外膜，用眼科剪将其剖开，用PBS 冲洗3次至无血迹，（原则上还应刮除肺动脉内皮细胞，但因组织太小不好操作，且内皮细胞在M199培养基中不易生长，故此操作可省略）。
大鼠血管平滑肌细胞的培养
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平滑肌细胞传代
传代时间：大部分组织块长出细胞晕， 并与相邻细胞晕相接触时就可以传代
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传代步骤：
倒掉培养瓶中的培养液
用D-Hank’s液洗两遍
加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液，平 放培养瓶，在倒置纤微镜下观察细胞 消化情况，可见到细胞质回缩，细胞 间隙增大时迅速翻转培养瓶，使细胞 脱离消化液
大鼠血管平滑肌细胞的 培养
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相关帮助
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0.10
NaCl
8.0
NaHCO3 Na2HPO4.12H2O D-glucose
0.35 0.12 1.0
Phenol red
0.01
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13
将 CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中， 其它成分溶在750 mL的ddH2O中，混 匀（用磁力搅拌器搅拌至溶解），定
容至1000mL。高压蒸气消毒10分钟， 4℃冰箱保存。
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血管平滑肌细胞的冻存和复 苏
冻存时间：较早期传代，以防细胞因 为传代次数过多而造成细胞衰老或发 生改变，以保持实验条件的一致性。
冻存方法：冻存前24小时更换培养液， 冻存时要将密闭好的冻存管依次放于：
4ºC
2小时
-20ºC 2.5小时
人脑血管平滑肌细胞培养
1100Human Brain Vascular Smooth Muscle Cells人脑血管平滑肌细胞血管平滑肌细胞是许多动脉疾病的细胞水平的根源。
血管平滑肌细胞的加速生长潜能是血管疾病进展的关键因素。
最新研究表明血管平滑肌细胞表达的ICAM-1 和VCAM-1能促进血管壁的炎症反应，并且与血管疾病的发展及稳定性有关.人血管平滑肌细胞的体外培养是血管研究中的重要模型，并将对血管疾病的药理学和治疗研究提供大量信息.细胞培养说明注意：冷冻保存的细胞非常脆弱。
将小瓶置于37°C水浴，然后尽快移入培养物中，尽量减少操作。
经过以下步骤后开始培养细胞1.准备多聚赖氨酸包被的培养瓶(2μg/cm2，推荐用T-75的培养瓶)。
向T-75瓶内加入10ml 无菌水，然后加入15μl多聚赖氨酸原液(10mg/ml,ScienCell cat. no. 0413).将培养瓶放入培养箱中过夜(至少在37°C中过一小时)2.准备完全培养基：用70%的酒精为培养基和添加物的外表面消毒，然后放到无菌的地方。
在无菌环境下打开每一个添加物小管并用吸管加入到基本培养基中。
用培养基冲洗每一个小管以保证添加物全部加入基本培养基中。
3.用无菌水冲洗多聚赖氨酸包被的培养瓶两次并向瓶内加入20 ml完全培养基。
将培养瓶放入超净台中，然后融化细胞。
4. .将小瓶放入37°C水浴中，轻轻地握住并旋转小瓶直到完全融化。
将小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精冲洗小瓶，然后放到无菌环境中。
小心地打开盖子，注意手指不要碰到里面。
用1ml eppendorf吸管轻轻重悬管内容物。
5.将管中内含物放入均匀的，多聚赖氨酸包被的培养瓶中。
推荐接种密度为5,000 cells/cm2。
注意：细胞融化后不推荐稀释和离心，因为这些操作比培养基中DMSO残留物对细胞的伤害大。
血管平滑肌细胞接种在多聚赖氨酸包被的培养瓶中能促进细胞帖壁。
人主动脉血管平滑肌细胞提取
人主动脉血管平滑肌细胞提取
1. 实验器材准备，准备好所需的培养皿、离心管、各种培养基和消化酶等实验器材。
2. 组织样本获取，从人体捐赠者或手术获取的组织样本中，选择主动脉组织进行提取。
确保样本来源合法，并且符合伦理标准。
3. 组织处理，将主动脉组织迅速转移到无菌的条件下，用生理盐水或其他缓冲液清洗组织，去除血液和杂质。
4. 细胞分离，使用适当的消化酶（如胰酶）对组织进行消化，以分离出平滑肌细胞。
消化时间和酶的浓度需要进行优化，以确保细胞的完整性和纯度。
5. 细胞培养，将分离得到的平滑肌细胞接种到培养皿中，使用适当的培养基进行培养。
培养条件需要控制温度、湿度和二氧化碳浓度等参数。
6. 细胞鉴定，通过形态学观察和特异性标记物的免疫细胞化学染色等方法，对提取得到的细胞进行鉴定，确保其为主动脉平滑肌
细胞。
7. 细胞保存，根据需要，可以将提取得到的细胞进行冻存，以备后续实验使用。
总的来说，人主动脉血管平滑肌细胞的提取是一项复杂的实验技术，需要严格控制实验条件和遵守相关伦理规范。
通过精心设计实验方案和严格执行操作流程，可以获得高质量的细胞样本，为心血管疾病研究提供重要的实验材料。
大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定-最新年精选文档
[1] 。
大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础， 在高血压、 动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等 许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖 血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、 中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成， 外膜层由要收缩调节机体的血流和血压， 其功能障碍在心血管疾病中起着 非常重要的作用， 因此， 对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深 入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。
在VSMC 勺研究中， 组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。
本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞 的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ） 进行免疫细胞化学鉴定。
1 材料与方法成纤维细胞组成， 中膜层由血管平滑肌细胞组成， 平滑肌细胞主1.1 材料。
动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。
DM EMS 糖培养 基 （美国 Gibco 公司） ， Hepes 索莱宝） ， 优质胎牛血清 （原 代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。
转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。
放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。
基底动脉平滑肌细胞(smooth muscle cell)原代培养方法
基底动脉平滑肌细胞（smooth muscle cell）原代培养方法
原代细胞培养：取5kg左右兔空气栓塞法处死后断头，于无菌条件下从枕大孔处用大止血箝扳开颅骨暴露并小心取出脑组织放入装有DMEM的培养皿中，用眼科镊分离基底动脉后按常规平滑肌方法贴块培养。
传代：
（1）吸除培养瓶内旧培养液。
（2）D-Hanks液冲洗2遍。
（3）加入消化液少许，以能覆盖瓶底为限。
（4）倒置显微镜观察发现细胞胞质回缩、细胞间隙增大时，立即终止消化。
（5）吸除消化液，向瓶底注入D-Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉。
（6）用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；首次传代将原代细胞按1：1传代，此后按1：3进行传代。
（7）传代后细胞放置在37℃，5%CO2孵育箱内培养。
我在做细胞培养时的一些小经验：
（1）在超净台操作（废液杠放入）前要用紫外灯照30MIN以上，75%酒精擦手
（2）贴块法要细胞贴壁好一定剪的够碎（先把血管剪成小段再狂剪一顿），铺开时要平均的展开，聚在一起翻面时容易冲掉。
（3）做原代的时候从取材直到放进孵箱都要严格无菌操作，该换的管子还是换了，别省了根管子坏了一瓶细胞
（4）原代培养FBS含量最好高些，原代很娇贵的。
气道平滑肌原代培养实验设计
气道平滑肌原代培养实验设计气道平滑肌是呼吸系统中的重要组成部分，其中包括气管、支气管和肺泡等结构。
气道平滑肌的异常收缩和松弛与许多呼吸系统疾病如哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等有关。
为了研究气道平滑肌的功能和调控机制，可以进行气道平滑肌原代培养实验。
实验目的：1.建立气道平滑肌原代培养模型。
2.研究气道平滑肌的功能及其调控机制。
实验材料：1.健康人的气道组织样本。
2.气道平滑肌细胞培养基。
3.酶消化液（如胰蛋白酶和DNA酶）。
4.培养皿、离心管、离心机、显微镜等实验仪器和耗材。
实验步骤：1.收集健康人的气道组织样本，并迅速将样本转移至含有冷平衡无菌PBS（磷酸盐缓冲液）的离心管中。
2.将气道组织样本在冰上快速剁碎，然后用酶消化液消化组织块，以获得气道平滑肌细胞。
3.将消化得到的细胞悬浮液经过离心分离，去除上清液。
收集沉淀的气道平滑肌细胞。
4.将气道平滑肌细胞转移至含有培养基的培养皿中，用显微镜观察细胞形态和数量。
5.将培养皿放入恒温培养箱中，保持温度、湿度和CO2浓度适宜的条件，进行细胞培养。
6.定期观察细胞的生长状态和形态，并更换培养基。
7.可以进行细胞增殖、侵袭和迁移等功能实验，以研究气道平滑肌的功能。
8.可以添加不同的生物活性物质或药物，并观察其对气道平滑肌的影响。
9.可以进行蛋白质或基因的表达分析，以研究气道平滑肌的调控机制。
实验注意事项：1.实验过程中需要保持无菌操作，以避免细菌或其他污染物的存在。
2.实验室工作人员需要穿戴好防护服和手套，以避免对自身和实验样本的污染。
3.实验室应具备恒温培养箱、培养皿、离心机、显微镜等实验仪器和耗材。
4.培养基的配制需要严格按照相关实验方法和要求进行。
5.实验过程中需要注意细胞的生长状态和形态，并定期更换培养基以维持细胞的正常生长。
气道平滑肌原代培养实验是研究气道平滑肌功能和调控机制的重要手段。
通过建立气道平滑肌原代培养模型，可以模拟体外条件下气道平滑肌的生长和功能特性，为深入研究呼吸系统疾病的发生机制和寻找治疗方法提供重要依据。
气道平滑肌原代培养实验设计
气道平滑肌原代培养实验设计在本实验中，我们旨在培养和研究气道平滑肌的原代培养模型。
为了成功进行这一实验，我们需要按照以下步骤进行实验设计。
1. 器材准备：- 细胞培养皿：选择适合培养气道平滑肌的细胞培养皿，如培养瓶或多孔板。
- 细胞培养基：选择适合气道平滑肌细胞生长的培养基，如DMEM/F12基础培养基。
- 细胞分离试剂：选择合适的消化酶（如胰蛋白酶）和抗生素/抗菌药物来分离和培养气道平滑肌细胞。
2. 细胞来源：- 来源选择：根据实验需求，选择适合的组织来源获取气道平滑肌细胞，如人类气道组织或动物模型。
- 组织处理：将组织进行机械剪切或酶消化以释放细胞，然后通过过滤或离心分离来获得单个细胞。
3. 细胞培养：- 接种细胞：将获得的气道平滑肌细胞悬浮在适当的培养基中，并根据需要调整细胞浓度。
- 培养条件：将细胞培养在37°C恒温培养箱中，添加5%二氧化碳以提供合适的培养条件。
- 细胞培养基更新：每2-3天更换培养基，以保持适当的营养供应和细胞健康。
- 细胞观察和细胞增殖：使用显微镜观察细胞形态，并记录细胞增殖情况。
4. 刺激试验：- 药物处理：根据实验设计，向培养基中添加不同的刺激物，如药物或生物因子。
- 反应观察：根据实验目的，观察细胞对刺激物的反应，记录并分析相关数据。
5. 实验数据采集和分析：- 数据记录：记录实验过程中的各项观察结果，包括细胞形态、生长状况和反应情况等。
- 数据分析：对实验数据进行统计学分析，如均值、标准差和相关性等。
- 结果解释：根据数据分析结果解释实验结果，并将其与已知文献或其他实验结果进行对比。
通过以上实验设计，我们可以建立气道平滑肌原代培养模型，并对其进行进一步研究和探索。
这将有助于我们更好地了解气道平滑肌的生物学功能和相关疾病的发生机制，从而为新药研发和临床治疗提供有价值的参考。
血管平滑肌细胞原代培养
血管平滑肌细胞原代培养血管平滑肌细胞是构成血管壁的主要细胞成分，具有调节血管管径和维持血管壁稳定的重要作用。
血管平滑肌细胞的原代培养是研究血管生物学和血管疾病发生机理的常用方法之一，同时也是研究血管再生和维修的基础。
1. 材料（1）动物组织：小鼠主动脉、人体脐带血。
（2）DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、0.1%胶原酶、1%抗生素-抗菌素、无菌PBS。
（3）T-25培养瓶、15毫升离心管、1毫升离心管、细胞计数板、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、培养皿等。
2. 方法①用消毒剂清洁手部等操作区域，将小鼠主动脉取出，去除外膜和内膜，将中层切成0.5毫米大小的小块。
②将小鼠主动脉碎片与0.25%胰酶和0.1%胶原酶混合液在37℃下消化3小时。
③将消化液离心，将沉淀用DMEM培养基混合后分装在T-25培养瓶中，添加10%胎牛血清和1%抗生素-抗菌素。
④将培养瓶放置在37℃的细胞培养箱中培养，每天更换一次培养基，至细胞达到80%-90%的密度时进行传代。
①将人脐带血收集入无菌离心管中，用相同容量的PBS混合，离心15分钟，去除上清液。
3. 结果经过数天的培养，小鼠主动脉或人脐带血管平滑肌细胞可在培养瓶中生长形成典型的“山川”式形态，细胞密度逐渐增加。
细胞在培养基中会分泌胶原和纤维蛋白等胶原成分，这些成分有助于维持细胞外基质的稳定性和促进细胞分裂生长。
经过多次传代后，细胞的生长速度将明显加快，并且会逐渐转化为诱导型平滑肌细胞，表达平滑肌肌动蛋白和舒张激肽受体等标记物质。
4. 结论血管平滑肌细胞原代培养是研究血管生物学和血管疾病发生机理的重要方法。
通过原代培养可以维持细胞的稳定生长，并且可以进行多次传代，以获得更多的细胞，更好地研究细胞功能。
本实验采用小鼠主动脉和人脐带血作为来源，通过胰酶和胶原酶的消化分离获得血管平滑肌细胞，然后进行培养，可得到较为纯净的细胞。
在培养的过程中，需要注意细菌、真菌和病毒的污染，以及细胞的密度和培养基的更换等。
组织块贴壁法培养大鼠平滑肌细胞实验指导
大鼠主动脉平滑肌细胞培养正常的动脉壁由三层构成，分别为内膜、中膜和外膜。
其中，中膜主要是平滑肌细胞，可以使血管收缩和舒张。
平滑肌细胞的舒缩可控制管径的大小，调节器官的血流量，保持血压稳定。
血管平滑肌细胞是许多重大动脉疾病的细胞底物。
血管平滑肌细胞的不断增长是损伤性血管病变形成、动脉疾病发展的重要原因。
体外培养血管平滑肌细胞是研究在血管病变发生过程中细胞及分子改变的基础。
此外平滑肌细胞具有产生结缔组织和基质的功能，因此动脉平滑肌细胞是研究动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄以及高血压等疾病发病机制和防治工作的重要对象。
研究表明，大、中动脉的内膜和中膜内没有成纤维细胞，而平滑肌细胞大部分存在于中膜，因此主动脉中膜可作为获取平滑肌细胞的最佳来源。
胸主动脉分支较少，而腹主动脉较多，尽量去除分支利于平铺于培养皿中。
本视频以大鼠主动脉为材料，介绍以组织块贴壁法培养平滑肌细胞的技术。
一、实验前准备实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。
选取SPF级，体重100~150g左右的SD大鼠，断颈处死。
将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min。
工作台紫外消毒后，采用通风机通风3min。
以75%酒精擦拭操作台和双手。
无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。
将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。
二、主动脉采集剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹腔，将腹腔内脏拨到一侧，然后以眼科镊子轻轻剥离连接内脏的结缔组织，暴露主动脉，注意尽量采用镊子的钝端，以免戳破或弄断动脉。
也可采用无菌纱布轻轻擦拭动脉外膜，以清晰暴露视野，去掉部分外膜。
为了尽量获得取材标本，需从腹主动脉向上直至分离至心脏连接处，分离动脉时，注意将动脉与之相连的下腔静脉分离，并仔细剪断两端的细小分支，剪断两端，将动脉轻柔置于无菌培养皿中。
样品漂洗及剪切用无菌PBS浸泡清洗剪取的主动脉血管。
血管平滑肌细胞原代培养
血管平滑肌细胞原代培养血管平滑肌细胞是一类组成血管壁的细胞，对调节血管的收缩和扩张起着重要作用。
其原代培养是进行相关功能和分子机制研究的必要手段之一。
本文将从原代培养的优点，培养方法，细胞检测和应用等方面进行介绍。
一、原代培养的优点血管平滑肌细胞原代培养是从组织中分离出血管平滑肌细胞，并在体外环境中进行繁殖和生长的过程。
相比于细胞系，原代培养有以下优点：1.细胞纯度高；2.种群亲缘关系稳定；3.细胞表型稳定；4.研究结果具有可靠性和可比性；5.研究范围广泛。
二、血管平滑肌细胞原代培养的方法血管平滑肌细胞原代培养主要包括以下步骤：1.组织的消化和细胞的分离；2.细胞培养和子培养；3.细胞的验证与鉴定。
1.组织的消化和细胞的分离组织消化是细胞培养基础环节，主要利用一些酶类消化酶溶解组织细胞膜上的蛋白聚糖，使得以上葡萄糖酸、胶原酶等酶能够快速地分离出单个的细胞。
其中，血管平滑肌细胞的消化方式一般有两种：机械法和消化法。
机械法是使用刀片或振荡器等器械将组织切碎，并筛选出合适的细胞；消化法则是将组织切成小块，利用酶类溶解器，如胰蛋白酶、胶原酶等消化液，将细胞释放出来。
2.细胞培养和子培养细胞培养是指将原代培养得到的细胞在适切的培养条件下持续维持生长状态的过程，包括培养基的配制、细胞的分离和接种、试验原理与评价、细胞状态的维持以及检测鉴定等一系列过程。
此过程需注意的问题有细胞的密度、培养时间、细胞饱和度及细胞的分裂活性等。
3.细胞的验证与鉴定细胞原代培养过程中，细胞的鉴定与验证能够大致分为两个方面：构象和分子水平。
其中包括细胞表型的检测与鉴定、细胞的生长状态，如细胞生长曲线、生长速率以及细胞周期等标定，以及细胞的弹性、细胞结构性质等重要参数的检测。
三、血管平滑肌细胞原代培养的应用血管平滑肌细胞原代培养的应用范围较广，除了常见的药理学实验外，主要应用于以下方面：1.血管病理生理研究方面血管平滑肌细胞在血管病理生理研究中发挥着重要作用。
平滑肌实验报告
平滑肌实验报告引言：平滑肌是人体内一种重要的肌肉类型，广泛分布于血管、消化道、呼吸道等器官中。
它具有不同于骨骼肌的特点，能够自发性地收缩和松弛，并参与各种生理过程。
了解平滑肌的结构和功能，对于研究人体生理学、病理学以及药物的作用机制等方面有着重要的意义。
在本次实验中，我们将通过对平滑肌的观察和测量，深入了解其特点和响应机制。
实验一：平滑肌的构造观察首先，我们通过显微镜观察了平滑肌的基本结构。
将取自小鼠食道的组织标本置于载玻片上，加入显微镜溶解液进行处理并覆盖载玻片。
在显微镜下，我们可以清晰地看到平滑肌组织中的细胞形态和纤维排列。
与骨骼肌相比，平滑肌的细胞形状更加细长，并且没有明显的横纹。
接着，我们观察了平滑肌的收缩特点。
将取自小鼠的平滑肌组织分割成较小的片段，并放置在培养皿中，加入生理盐水和适量的钙离子。
随着钙离子的加入，平滑肌组织逐渐收缩，并呈现出波浪状的动态变化。
通过记录收缩的持续时间和幅度，我们可以量化地评估平滑肌的收缩能力。
实验二：通过药物研究平滑肌的响应机制为了进一步研究平滑肌的响应机制，我们选择了常见的药物去甲肾上腺素（noradrenaline）和乙酰胆碱（acetylcholine），它们分别代表交感神经系统和副交感神经系统的作用。
我们首先将分割好的平滑肌组织片段分别置入含有去甲肾上腺素或乙酰胆碱的培养液中，观察其收缩状况。
结果显示，去甲肾上腺素的加入使平滑肌组织呈现出较为强烈的收缩状态，而乙酰胆碱的作用则使其放松松弛。
进一步地，我们测量了平滑肌组织在不同浓度药物下的收缩反应。
通过逐渐增加药物浓度，我们发现平滑肌组织的收缩强度和持续时间均呈现出剂量依赖性的变化。
这表明平滑肌对于不同药物的反应存在一定的敏感性，并且其机制可能与特定的受体和信号传导途径有关。
结论：通过本次实验，我们得出了以下结论：1. 平滑肌具有不同于骨骼肌的结构特点，细胞形状细长且无明显的横纹。
2. 平滑肌能够自发性地收缩和松弛，表现出波浪状的动态变化。
血管平滑肌细胞分离及培养
血管平滑肌细胞分离及培养血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是血管中膜的主要细胞成分。
具有增殖、迁移、合成并释放细胞基质的能力，在血管性疾病的发生进展中有重要作用。
目前已了解到血管平滑肌细胞的增殖和增生是动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉腔内成形术后再狭窄等的主要病理表现。
利用体外培养血管平滑肌细胞可了解其正常和病态生物学特性及机制。
体外培养血管平滑肌细胞举行药物药理学方面的讨论。
体外培养血管平滑肌细胞可取材于不同动物及人胚胎或成体的不同部位的血管，按照讨论目的举行挑选。
血管平滑肌细胞分别培养办法较多，主要有簇拥细胞培养法、植块培养法、微血管培养法。
其中植块培养法可得到数量较多的平滑肌细胞而适用于药理讨论。
还可按照讨论需要将分别得到的平滑肌细胞举行蜕变培养、克隆培养、与内皮细胞共培养等。
【材料】 1．动物或人胚胎血管。
2．试剂 0.1%、0.1％,MEM 培养基（含10％新生牛血清，4mmo1/L，10万U/L和l00mg/L）。
Hanks 液（每1000m1含NaCl 8.00g, KCl 0.40g，CaCl 0.14g，MgS04·7H20 0.20g, KH2P04 0.06g, NaHC03 0.35g，glucose 1.00g，0.02g)。
3．器皿及仪器细胞培养用器皿，手术器械，净化工作台、C02孵箱、倒置显微镜、荧光显微镜等。
【办法】 1．簇拥细胞培养法（酶消化法）无菌术取颈或股动脉，于预冷Hanks液中洗涤3次，认真剥除血管表面结缔组织。
将血管纵向剖开移入另一装有0.1％胶原酶(D-Hanks配制）消化液的平皿中。
37℃消化30分钟后，认真剥离外膜及外层中膜并用小刀片轻轻刮除内膜，Hanks液冲洗后移入另一清洁的盛有消化酶平皿中（或剪成1 mm3组织块碎块，置离心管中）37℃消化2～3小时，时常轻晃，至组织呈絮状，收集细胞悬液并与5倍量含10％新生牛血清的培养基混合，终止消化。
气道平滑肌细胞培养指南
气道平滑肌细胞培养指南引言：气道平滑肌细胞是研究呼吸系统相关疾病的重要细胞模型之一。
正确的气道平滑肌细胞培养方法对于研究这些疾病的发病机制以及药物筛选具有重要意义。
本文将为您介绍一种简单有效的气道平滑肌细胞培养方法，帮助您成功培养出高质量的气道平滑肌细胞。
一、材料准备1. 细胞培养基：选择适合气道平滑肌细胞培养的基础培养基，如DMEM/F12。
2. 无菌培养器具：培养皿、移液管、离心管等。
3. 细胞培养试剂：胰岛素、胆固醇、转铁蛋白、胰酶等。
二、气道平滑肌细胞的分离与培养1. 收集人体气道组织：从手术切除的肺组织中分离出气道组织，保持组织的完整性和无菌状态。
2. 组织消化：将气道组织切割成小块，加入含有胰酶和胆固醇的消化液中，在37摄氏度下消化2-3小时。
3. 细胞分离：用离心管收集消化液中的细胞，离心沉淀后，取上清液中的上清液，含有气道平滑肌细胞。
4. 细胞培养：将气道平滑肌细胞悬浮于培养基中，加入胰岛素和转铁蛋白等促进细胞生长的因子，以37摄氏度、5%二氧化碳、95%湿度的条件下培养。
三、细胞培养条件的控制1. 培养基的更换：每两天更换一次新鲜的培养基，保持细胞的生长和代谢所需。
2. 细胞的传代：当细胞生长至80%～90%的密度时，用胰酶消化细胞，将细胞分为新的培养皿中，继续培养。
3. 培养条件的控制：保持恒定的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供适宜的细胞环境。
四、细胞的鉴定和应用1. 细胞的鉴定：利用免疫荧光染色或PCR等方法检测细胞中特定的标志物，如α-平滑肌肌动蛋白。
2. 细胞的应用：将培养好的气道平滑肌细胞应用于相关的研究中，如细胞增殖、细胞迁移和细胞收缩等实验。
结论：本文介绍了一种简单有效的气道平滑肌细胞培养方法，从气道组织的分离到细胞的培养，为研究呼吸系统相关疾病提供了可靠的实验模型。
通过严格控制培养条件和细胞鉴定，可以获得高质量的气道平滑肌细胞，为相关研究提供有力的支持。
希望本文的指南能够帮助到需要进行气道平滑肌细胞培养的研究者，推动相关领域的科学发展。
平滑肌细胞培养-文献版解读
01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1 细胞培养1.1.1 培养液配制 DMEM(美国Gibco公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素 (100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,美国Hyclone)。
1.1.2 培养器皿 25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。
1.1.3 大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。
动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。
每次取材2~3只大鼠。
贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。
纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。
用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。
滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。
并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。
盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。
待有细胞从组织块周围游出后换液。
1.1.4 原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。
加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。
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原代平滑肌细胞培养Protocol
实验准备：
器材：注射器（10mL），玻璃吸管，胶头（用于细脚吸管，吹匀组织块用），枪头（蓝色、黄色），移液器（1000μL，100μL），电动移液器，玻璃培养皿（2-3个），小烧杯（10 mL或5 mL），青霉素瓶（配鼠尾胶原），剪刀（大，小，弯）多把，镊子（大，小，弯）多把，纱布，六孔板（真空包装），托盘（放老鼠），酒精棉球，乳胶手套
试剂：平滑肌细胞专用培养基，生理盐水，D-hank’s 液，鼠尾胶原，戊巴比妥钠（麻醉用），75%酒精
步骤：
1. 高压灭菌实验所需器材，超净台紫外照射30mins，吹风；
2. 配制鼠尾胶原应用液，一般1:15-1:19稀释，六孔板中每孔加入1mL稀释液待用（可省去）；
3. 大鼠（200g左右，一百五六十克较好）腹腔注射一定体积戊巴比妥钠（0.5mL/100g）麻醉，麻醉好后将大鼠全身（尤其是胸腹部）用酒精棉球擦拭干净，放入托盘置于超净台中紫外照射15mins左右，开始试验；
4. 用已消毒的剪刀将大鼠腹部表皮剪开，充分暴露出整个胸部，再换用干净的剪刀打开胸腔。
将肝脏及肺脏等组织拨开（小心操作以避免伤到血管）。
用小弯镊及小直镊分离胸主动脉外壁贴附的结缔组织及外膜等。
分离干净后，用眼科剪小心剪断血管，去除血管中的血，置于干净玻璃培养皿中；
5. 用生理盐水多次冲洗分离出来的血管。
冲洗干净后，将血管剪开，小心刮除血管内膜，去掉内皮细胞；
6. 将处理好的血管放入平滑肌细胞专用培养基（约200μL）中，用眼科剪将组织尽量剪碎成1mm3大小的小块，用细脚吸管吹匀后，均匀种入加了鼠尾胶原的六孔板中；
7. 用黄枪头小心吸弃多余的液体（避免将组织块吸起来），然后将六孔板盖好颠倒放在培养箱中约2h（待组织块粘牢培养板底）后，再加入培养基；
8. 过3-4d后拿出细胞在显微镜下观察，看其是否已长出。