基因克隆原理及实验介绍上课讲义

• 复制到Primer Premier 5 分析其酶切位点，选择共有的酶切位点
• 在目的基因合适的位置添加引物，并在引物前/后加上酶切位点
ori 是复制起点,他被宿主细胞识 别后才能在该细胞中复制。
引物设计
pCR
回收纯化
双来自百度文库切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Primer Premier 5
引物设计
pCR
1 预变性 2c 变性 3c 退火 4c 延伸 5 总延伸 6 冷却 总循环数
94℃ 2min 98℃ 10s X ℃ 30s* 68℃ 需计算* 68℃ 10min 16℃ 10min 30-40（from 2c to 4c）
B
* 退火温度计算：一般为上下游引物TM平均值—5℃
*延伸时间计算：
引物片段大小(bp值) 扩增速度(1000bp / 30s)
*凝胶成像仪的紫外灯对DNA有突变作用，应尽可能减少紫外灯对凝胶的照射
• 按照E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit(200)试剂盒说明书回收纯化DNA：
，向上取整数（多预留延伸时间）
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Attention
• 试剂如不完全融化，会造成浓度不均，酶需冰上放置 • PCR管根据目的基因名称、日期、编号做标记 • 模板(Template)可根据浓度确定加入体积，缓冲液(Buffer)必须在酶之前加入。 • 注意不同引物对应不同PCR管 • PCR 结果优化略，详见《pCR常见问题解决方法》
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Primer Premier 5
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
引物处理 Procedure
• 标记，Sense → F，Antise → R ，如“NS3 Sense BamH1”，记为“NS3-F-BamH1”
• 离心，使粉末在底部集聚，12000g，10min（注意是g，不是rpm）
转化、培养
测序
PCR或 酶切鉴定
质粒提取
重组克隆 筛选
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
引物设计
• 从 GenBank 下载全基因组序列（complete genome），记录编号 保存各目的基因的序列（如NS1、NS2A、NS5、Cap、E等）
• 获取载体质粒的相关信息（抗性、标签、酶切位点）
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
E E Cap Cap Cap Cap 2B 2B 2A 2A NS1 NS1
2000bp
1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Procedure
• 打开紫外灯，在操作台上根据荧光位置切胶，动作要快并尽可能切小块，切出的凝胶 转移至1.5ml Ep 管里，称量凝胶重量
凝胶浓度 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
目的基因片段(bp) 1000-30000 800-12000 500-10000 400-7000 200-3000 50-2000
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Attention
• 琼脂糖凝胶可根据情况分成数小块（一般是每8孔）， 或插入孔径不同的梳子
转录
翻译
DNA
RNA
逆转录
蛋白质
基因克隆
• 基因克隆（gene cloning）或分子克隆，又称为重组DNA技术，是应 用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重 新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量 的子代DNA分子的过程。
• 目的：大量扩增目的基因，为下一步基因的功能研究做准备。
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
成分 灭菌dd H2O 10× KOD-plus-neo Buffer dNTPs（2mM）
MgSO4 Template Primer R（10μM） Primer F（10μM） KOD-plus-neo Polymease
Total
A
体积（μl） 33 5 5 3 1 1 1 1 50
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶具有网络结构，本身不带电荷。具有分子筛效应(凝胶色谱)与电泳效应。
• 目的：分离不同大小的核酸，以达到纯化、鉴定的目的。 • 原理：DNA分子迁移率与其大小成反比，电泳时
根据分子大小不同形成不同的条带 • 根据目的基因片段大小，配制不同浓度的凝胶
• 稀释，ddH2O按报告单储存浓度（100μM）的10倍量稀释至使用浓度10μM • 保存，分装-20℃
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Attention
• 离心时待离心机达到最高转速方可离开，防止不平衡造成损坏 • μM 是浓度单位，如100μM=100μmol/L • 引物稀释量向上取5倍整数，如383μl稀释至385μl
基因克隆原理及实验介绍
The principle and experiment of gene cloning
中药教研室
内容概要 • 实验进展汇报（5.10~8.24） • 基因克隆基本原理及实验操作
分子生物学
分子生物学是在分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其 规律的科学，其研究对象是核酸（DNA、RNA）和蛋白质等生物大分子， 其研究内容包括核酸和蛋白质等的结构、功能及其遗传信息和代谢信息传 递中的作用和作用规律。
• EB具有强致癌性，应在污染区操作
• 为保持凝胶成像仪与点样顺序一致，点样时应从右往 左点（靠近自己一段开始）
• Marker是已知大小的正对照DNA，电泳能分离出不同 条带，相当于尺子上的刻度，可以用来测算未知DNA 样品的大小。
• 红色为正极，黑色为负极，DNA 样品由负极往正极泳 动（靠近加样孔的一端为负)。
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
pcDNA3.1 +3flag
重组质粒 pcDNA3.1+3flag-NS3
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
大肠杆菌(感受态)
酶切鉴定
载体 目的片段
实验流程
网上检索 引物设计
DNA制备
生物信息学 分析等
PCR扩增
扩增产物 纯化
与克隆载体 连接
感受态 E.coli制备