第二十四章 血清学试验技术

三、 免疫标记技术
Ab + Ag 荧光素
Ab-Ag （含量低时不可见）
酶
放射性同位素 生物素-亲和素
SPA 胶体金
标记抗体或抗原，进行抗原抗体反应的一类技术。 用途： 对抗原或抗体进行定性、定量、定位
优点：灵敏度、特异性、精确性、应用范围等远超 一般血清学方法。
免疫标记技术包括：
荧光素标记抗体技术： FITC（异硫氰酸荧光素） 酶标记抗体技术：
第十节 免疫血清学技术
概念： 抗原与抗体在体内或体外均发生特异性结合反应，因为抗 体主要来自血清，在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血 清学技术。
一、 概述
按抗原抗体反应性质不同分为： 凝聚性反应：凝集试验、沉淀反应 标记抗体技术：荧光抗体、酶标抗体、生物素标记抗体、
同位素标记抗体、胶体金标记抗体技术等 有补体参与的反应：补体结合反应、免疫粘附血凝试验 中和反应：病毒中和试验、毒素中和试验 免疫转印（Western Blot）
胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不破坏其生物活 性，可以与蛋白质（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非共价结 合，形成胶体金标记物。
➢胶体金免疫层析试纸条的构成
样品垫
金标垫
硝酸纤维素膜
吸收垫
衬板
胶体金免疫层析试纸条类型：
➢GICA有三种反应模式：夹心法，间接法，竞争抑制法。 夹心法反应原理
免疫电泳技术
双向单扩散试验 双向双扩散试验
火箭电泳 对流电泳 免疫电泳
双向单扩散试验（定性、定量）
双向双扩散试验（定性、定量）
双向双扩散试验的用途
1、抗原、抗体相对含量测定 2、抗原、抗体相对分子量分析 3、抗原性质分析
抗原、抗体相对含量测定
抗原、抗体相对分子量分析
抗原分子量>抗体分子量
抗原分子量=抗体分子量
待检样品
凝集
待检样品
凝集抑制
2. 沉淀试验：
可溶性抗原（毒素、病毒、细菌裂解液）与相应抗体结合, 在电解质 存在情况下，产生可见的沉淀物。
（1）环状沉淀反应（定性） 小口径试管中进行，先加已知血清0.1 ml，然后轻轻加入等量抗原， 使形成二个界面，数分钟后，二个界面间形成乳白色的沉淀环。 如：炭疽环状沉淀反应
二、 凝聚性试验
1. 凝集反应: 细菌、红细胞等颗粒状抗原与相应抗血清在电解质存在下, 产生可见的颗粒凝集现象。
直接凝集试验： 颗粒性抗原 玻片法：鸡白痢玻片凝集（定性） 试管法：布氏杆菌试管凝集（定性、定量）
间接凝集试验：可溶性抗原（抗体）+ 载体
间接血凝试验：红细胞 猪瘟间接血凝试验
乳胶凝集试验：聚苯乙烯乳胶微球 猪伪狂犬病乳胶凝集试验
空白 对照
1
阴性 对照
2
阳性 对照
3
待测 样品
4
阴性 阴性 阳性 阳性
（2）酶标仪测定:
用酶标仪（450nm）测定各孔吸光度OD 值（先用空白孔校零），已知阳性血清 与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而 且已知阳性血清的OD值≥0.4；在上述条 件成立的情况下，如果待检血清与已知 阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待检 血清的OD值≥0.4，则判为阳性，否则判 为阴性。
HRP（辣根过氧化物酶），AP（碱性磷酸酶） 放射性同位素标记技术： 131I，32P 生物素-亲和素标记抗体技术 胶体金标记技术：胶体金
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
1、基本原理
是将抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙 烯微孔塑料板），再加酶标抗体或酶标抗 原和底物后，底物（ H2O2 和 邻苯二胺 OPD）被酶催化生成有色物质，一段时间 后加终止液（H2SO4 ）终止反应，其颜色 深浅与标记物中相应的抗体或抗原的含量 呈比例，由此可测定未知抗原或抗体。
畜牧兽医站, 商检 传染病（禽流感,链球菌等）
系统,边检口岸,农 牧类院系和研究所
病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等）
环境
环保监测部门,研究 有害物质超标 机构
食品安全 食品安全检测中心, 农兽药残留（磺胺类、瘦肉精等）,大肠
各监管部门
杆菌,黄曲霉素
胶体金
胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（goldsol），是金 盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。
胶体金免疫层析技术
20世纪80-90年代在酶联免疫吸附试验、 乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫 技术和新材料技术基础上发展了新型体外诊断 技 术 —— 胶 体 金 免 疫 层 析 技 术 （ colloidal gold immunochromatography assay, GICA）。
结果判定方法。 • 间接ELISA的一般操作过程。
B 阳性
C 阴性
血清学反应的应用
1. 抗原抗体的快速检测 2. 生物活性物质的超微定量 3. 抗原抗体在细胞和亚细胞水平定位 4. 微生物的鉴定与分析 5. 血型鉴定 6. 妊娠诊断，检测激素水平 7. 内分泌的研究 8. 遗传育种方面的应用
思考题
• 什么是血清学反应？ • 影响血清学反应的主要因素。 • ELISA的全称是什么？简述其原理及
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
2、分类 ➢ 间接法（Indirect ELISA）：
将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体
➢ 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：
将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原
（2）琼脂扩散试验： 琼脂是一种含有硫酸基的多糖体，高温时溶于水，冷却后凝固，形
成凝胶，呈多孔结构，充满水分，允许各种抗原抗体分子自由扩散。 二者于比例适当处相遇，发生沉淀，形成可见的沉淀带。
包括： 单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散 如：马立克氏病
法氏囊病的诊断
凝胶沉淀反应
免疫扩散技术
➢ 竞争法（Competitive ELISA) ：
将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原 或抗体
检测液相中的可溶性抗原或抗体
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
3、步骤（以间接ELISA为例）：
显色
4、结果判定
（1）肉眼观察 阳性：显色为黄色→棕色→褐色 阴性：无色
协同凝集试验：葡萄球菌A蛋白
SPA + Ab （IgG）
SPA-Ab + Ag
SPA-Ab-Ag
直接凝集反应
颗粒性抗原 凝集素
间接凝集反应
1、正向间接凝集反应 2、反向间接凝集反应 3、凝集抑制反应
正向间接凝集反应
载体பைடு நூலகம்粒
可溶性抗原
反向间接凝集反应
载体颗粒
抗体
可溶性抗原
间接凝集抑制反应 （检测抗原法）
类别
应用领域
检测的物质
人类医学 各 级 医 院 , 血 传染病（乙肝五项,HIV, SARS等）
站断商中检,CD心系C；统, 防家；疫庭边站自检,检口诊；标 白等志）物 （ AFP 、 肌 钙 蛋 白 、 粪 便 血 红 蛋
岸；公安系统.
女性妊娠 hCG(早孕)
毒品（吗啡,K粉,摇头丸,冰毒）
农牧业
抗原分子量<抗体分子量
抗原性质分析
（3）免疫电泳技术 琼脂双扩散与电泳技术结合而成。
包括：免疫电泳 对流免疫电泳 火箭电泳
Ag Ab
Ag Ab
_
+
对流免疫电泳
对流免疫电泳
火箭电泳
免疫电泳
免疫电泳技术的用途
对流免疫电泳——快速、半定量测定 火箭电泳——快速、定量测定 免疫电泳——抗原分析