植物组织培养的一些注意事项1

植物组织培养的一些注意事项

一、常用培养基主要特性

1、高盐成分培养基包括MS、LS、BL、BM、ER 等培养基。其中MS 培养基应用最广泛,其钾盐、铵盐及硝酸盐含量均较高, 微量元素种类齐全, 其养分数量及比例均比较合适, 广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。LS、BM、ER 培养基由MS 培养基演变而来。

2 、硝酸钾含量较高的培养基包括B5 、N6 、LH、GS 等培养基。

①B5 培养基B5 培养基除含有较高的钾盐外, 还含有较低的铵态氮和较高的盐

酸硫胺素, 较适合南洋杉、葡萄及豆科与十字花科植物等的培养。

②N6 培养基N6 培养基( 朱至清等1975 ) 系我国学者创造, 获国家发明二等奖, 适用于单子叶植物花药培养, 柑橘花药培养也适合, 在楸树、针叶树等的组织培养中使用效果也好。

③SH 培养基是矿盐浓度较高的一种培养基, 其中铵与磷酸是由磷酸二氢铵

( NH4 H2 PO4 ) 提供的, 这种培养基适合于某些单子叶及双子叶植物的培养。

3 、中等无机盐含量的培养基

①H 培养基本培养基大量元素约为MS 培养基的一半, 仅磷酸二氢钾及氯化钙稍低, 微量元素种类减少, 而含量较MS 为高, 维生素种类比MS 多。适于花药培养。

②尼奇培养基(Niotsch 1969 ) 此培养基与H 培养基成分基本相同, 仅生物素比

H 培养基高10 倍。也适合于花药培养。

③米勒培养基(Miller 1963 ) 此培养基和Blaydes(1966) 培养基二者成分完全相同。适合大豆愈伤组织培养和花药等培养用。

4 、低无机盐培养基大多情况下用于生根培养基。有以下几种:

①改良怀特培养基(White 1963 )

②WS 培养基(Wolter & Skoog 1966)

③克诺普液( Knop 1965 ) 花卉培养上用得多。

④贝尔什劳特液(Berthelot 1934)

⑤HB 培养基( Holley & Baker 1963) 此培养基在花卉脱毒培养和木本植物的茎尖培养中效果良好。其成分是大量元素比1/ 2 克诺普( Knop ) 液稍多, 微量元

素用贝尔什劳特液, 每升培养基中加0 . 5ml。

二、与培养基有关的一些细节问题

1、培养基所用药品应采用等级较高的化学纯CP(三级) 及分极纯AR(二级) , 以免杂质对培养物造成不利影响。

2、调节PH也可用精密pH试纸(应在干燥器中保存, 以免吸湿而失效)。培养基过酸的可用1mol/ L 氢氧化钠( NaOH) 来调节; 培养基过碱的可用1mol/ L 盐酸( HCl ) 来调节( 1mol/ L NaOH 的配制方法是称40gNaOH, 溶解后加入蒸馏水, 定容到1 000ml 即可。1mol/ L HCl 的配制方法是量取12mol/ L HCl 84ml , 加水定容至1 000ml)。经高压蒸汽灭菌后, 由于某些成分的分解(如蔗糖的分解) 或氧化, 酸度会增加( pH 值一般可降低0 . 2 )。有时玻璃器皿质量较差, 其中一部分物质溶解, 也会影响酸度的变化。这些在调整pH 值时都要考虑进去。分装后应立即灭菌, 若因故不能及时灭菌, 最好放入冰箱中在24h 内完成灭菌工作。灭菌时压力表读数为0 . 8kg/ cm2 ～1 . 1kg/ cm2 , 121℃时保持15min～20min 即可。

3、某些生长调节物质, 如吲哚乙酸、玉米素及某些维生素等物质遇热不稳定, 因此不能进行高压灭菌, 而需用过滤方法灭菌, 经过滤灭菌的溶液, 可在琼脂培养基温度下降到大约40℃时加入到已高压灭菌的培养基中。

4、配好的培养基可放到培养室中预培养3d ,若没有污染反应, 则证明是可靠的, 可以使用。暂时不用的培养基最好置于10℃下保存, 含有生长调节物质的培养基在4℃～5℃低温下保存则更理想。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基应在配制一周内用完, 其他培养基至多也不能超过一个月。一般情况下, 两周内应用完, 以免干燥变质。

三、培养材料及消毒

1、取材季节的影响：大多数植物应在其生长开始的季节采样, 生长末期或已进入休眠期, 则外植体对诱导反应迟钝或无反应。

2、器官的生理状态和发育年龄：沿植物的主轴, 越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短, 其生理年龄也越老, 越接近发育上的成熟, 越易形成花器官。反之, 越向下, 其生理年龄越小。木本植物的组织培养中, 以幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条较好, 下胚轴与具有3 对～4 对真叶的嫩茎段, 生长效果也较

好。一般情况下, 幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力。

3、材料大小的影响：材料越小成活率越低, 茎尖培养存活的临界大小应为一个茎尖分生组织带1 个～2 个叶原基, 约0 .2mm～0 .3mm 大小。叶片、花瓣等约为5mm2 , 茎段则长约0 .5mm。因此, 除非用于去除病毒否则不宜将外植体切的过小。但并不是说外植体越大越好, 外植体过大易造成污染, 有实验证明外植体越大污染率越高。

4、材料的灭菌：一般是组织越大越易污染, 夏季比冬季带菌多，甚至不同年份污染的情况也有区别。取材最好选在中午或下午, 避开阴雨天取材可减少污染率。消毒是为了消灭病菌, 以保证无菌组织培养的进行。但不同植物及一株植物不同部位的组织, 其带菌程度不同, 它们对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏感度也不一样。最初所使用的消毒剂种类, 浓度及消毒时间的长短都要进行摸索, 以达到最佳的消毒效果。

材料有绒毛最好在消毒液中加入几滴吐温- 80 ,对与难消毒的根及地下部位材料可将其浸入消毒液中进行抽气减压, 以帮助消毒液的渗入, 从而达到彻底灭菌的目的。潘学峰等( 1998) 报道, 12% 的双氧水+ 0 .1%的升汞混合液对南方地下茎生姜灭菌10min 的效果最好。

四、材料的接种

1、接种室的消毒：植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术, 做好接种室的消毒是至关重要的。污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子, 因此, 每次接种前应进行地面的清洁卫生工作, 并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降, 并用紫外线灯照射20min。接种前超净工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗,并定期清洗过滤膜, 以延长使用寿命。

2、无菌操作要求：工作人员使用的工作服、帽子、口罩等, 要经常保持干净, 并定期进行消毒, 即将洗净、晾干的衣帽、口罩等用纸包好后与培养基一起进行高压灭菌。工作人员的头发、衣服、手指中都带有许多杂菌, 为此要穿上工作服, 戴上帽子, 也必须剪除指甲, 并用肥皂擦洗, 最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10 min , 接种操作前则用70%酒精擦洗。工作人员的呼吸所产生的污染, 主要是

在接种时谈话或咳嗽所引起的, 因此, 在操作时应禁止谈话并应戴上口罩。

3、材料的分离、切取和接种