基因克隆原理及实验介绍上课讲义
基因的克隆方法ppt课件
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
植物基因克隆的方法课件PPT
技术支持：
差别筛选法（differential screening） 扣除杂交技术（subtractive hybridization） mRNA差异显示技术（ mRNA differential
display reverse transcription-PCR） 代表性差异显示（representational difference
1.2根据基因的表型突变互补功能
植物的许多基因与细菌或酵母的突变 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因cDNA 记(EST)寻找新基上
◆ 此种方法只需检测基因表达库中每一cDNA的很短序列(9bp),建立基因表达图,根据基因表达图就可以发现新基因. 用植物偏爱的密码子，人工合成并克 1、筛选与目标基因连锁的分子标记
6、外显子的分离、鉴定
阳性克隆这些候选基因，再进行分离，时空 表达特点，同源性比较等分析确定目的基因。
定位克隆的优点和局限性
优点：不必知道基因产物的功能，也不需要
知道产生某表型的生化、生理和病理过程。 局限性：1、基因定位依赖分子标记。
未消失，发生转座的只是转座子的拷贝。 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
1、筛选与目标基因连锁的分子标记 增，扩增的片段经纯化后连接到合适的
基因发生转座可引起插入突变，使插入位 3、构建目的基因区域跨叠克隆（contig）
常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。 要求分离一个纯度很高的蛋白质.
的隆插该入 基和因嵌。合来克隆置基因的。 基因失活并诱导产生突变型或在插入
常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
目的基因克隆基因工程原理与技术刘志国课件ppt
DNA 片段与载体的比例, 对于不同生物采用的比例不同,
过程 （2）重组DNA分子导入受体细胞要方便。
以cDNA第一链和第二链为模板，用上、下游引物进行PCR扩增 目标DNA和载体浓度的确定 oligo（dT）-纤维素柱层析分离法 性，即形成可逆的瞬时通道，二ming recombination，RPR） 第一节 PCR扩增法获得目的基因
特点 设计两条引物GSP1和GSP2，GSP1在GSP2的外侧，以第三步中形成的杂合体为模板，利用引物GSP1为反转录引物合成cDNA第一
链
Strand ExchangeMutagenesis）
运用杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度有差别的单链
（正义引物） AGSP:基因特异引物
（反义引物）
盒式P CR原 理示 意图
5. RACE
rapid-amplification of cDNA ends
第一节 PCR扩增法获得目的基因
通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增， 得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完 整序列的方法
过程和分类
方法 以Southern 杂交来检验BAC 克隆插入片段是否
已超螺旋状态存在，分离抽提比YAC容易 高 重叠延伸PCR 法(Over-lap extension PCR )
反向PCR 以cDNA第一链和第二链为模板，用上、下游引物进行PCR扩增
第一链合成过程中形成cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA；
TAP处理全长的mRNA，去掉其帽子结构，保留 5’端的一个磷酸基团
设计锚定序列，具OP和IP区，用T4 RNA连接 酶，将具有锚定序列的一段短RNA寡核苷酸与 去掉帽子结构的mRNA进行连接
基因的克隆与表达课件
----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克 隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
基因克隆简介ppt课件
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
14
（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA
复制起点（ori）。
27
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
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⑤ 载体lacZ’与a互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
15
16
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 17
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
《基因克隆的策略》课件
基因克隆中的注意事项
1 序列特异性
在选择引物和连接适配体时，确保其与目标基因序列具有高度特异性。
2 子克隆
在需要处理大片段基因时，考虑进行子克隆以提高克隆效率和稳定性。
3 基因编辑
利用CRISPR-Cas9等技术进行基因编辑，使基因克隆做到精准和定向。
1
PCR扩增
2
使用PCR技术扩增目标基因
板。
3
转化
4
利用细菌转化技术，将复合物导入到
细菌中，使其能够在细胞内进行复制
和表达。
5
DNA提取
从细胞或组织中提取DNA，获得目标 基因的物质基础。
DNA连接
将扩增产物与适当的载体进行连接， 形成可表达的复合物。
筛选克隆
基因克隆的方法
PCR扩增
通过聚合酶链式反应 （PCR），在体外高效地扩 增目标基因序列，为后续的 克隆提供材料。
质粒载体克隆
将目标基因插入到特定的质 粒载体中，并通过细菌转化 技术将其传递到细菌宿主中 进行表达。
BAC克隆
利用细菌人工染色体（BAC） 作为载体，实现大片段基因 的稳定克隆和表达。
基因克隆的步骤
结语
影响因素
基因克隆受到许多因素的影响，包括目标基因 的特性、选择的克隆方法以及实验条件等。
进展与未来展望
随着科学技术的不断发展，基因克隆在生物医 药领域的应用前景将越来越广阔。
《基因克隆的策略》PPT 课件
欢迎来到本次课程！ 在这里，我们将讨论基因克隆的策略，包括定义、意义 以及各种克隆方法和步骤。
基因克隆的定义和意义
定义
基因克隆是指通过将目标基因插入到宿主细胞或载体中，实现基因的复制和表达。
基因工程原理讲义：目的基因的克隆
第九讲目的基因的克隆中国科学院遗传与发育生物学研究所2017年8月目录一、基因克隆的一般概念1．基因克隆定义2．“克隆”的不同含义3．基因克隆的过程4．DNA片段的产生与分离5．基因文库二、基因克隆与分离的实验策略1．物理策略2．生物策略3．克隆样品的选择4．基因文库库容测算三、cDNA基因克隆1．概述2．cDNA文库的构建3．低丰度mRNA之cDNA克隆4．稀少mRNA的cDNA克隆5．全长cDNA的合成6．cDNA克隆的优越性四、基因组DNA克隆1．cDNA克隆的局限性2．基因组DNA克隆的优越性3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆1．基因定位克隆概述2．RFLP分子标记3．RFLP作图原理与步骤4．染色体步移5．大尺度物理图谱的构建目的基因的克隆一、基因克隆的概念1．基因克隆的定义基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。
严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。
*要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。
因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。
*有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：a.DNA材料的选择与片段化；b.外源DNA片段与载体分子的连接；c.重组体分子的体外转化；d.转化子克隆的选择或筛选。
2．克隆的不同含义：(动词、名词与形容词)(1)“克隆”的三种含义*1.“克隆”一词作名词时，是指从一个共同的祖先经无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特定的生命群体；*2.“克隆”一词作动词时，则是指从同一祖先经无性繁殖产生这类遗传分子上同一的DNA分子、细胞群体或个体群体的过程；*3.“克隆”一词除了用作名词和动词之外，还可用作形容词使用，例如“克隆羊”(cloned sheep)中的“克隆”便是形容词，这是中文的一个有别于英文的地方。
基因克隆的原理和应用
基因克隆的原理和应用一、基因克隆的原理基因克隆是一种重要的分子生物学技术，它可以用来在体外制备大量的DNA 分子，并将其插入到宿主细胞中进行复制和表达。
基因克隆的原理主要包括以下几个步骤：1.选择目标基因：首先确定需要克隆的目标基因，这可以通过对生物学研究的需要来确定。
2.DNA提取和剪切：从源生物体中提取DNA，并使用限制性内切酶对DNA进行剪切。
限制性内切酶是一种能够识别特定核酸序列并剪切DNA链的酶。
3.载体的选择和制备：选择合适的载体，常用的载体包括质粒和噬菌体。
将目标基因插入载体中，并通过连接酶将其与载体连接。
连接酶可以将剪切的DNA片段与载体的末端互补序列连接起来。
4.转化和筛选：将构建好的重组载体转化到宿主细胞中，宿主细胞可以是细菌、酵母等。
然后通过筛选方法选出带有目标基因的克隆。
5.扩增和纯化：将成功筛选出来的克隆进行扩增，并使用DNA纯化技术提取目标基因。
二、基因克隆的应用基因克隆技术在生物科学研究、医学和工业生产等方面有着广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用领域：1. 生物科学研究•基因功能研究：通过基因克隆技术，可以将目标基因插入到其他生物体中，通过观察转基因生物的表型变化来研究这些基因在生物体中的功能。
•蛋白质表达：将目标基因插入到表达载体中，并将载体转化到大肠杆菌等表达系统中，可以大量表达蛋白质，并进行纯化和研究。
•基因组测序：通过克隆方法提取、扩增和纯化DNA片段，可以用于基因组测序或特定基因的测序。
2. 医学应用•基因治疗：将合成的基因导入到目标细胞中，通过修复或替代异常基因，治疗一些遗传性疾病。
•疫苗开发：通过克隆技术，可以制备重组疫苗，如乙型肝炎疫苗、人类乳腺癌疫苗等。
•药物研发：将目标基因插入到表达载体中，用于大规模表达药物靶点蛋白，以便进行药物筛选和药效评价。
3. 工业应用•农业：利用基因克隆技术进行作物遗传改良，提高作物产量、耐逆性等。
•能源生产：通过基因克隆技术改良生物质利用菌，提高生物质能源的产量和效率。
植物基因克隆实验指导讲义
植物基因克隆实验指导目录植物基因克隆实验规则 (2)实验一：试剂的配制.................. 错误！未定义书签。
实验二：植物总DNA的快速少量提取和浓度检测错误！未定义书签。
实验三：微卫星简单重复序列锚定PCR扩增技术（SSR-PCR） 8实验四：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测错误！未定义书签。
实验五：SSR标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析错误！未定义书签。
实验六：琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物.. 错误！未定义书签。
实验七：PCR产物的T/A克隆及重组子的筛选错误！未定义书签。
实验八：重组子的鉴定................ 错误！未定义书签。
实验论文例文........................ 错误！未定义书签。
植物基因克隆实验规则一、植物基因克隆实验课的目标根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。
整套实验围绕水稻根系发育突变体的基因克隆这一研究课题进行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。
我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。
该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科研基础。
二、实验的进行程序和要求1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。
基因工程原理基因克隆载体讲课文档
f：噬菌体DNA从寄主染色体 DNA上删除下来；
g：溶原性细胞按照正常速率分 裂。
第四十三页，共84页。
1. 与构建载体相关的λ噬菌体性质
基因按功能相近性聚集成簇： •左侧区：A-J，合成头尾蛋白的 全部基因 •中间区：J-N，非必要区，与重 组有关
•右侧区：N-R，DNA合成及 调控。
构建克隆载体的一般是非接合型质粒
第十六页，共84页。
6. 显性质粒和隐蔽质粒
显性质粒：能使宿主细胞表现出质粒所携带的性状。
如：
• 抗性质粒（R质粒），抗Amp（Ap)、抗Cmp（Cm)、 抗Kan（Km)、抗Tet（Tc)等
• 育性质粒（F质粒） • 降解质粒：降解农药
• Ti质粒：形成冠瘿瘤
隐蔽质粒：不会赋予宿主细胞新性状的质粒为隐性质粒。
4. TA载体
T T
A
A
第三十三页，共84页。
第三十四页，共84页。
5. 质粒表达载体
——表达载体是在克隆载体的基础上增加了表达元件构建而成的，在 受体细胞内能稳定维持并表达外源目的基因。
第三十五页，共84页。
lac启动子表达系统
第三十六页，共84页。
质粒表达载体
融合型表达载体 非融合型表达载体
（c）不能提供复制能力
（d）不能为外源基因提供表达能力
• 基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体 中只有（ a ）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体
（a）pSCl01
（b）pBR322 （c）pUBll0
（d）pUCl8
第三十一页，共84页。
第七次课结束！
第三十二页，共84页。
——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期，是必要 基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操作。
基因的克隆PPT课件
载体的种类
质粒
1.大肠杆菌质粒 2.革兰氏阳性菌的质粒
噬菌体 真核细胞为宿主的克隆载体
1.酵母为宿主的载体 2.植物细胞为宿主的载体 3.DNA病毒载体
反转录病毒载体
大肠杆菌的质粒
pBR322质粒：它是由4361个核苷酸组成，属于松弛型质粒， 可以用抗氨苄西林和抗四环素基因作为标记，具有多种常用 内切酶的切点。
基因表达产物的鉴定
基因表达：指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译 成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
研究基因表达的手段
1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质）
1、RT-PCR
基因的克隆 -----ＤＮＡ重组技术。
克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细 胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性 繁殖的单一原型细胞。
基因的克隆:用ＤＮＡ重组技术使一个基因或ＤＮＡ片 段产生出很多相同拷贝的过程。
基因克隆的技术路线的大体步骤
得出结论
步骤三： 步骤二： 步骤一：
多 克 隆 位 点
X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷
表示 外源 基因 插入 编码 半乳 糖苷 酶的 基因 区段
带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落
不对 能照 是目 培的 养基 基因 变本 色身
使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。
目的基因插入 到抗四环素基 因的位置，则 导入菌体后的 菌株则不能在 有四环素的培 养基上生长
第五章第五节基因克隆技术教学教材
5’ RACE
巢式PCR（nest PCR）：是指利用两套PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。 在第一轮扩增中，外引物用以产生扩 增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能 性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。 一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等 。
所有具有某种表现型的基因都可以通过该方 法克隆得到。
通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某 个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密 连锁的RFLP或RAPD分子标记。
通过对不同的生态型及限制性内切酶和杂交 探针的分析，找出与目的基因距离最近的分 子标记，通过染色体步移法将位于这两个标 记之间的基因片段克隆并分离出来，根据基 因功能互作原理鉴定目的基因。
染色体步移法克隆基因示意图
在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来 计算的，1cM（厘摩）相当于1%的重组率。 人类基因组中，1cM≈1000kb；拟南芥菜中 ，1cM≈290kb；小麦中，1cM≈3500kb。
用图位克 隆法获得 水稻脆杆 基因BC1
A. 将BCl定位于水稻3号染色体（Chr3）分 子标记C524a和RM16之间；
是由Frohman等(1988)发明的一项技术。是通过PCR进行cDN息。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过 往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。
一般分5’ RACE和3’RACE两种： 3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据 一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计) 和PolyT引物PCR即可。 5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。其一为加接头(传统)， 根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩 增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环再PCR。
基因克隆的基本理论和实验技术
ApaLI (1121)
EcoR I+Hind III切
EcoR I
Hind III
EcoR I Hind III PCR扩增
EcoR I
A
Hind III
A
EcoR I+Hind III切
EcoR I
Hind III
EcoR I Hind III
体现载体
根据体现目旳蛋白所使用开启子不同分为： 原核体现载体（原核开启子） 真核体现载体（真核开启子）
4：JM109 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时， 因为载体DNA产生旳LacZa多肽和JM09编码旳LacZΔM15进行α－互补，从而 显示β－半乳糖苷酶活性，由此很轻易鉴别重组体菌株。
5：BL21(DE3) 用于高效体现克隆于具有噬菌体T7开启子旳体现载体（如pET系列）旳基因。 T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21旳染色体上。该 菌适合体现非毒性蛋白。
GAATTC CTTGGA
EcoR I
G
AATTC
CTTGG
A
AAGCTT TTCGAA
Hind III
A
AGCTT
TTCGA
A
限制性核酸内切酶旳命名法则
限制性核酸内切酶旳命名：一般是以微生物属名旳第一种 字母和种名旳前两个字母构成，第四个字母表达菌株(品系)。 例如：EcoR I是从大肠杆菌Escherichia coli RY13 中第一种发 觉旳内切酶I 。
2. DEPC：DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活多种蛋白质， 是RNA酶旳强克制剂；DEPC是一种潜在旳致癌物质，在操作中应尽量在通风旳 条件下进行，并防止接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入旳毒性是最强旳， 使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗。
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回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Primer Premier 5
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
引物处理 Procedure
• 标记，Sense → F，Antise → R ，如“NS3 Sense BamH1”，记为“NS3-F-BamH1”
• 离心，使粉末在底部集聚，12000g，10min（注意是g，不是rpm）
1 预变性 2c 变性 3c 退火 4c 延伸 5 总延伸 6 冷却 总循环数
94℃ 2min 98℃ 10s X ℃ 30s* 68℃ 需计算* 68℃ 10min 16℃ 10min 30-40（from 2c to 4c）
B
* 退火温度计算：一般为上下游引物TM平均值—5℃
*延伸时间计算：
引物片段大小(bp值) 扩增速度(1000bp / 30s)
• 复制到Primer Premier 5 分析其酶切位点，选择共有的酶切位点
• 在目的基因合适的位置添加引物，并在引物前/后加上酶切位点
ori 是复制起点,他被宿主细胞识 别后才能在该细胞中复制。
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Primer Premier 5
引物设计
pCR
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
成分 灭菌dd H2O 10× KOD-plus-neo Buffer dNTPs（2mM）
MgSO4 Template Primer R（10μM） Primer F（10μM） KOD-plus-neo Polymease
Total
A
体积（μl） 33 5 5 3 1 1 1 1 50
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
pcDNA3.1 +3flag
重组质粒 pcDNA3.1+3flag-NS3
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
大肠杆菌(感受态)
酶切鉴定
载体 目的片段
实验流程
网上检索 引物设计
DNA制备
生物信息学 分析等
PCR扩增
扩增E.coli制备
转录
翻译
DNA
RNA
逆转录
蛋白质
基因克隆
• 基因克隆（gene cloning）或分子克隆，又称为重组DNA技术，是应 用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重 新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量 的子代DNA分子的过程。
• 目的：大量扩增目的基因，为下一步基因的功能研究做准备。
基因克隆原理及实验介绍
The principle and experiment of gene cloning
中药教研室
内容概要 • 实验进展汇报（5.10~8.24） • 基因克隆基本原理及实验操作
分子生物学
分子生物学是在分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其 规律的科学，其研究对象是核酸（DNA、RNA）和蛋白质等生物大分子， 其研究内容包括核酸和蛋白质等的结构、功能及其遗传信息和代谢信息传 递中的作用和作用规律。
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶具有网络结构，本身不带电荷。具有分子筛效应(凝胶色谱)与电泳效应。
• 目的：分离不同大小的核酸，以达到纯化、鉴定的目的。 • 原理：DNA分子迁移率与其大小成反比，电泳时
根据分子大小不同形成不同的条带 • 根据目的基因片段大小，配制不同浓度的凝胶
凝胶浓度 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
目的基因片段(bp) 1000-30000 800-12000 500-10000 400-7000 200-3000 50-2000
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Attention
• 琼脂糖凝胶可根据情况分成数小块（一般是每8孔）， 或插入孔径不同的梳子
• EB具有强致癌性，应在污染区操作
• 为保持凝胶成像仪与点样顺序一致，点样时应从右往 左点（靠近自己一段开始）
• Marker是已知大小的正对照DNA，电泳能分离出不同 条带，相当于尺子上的刻度，可以用来测算未知DNA 样品的大小。
• 红色为正极，黑色为负极，DNA 样品由负极往正极泳 动（靠近加样孔的一端为负)。
*凝胶成像仪的紫外灯对DNA有突变作用，应尽可能减少紫外灯对凝胶的照射
• 按照E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit(200)试剂盒说明书回收纯化DNA：
转化、培养
测序
PCR或 酶切鉴定
质粒提取
重组克隆 筛选
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
引物设计
• 从 GenBank 下载全基因组序列（complete genome），记录编号 保存各目的基因的序列（如NS1、NS2A、NS5、Cap、E等）
• 获取载体质粒的相关信息（抗性、标签、酶切位点）
，向上取整数（多预留延伸时间）
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Attention
• 试剂如不完全融化，会造成浓度不均，酶需冰上放置 • PCR管根据目的基因名称、日期、编号做标记 • 模板(Template)可根据浓度确定加入体积，缓冲液(Buffer)必须在酶之前加入。 • 注意不同引物对应不同PCR管 • PCR 结果优化略，详见《pCR常见问题解决方法》
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
E E Cap Cap Cap Cap 2B 2B 2A 2A NS1 NS1
2000bp
1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Procedure
• 打开紫外灯，在操作台上根据荧光位置切胶，动作要快并尽可能切小块，切出的凝胶 转移至1.5ml Ep 管里，称量凝胶重量
• 稀释，ddH2O按报告单储存浓度（100μM）的10倍量稀释至使用浓度10μM • 保存，分装-20℃
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Attention
• 离心时待离心机达到最高转速方可离开，防止不平衡造成损坏 • μM 是浓度单位，如100μM=100μmol/L • 引物稀释量向上取5倍整数，如383μl稀释至385μl