第二章 培养基的准备与灭菌设备
实验二 培养基的配制和灭菌
实验二培养基的配制和灭菌一、实验目的微生物的生长发育都有一定的营养需要，培养基即人工培养微生物、为其生长发育提供所需营养的基质。
培养基配好后必须经过灭菌方能用于分离培养微生物试验，因此培养基的配制和灭菌是植物病理实验室中最基本的工作，通过本次实验学习植病实验室中常用培养基的配制方法和高压灭菌锅的使用方法。
二、内容、材料和方法(一)培养基的配制培养基按组成成分及对这些成分了解的程度分为天然培养基、半组合培养基和组合培养基三类，从物理性质上又分为液体培养基和固体培养基两类，培养基的种类不同，配制方法也有差异，限于时间，本次实验仅配制马铃薯琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
1马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）这是植病实验室最常用的培养基(简称PSA)，主要用于植物病原真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌。
成分：马铃薯200克蔗糖 10~20克琼脂 17~20克加水至1000毫升方法：将马铃薯洗净去皮切块，加水煮沸半小时，用双层纱布滤去薯块，补足水量，加入琼脂，加热熔化，再加糖，待完全化后，乘热用双层纱布过滤分装，塞好棉塞高压灭菌。
马铃薯蔗糖琼脂培养基略带酸性，培养真菌无需调节pH，培养细菌则调节pH至中性，此培养基留作下次实验分离培养病原真菌用，故不必调节pH。
5人分作一组，1、2组各作此培养基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约10毫升，灭菌后摆成斜面；其余300毫升，分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥善保存，留待下次实验使用。
2肉汁胨培养基（BPA）这种培养基主要用于细菌的分离和培养成分：牛肉浸膏 3克蛋白胨 5~10克蔗糖 10克酵母浸膏 1克琼脂 17~20克加水至 1000毫升方法：先将琼脂加热熔化于大部水中，再将其它各成分用少量水化开加入，调节pH至7，趁热用双层纱布过滤，分装，塞棉塞高压灭菌。
牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易称重，称重时用小烧杯盛装，以玻璃棒沾取，故要先称好杯和棒的重量后，再开始沾取浸膏称重，称后将杯和棒上粘着的浸膏洗净于锅中。
实验二.培养基的配制及灭菌
实验二培养基的配制及灭菌一、实验目的：1. 掌握常用培养基的制备方法；2. 了解培养基的成分、类型及特点；3. 学会玻璃仪器的洗涤和灭菌前的准备工作。
4.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程和分装方法。
二、实验原理人工配制的培养基是植物组织培养的营养基础，不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基对组织培养是至关重要的，一个完整的培养基配方应包含有无机盐、有机营养、水、植物生长调节剂、琼脂及其他成分。
培养基的主要成分的详细内容见课本p26~29。
为了省时和减少多次称量的误差，一般先将药品配制成浓缩一定倍数的母液，用时稀释，储存于冰箱低温（2~4摄氏度）中待用。
基本培养基有8中母液，即大量元素母液、微量元素母液、有机物母液、钙盐母液、铁盐母液、肌醇母液、镁元母液、生长调节物质母液，基本培养基的配制方法有两种：一是可以将培养基的每种成分配成单一化合物的母液，便于配制不同种类的基本培养基时使用；二是配成几种不同的混合液，这样在大量配制同一种培养基时更省时、省力。
在配制母液时应注意防止沉淀产生。
绝大多数生长调节物质不溶于水，可以加热并不断搅拌促使溶解，必要时加入稀酸或稀碱等物质促溶。
各类植物生长调节物质的用量极小,它们对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化起着重要和明显的调节作用。
通常使用的浓度单位是mg/L。
配制好的培养基应在24h之内完成灭菌工作，以免造成杂菌大量繁殖。
灭菌方法有：高温高压灭菌、过滤除菌、射线除菌等方法。
培养基常采取高压灭菌的方法，灭菌时间一般是在0.105MPa压力下，温度121摄氏度时，灭菌时间应根据容积的体积确定，所需最少时间见课本P32表2ˉ2。
培养基必需保证绝对无菌，否则因其营养丰富细菌、真菌极易滋生而导致植物死亡。
灭菌后的培养基不宜马上使用，以免造成培养材料的损失。
（一）、组成培养基的五类成分目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。
培养基的制备和灭菌设备
②.喷射加热－真空冷却连续灭菌流程
流程：喷射加热、管道维持、真空冷却
蒸汽
喷射加热器
真空
生培养液
❖培养基用泵打入喷射加
膨胀阀
热器与蒸汽混合升温
维持管
急聚蒸发室
❖进入管道维持器保温
一定时间
❖进入真空闪急蒸发室 冷却降温
灭菌好的培养液
图2-5 加热-真空冷却连续灭菌流程
膨胀阀 急聚蒸发室
❖ 真空冷却可能造成培养 基重新污染
灭菌好的培养液
图2-5 加热-真空冷却连续灭菌流程
③.板式换热连续灭菌流程 流程：薄板换热器加热、管道维持、薄板换
热器冷却
灭菌好的培养液
蒸汽
水冷 却段
热回 收段
加热 段
冷却水
生培养液
维持段
图2-6 薄板换热器连续灭菌流程
特点
❖ 在一台薄板换热器中完成培养液的预热、加热及 冷却三个过程
（二）灭菌方法
灭菌：射线灭菌、药物灭菌、热灭菌 分离：离心沉淀、介质过滤
（三）加热灭菌方式
培养基→加热升温→维持保温→冷却降温→发酵
分批灭菌：三个过程在一个设备内完成 连续灭菌：三个过程分别在不同的设备内完成
（四）灭菌要求
❖ 达到无菌程度 ❖ 尽量减少营养成分损失 ❖ 降低能量消耗
（五）理论灭菌时间
控制
缺点：需要专门设备，投资较大 设备较多，染菌机会也相应较多
2、要求
①.加热设备：加热均匀， 144℃ 20s 2-3min 20s 快速升温到灭菌温度
（温度一致）
②.维持设备：使培养基按
温 度
顺序流动，维持灭菌
温度达到灭菌时间
生化工程第二章 培养基灭菌
K平均＝
T1
T2
T1
二 章
式中的积分值可利用图解积分法求得，
培 养 基 灭 菌
生物工程专业课程
生 化 工 程 第 二 章 培 养 基 灭 菌
生物工程专业课程
生
化
工 程 第
T2 KdT
K平均＝
T1
T2
T1
二 章 培
0.128 0.0061S 1 394 373
养
基
灭
菌
生物工程专业课程
生
化 工 程
养 基 灭
这样对于不同 N0 的培养基，其灭菌时间不 同，即 t = t(N0).
菌
生物工程专业课程
生
化 工
根据
程
t 1 ln N0
第
KN
二 章
在给定的温度条件下，t 与 ln N0/N 呈直线 关系，其斜率为 1/K ；当 N0 给定后，t 决
培 定于 K ；K除了决定于菌体的种类及存在形
养 式外，还是温度的函数。 基
第 二
降温阶段：
章
培 养 基
ln N 2 A t3 eE RT dt
N
t2
灭
菌
生物工程专业课程
生 例1
化 工
有一发酵罐内装 40 m3 培养基、在 121 ℃ 温
程 度下进行实罐灭菌。原感染程度为每 1 mL
第 有 2 × l05 个耐热细菌芽抱，12l ℃ 时灭菌速 二 度常数为 1.8 min-1。求灭菌失败机率为
章 构致密，热不易透过；③游离水分少，蛋
培 白质含水量较营养细胞低。
养 在实际生产中，以相对热阻大的芽孢作为
基 灭
灭菌的依据。
菌
培养基的准备与消毒
培养基的准备与消毒培养基是微生物实验中必不可少的一项工具，它提供了微生物生长所需的营养和环境条件。
在进行微生物培养实验之前，正确的准备和消毒培养基可以确保实验结果的可靠性和准确性。
本文将详细介绍培养基的准备与消毒步骤。
1. 准备培养基的材料在准备培养基前，首先要准备好所需的材料。
常见的培养基主要包括蛋白胨培养基、营养琼脂培养基和血琼脂培养基等。
根据所需培养的微生物的特性和需要，选择合适的培养基。
蛋白胨培养基主要由蛋白胨、胆汁盐、碳水化合物等组成，提供细菌生长所需的营养物质。
营养琼脂培养基是一种含有琼脂的液态培养基，通过琼脂的凝胶化来提供微生物生长的支持。
血琼脂培养基在基础培养基的基础上添加了动物血液，可以用于培养血液相关病原微生物。
此外，还需要准备培养基的配制工具包括培养基试管、容器、量筒、平板等。
这些材料和工具在使用之前应进行高温高压灭菌处理。
2. 培养基的准备培养基的准备是一个关键的步骤，它决定了培养基的质量和适用性。
以下是一般培养基的准备方法：首先，按照所需培养基的配方，将所需的材料按比例称取并放入量筒或容器中。
注意，应将蛋白胨、琼脂等固体材料提前加入到蒸馏水中搅拌溶解。
接下来，用蒸馏水将试剂溶解至所需体积，摇匀混合，确保所有材料均匀分布。
然后，将混合好的培养基试剂瓶口用铝箔或棉塞密封，以防止污染。
最后，将培养基试剂瓶放入高压灭菌锅中，进行高温高压灭菌处理。
灭菌温度和时间应根据培养基的要求进行调整。
3. 培养基的消毒培养基的消毒是为了杀死其中的细菌和真菌，以防止培养基污染，保证实验结果的准确性。
首先，将预处理好的培养基培养瓶放入高压灭菌锅中，进行高温高压灭菌处理。
灭菌温度和时间应根据不同的细菌或真菌进行调整。
一般情况下，121摄氏度的高温压力灭菌30分钟是常用的处理方式。
接下来，将灭菌后的培养基瓶放置在消毒柜或超净台上，待其冷却到室温。
过程中，应避免直接接触瓶口，以防止重新污染。
在开始培养之前，应先进行培养基质量检测。
细菌培养基的制备灭菌及接种培养技术(共34张PPT)
2.半合成培
养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。
3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。
从培养基的物理状态可分为
1.
液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。
2.固体培养
基：在液体培养基中加入15～30g/L左右的琼脂。
3.半固体培养基：在液体培养基中加入3～5g/L左右的琼脂。
17
实验程序4
（培养基和玻璃器材的灭菌方法）
过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液 体物质（如维生素、 血清），一般可用细 菌过滤器进行除菌。
18
第二部分 细菌纯种分离、培养和接
种技术
目的要求
实验材料
实验程序
19
目的要求
掌握从环境中分离培养细菌的方法，从 而获得若干种细菌纯培养技能。 掌握几种接种技术。
注意：器物不能装得太满。 3. 接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示 温度为100℃时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微 带蓝色时关闭排气阀。
14
实验程序4
（培养基和玻璃器材等的灭菌） 22) ，延长时间。
6. 灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开 排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水 。 7. 待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h，若无菌生长 则放入冰箱或阴凉处保存备用。
④ 取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上，倒置于30℃培养24～48h，然后观察结果。
其它：接种环、酒精灯、恒温箱。 实验程序4
（培养基和玻璃器材等的灭菌）
① 取10套无菌培养皿编号， 10－4、10－5、10－6各3个，另一个为空气对照。
第二章_培养基灭菌1
不同种的微生物的热死 灭反应的△E各不相同， 对于某种微生物，在一 定的T下作灭菌实验， 求得相应的K值 ，按lnK——1/T作图， 从直线的斜率可求出△E。
微生物的热死灭动力学
（2）K、△E、T三者之间的关系
K=f(△E、T) K A e 一定温度下，对特定的菌体来说△E是定值，那么 在热灭菌过程中能控制的因素是什么： 温度 T 那么温度高一些灭菌好呢？还是温度低一些好 呢？ （这是要讨论解决的问题） 从式子ln K = - △E /RT + ln A来看，T升高，K增大 灭菌的目的：有效杀灭杂菌，同时尽可能降低对营养 的破坏程度。 对培养基进行灭菌，培养基中营养物质和微生物的△E 不同。 K增大的幅度还取决于△E 。
例：
嗜热脂肪芽胞杆菌孢子 和 维 生 素 B1 的 热 处 理 数 据 （一定 T 下， ln(N/N0 ) = - K t ），就不同的 T，求 得前者的比热死亡速率常数 KBS 和后者的比破坏速率常 数 KVB， 按 lnK——1/T 标 会 ， 得图，由图算出： • △EBS=67000×4.184 J/mol • △EVB=22000×4.184 J/mol • ln K = - △E /RT + ln A
微生物的热死灭动力学
K除了决定于菌体的种类或存在的方式以外，更 重要的是温度 T 对 K 的影响，这是热灭菌工程设计 中的核心问题。（在什么温度下灭菌好？） K随着温度的变化而变化。研究结果表明，温度 和菌种与K的关系可用阿伦尼乌斯方程来表示：
K A e
E / RT
式中 A：频率因子，min-1 △E：菌体死灭反应活化能，J/mol R：气体常数 8.28J/mol· K T：绝对温度
进行培养基灭菌的操作方式 • 分批（间歇）灭菌 • 连续灭菌
实验二 培养基的配制及器材的灭菌
实验二培养基的配制及器材的灭菌（3课时）一、实验目的要求1、进一步学习并熟练培养基的制备的方法、步骤和技术。
2、进一步学习和掌握高压蒸汽灭菌的具体操作方法和技术。
3、为下一次实验做好实验前的准备。
二、原理培养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，它是进行科学研究，生产微生物制品及应用等方面的基础。
由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多，要根据培养目的和检测需要不同，选择配制不同的培养基。
从培养基的用途来区分，培养基可分为选择培养基、增殖培养基、鉴别培养基等。
●选择培养基在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。
如链霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生长；而制霉菌素、灰黄霉素等能抑制真核微生物的生长；结晶紫能抑制革兰氏阳性细菌的生长等。
●增殖培养基在自然界中，不同种的微生物常生活在一起，为了分离我们所需要的微生物，在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基，这种培养基常用于菌种筛选和选择增菌中。
在某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培养基。
●鉴别培养基在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。
这样的培养基称之为鉴别培养基。
例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。
有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。
例如食品检验中常用的麦康凯培养基是一例。
它含有胆盐、乳糖和中性红。
胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。
灭菌原理：高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
培养基和培养皿的灭菌方法
培养基和培养皿的灭菌方法一、前言在微生物学和生物学实验中，培养基和培养皿的灭菌是非常重要的步骤。
如果没有彻底灭菌，会导致实验结果不准确甚至失败。
因此，本文将介绍培养基和培养皿的灭菌方法。
二、材料准备1. 培养基：选择合适的培养基，根据需要添加相应的试剂。
2. 培养皿：选择合适的大小和形状，根据需要选择不同种类的培养皿。
3. 灭菌设备：可以使用高压蒸汽灭菌器、紫外线灯或者烘箱等设备进行灭菌。
4. 灭菌液：可以使用75%乙醇或者84消毒液等消毒液进行表面消毒。
5. 其他材料：酒精棉球、无尘纸巾等。
三、高压蒸汽灭菌法1. 准备好要灭菌的培养基和培养皿，并放入高压蒸汽灭菌器中。
2. 根据设备说明书设置温度和时间，一般为121℃，15-20分钟。
3. 开始启动高压蒸汽灭菌器，等待灭菌完成。
4. 灭菌完成后，关闭高压蒸汽灭菌器，等待冷却。
5. 取出培养基和培养皿，注意不要碰触到未消毒的表面。
6. 使用酒精棉球擦拭外部表面，避免污染。
四、紫外线灭菌法1. 准备好要灭菌的培养基和培养皿，并放入紫外线灯下。
2. 打开紫外线灯，照射15-30分钟。
3. 灭菌完成后，关闭紫外线灯。
4. 取出培养基和培养皿，注意不要碰触到未消毒的表面。
5. 使用酒精棉球擦拭外部表面，避免污染。
五、烘箱灭菌法1. 准备好要灭菌的培养基和培养皿，并放入烘箱中。
2. 根据需要设置温度和时间。
一般为160℃，2小时或180℃，1小时。
3. 开始启动烘箱，等待灭菌完成。
4. 灭菌完成后，关闭烘箱并等待冷却。
5. 取出培养基和培养皿，注意不要碰触到未消毒的表面。
6. 使用酒精棉球擦拭外部表面，避免污染。
六、表面消毒法1. 准备好要灭菌的培养基和培养皿。
2. 使用酒精棉球或者喷雾器喷洒75%乙醇或84消毒液等消毒液进行表面消毒。
3. 等待消毒液挥发干燥后，即可使用。
七、注意事项1. 在进行灭菌前，必须确保培养基和培养皿的外部表面已经清洁干净。
2. 在进行灭菌时，必须按照设备说明书上的要求设置温度和时间，并确保设备正常运行。
植物组织培养实验室的组成、仪器设备及基本操作
3、不耐高温材料的灭菌：
采用过滤灭菌，如IAA、ZT、天然有机 添加物等。
4、外植体的表面灭菌：
采用70－75％乙醇（10-30秒）、有 效氯1％的次氯酸钠（5-30分钟）、0.1 －0.2%的氯化汞（2-15分钟）等杀菌剂 中加入几滴吐温－20或80（Tween－20 或80）效果较好。
（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙 醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。
2、培养基灭菌：
采用高压蒸汽灭菌。120℃ 15－20 分钟。
培养基体积越大，灭菌时间越长。
高温高压灭菌对培养基成分的影响： a.pH值普遍下降。 b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反
应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生 磷酸钙沉淀。
166
MgSO4·7H2O
185
KH2PO4
400
(NH4)2SO4
463
KI
0.8
H3BO3
1.6
MnSO4·4H2O
4.4
ZnSO4·7H2O
1.5
组成成分 Na2－EDTA FeSO4·7H2O 蔗糖
pH
烟酸 盐酸吡哆醇 甘氨酸 盐酸硫铵
(mg/l) 37.3 27.8 50 5.8 0.5 0.5 2.0 1.0
大量元素中的氮通常采用硝态氮 或铵态氮，但铵态氮浓度过高会对 有些植物的培养物造成伤害，不适 宜使用过高的浓度，可以用谷氨酸、 丝氨酸等来代替。
2、微量元素：
植物组织的对其需要量极少，过多会产生毒害，如 造成蛋白质变性、酶失活,代谢障碍等。
各种微量元素均具有特定的生理功能，如硼与蛋白 质的合成及糖类的运输有关；铜能促进离体根的形成； 锰参与植物的光合作用和呼吸作用；钼为氮素代谢的 重要元素。
培养基准备与培养基灭菌的设备
培养基准备与培养基灭菌的设备引言在微生物学、生物学实验中，培养基是一种基础性的工具，用于培养细菌、真菌等微生物。
为了确保培养基的质量，必须严格遵守一定的操作程序，并使用适当的设备进行培养基的准备和灭菌。
本文将介绍培养基准备与培养基灭菌的设备，以及它们的使用方法。
培养基准备设备秤量仪器在培养基的制备过程中，需要精确地称量不同的成分。
常用的秤量仪器有：•电子天平：精确称量各种粉末、液体等成分。
•药匙：适用于称量较大颗粒的固体成分。
•称量瓶：常用于称量固体成分，集成了容器和秤量功能。
筛网与漏斗在称量固体成分时，有时会出现颗粒聚结的情况。
为了消除聚结，可以使用筛网将固体成分过筛。
常用的筛网孔径为0.5mm至1mm。
漏斗则用于将固体成分流入培养基容器中，避免洒落。
搅拌设备搅拌设备主要用于混合培养基的各种成分，确保培养基均匀。
常用的搅拌设备包括：•磁力搅拌器：将磁子放入培养基容器中，通过磁场的作用使培养基不断搅拌。
•搅拌棒：手动搅拌培养基，适用于小规模的制备。
培养基灭菌设备为了防止培养基被外界的微生物污染，必须对培养基进行灭菌处理。
常用的培养基灭菌设备包括：高压灭菌器高压灭菌器是使用高温和高压来灭菌的设备。
其工作原理是将培养基容器放入高压灭菌器中，然后进行加热并提高压力，达到杀灭微生物的目的。
高压灭菌器广泛应用于实验室和工业中，能够保证灭菌效果的同时不破坏培养基的成分。
紫外线灭菌器紫外线灭菌器是一种使用紫外线辐射来杀灭微生物的设备。
其工作原理是将培养基容器放入紫外线灭菌器中，并进行一定时间的辐射。
这种设备适用于一些比较小型和易受热的培养基。
设备使用方法培养基准备设备的使用方法1.使用秤量仪器准确称量所需的固体和液体成分，并将其放入培养基容器中。
2.如有需要，使用筛网将固体成分过筛，以消除颗粒聚结。
3.使用搅拌设备将培养基的各种成分充分混合，直至得到均匀的培养基溶液。
培养基灭菌设备的使用方法1.将制备好的培养基容器放入高压灭菌器中，并按照设备说明书设置好温度和压力。
培养基的制备与灭菌
培养基的制备与灭菌1. 前言在微生物学和生物实验中，培养基作为微生物生长的基础和载体起到了至关重要的作用，因而它的质量和制备过程显得尤为重要。
本文将介绍培养基的制备与灭菌，旨在为读者提供一些帮助和参考。
2. 培养基的制备培养基的制备需要注意的是材料和配方的准确性和环境卫生的保证。
2.1 材料与仪器•试剂、培养基成分•纯净水•称量器具（称量皿、电子天平）•烧杯、棒子等常规实验仪器•玻璃仪器（试管、培养皿等）•分液漏斗、滤纸、滤膜•火源（酒精灯、燃气炬等）2.2 制备流程1.准备培养基的配方首先，需根据培养菌的要求和实验目的精准配制培养基。
要使用高纯度的试剂，避免杂质的干扰。
2.称量、倒量利用称量皿和电子天平精准的称量各种试剂，比如：氨基酸、盐酸、氢氧化钠等。
按照一定的顺序，向烧杯中慢慢地加入每一种试剂，倒入固定量的纯净水，搅拌，使溶液均匀。
3.混合、调PH值得到每种成分的溶液后，冷却并混合每种成分的溶液，盂内笛声触目激动 (pH Meter Calibration by Fattyd58, 免费使用).调整pH 值，使其达到正确的值。
4.灭菌将混合好的培养基倒入试管、培养皿中，使用微量注射器，将培养基填充至需要的培养皿内。
然后使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌。
灭菌时间和温度以及一些细节部分操作灵活处理即可。
5.保存灭菌后离火并放置冰箱内，保持冷藏状态。
开封后，最好在 1-2周内使用完成。
3. 培养基的灭菌在实验中，灭菌至关重要，可以有效去除细菌、霉菌等污染物，保证培养基的纯度和实验的成功。
3.1 灭菌方法常见的灭菌方法有：高温高压法、滤过法和辐射法。
其中高温高压法是最普遍也是最常用的灭菌方式。
3.2 操作步骤1.洗涤器皿将试管、培养皿等器皿用清洁刷和流动水清洗干净，在滤器芯中装入过滤棉花。
2.分配培养基用微量注射器等方法将分配好的培养基填充到需要的器皿中。
3.高温高压灭菌将器皿密闭，放入高压锅或者高压蒸汽灭菌器内，进行高温高压灭菌。
细胞工程第二章 细胞工程实验室组成及无菌操作技术
实验过程中，实验人员应按照无菌操作规程操作。 4、使用完毕，应擦净工作台面。
2、高压蒸气灭菌锅
用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。
(1)高压蒸气灭菌锅工作原理： 在密闭的蒸锅内，0.1MPa的压力下，
主要设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、培养箱、紫外光源 等。
二、基本设备及使用
1、接种设备：无菌超净工作台 用于培养材料的消毒及接种。使用前，
将超净工作台上面的排风和杀菌按钮开启， 灭菌15min后，关闭杀菌按钮，打开照明 按钮，即可在上面进行操作。
超净工作台
超净工作台使用注意事项
1、使用超净工作台前，应提前开机并开启紫外灭菌灯30分钟以上。 2、使用超净工作台时，关闭紫外灭菌灯，开启日光灯，并用
光 学 显 微 镜
倒置显微镜
分注器
血球计数器
磁力搅拌器
移液器
8、其它辅助设备
①培养基灌装机及洗瓶机
②空调机：用于接种 室和培养室温度的控 制。
③ 除湿机：使培 养室的湿度保持在
定的范围内。
⑤冰箱：用于在常温下易变 性或失效的试剂和母液的储 藏，细胞组织和试验材料的 冷冻保藏，以及某些材料的 预处理。
③高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单
位。因此，调PH值时，可适当调高0.1－0.3个单 位。
④接通电源前一定要加入足量的水。
3、相关仪器
电炉
推车
酒精灯
封口膜
接种器具
灭菌器
培养瓶
4、接种工具
酒精灯 接种针 镊子 解剖刀
5、培养设备
实验培养基的配制和高压蒸汽灭菌
实验培养基的配制和高压蒸汽灭菌实验培养基是用于细菌和真菌培养的基础营养物质，因此正确的配制非常重要。
以下是制备常用实验培养基的步骤：步骤一：准备所需物品制备实验培养基需要准备以下物品：蒸馏水、琼脂、培养基粉、容量瓶、量筒、移液器、电子天平、分注器和自动减压器等。
步骤二：称量培养基粉按照配方要求的比例，将所需的培养基粉称量到电子天平上。
步骤三：加入蒸馏水将所称的培养基粉倒入容量瓶中，加入适量的蒸馏水，用量筒测量，确保容量瓶内液面高度与标定线相同。
步骤四：加热和溶解将容量瓶放入热水浴中，加热并时不时地摇晃瓶子，直至培养基粉溶解。
需要注意的是，加热过程中不要让液面触及容量瓶的瓶口。
步骤五：加入琼脂在溶解后的基础培养液中加入琼脂，同时继续加热摇晃，直至琼脂完全溶解。
步骤六：分装和灭菌用分注器将培养基分装到适当的培养皿或者试管中，然后进行高压蒸汽灭菌。
高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌是常见的灭菌方法之一，适用于实验室内部的灭菌。
以下是具体步骤：准备好高压蒸汽灭菌器、灭菌袋、杀菌指示剂及所需灭菌物。
将需要灭菌的物品装在灭菌袋中，并将袋口完全折叠，保证袋口不漏气。
步骤三：使用杀菌指示剂将杀菌指示剂放入每个灭菌袋中，以检查灭菌效果。
使用的杀菌指示剂需要在使用前进行验证。
步骤四：放入灭菌器将装有灭菌物和杀菌指示剂的灭菌袋放入灭菌器中。
往灭菌器中加入适量的蒸馏水，然后加热，使压力升至1.05-1.10兆帕（MPa），并保持该温度和压力约25分钟。
步骤六：降压冷却灭菌完成后，需要断电并降压冷却，然后进行取出和验证灭菌效果。
需要注意的是，在高压蒸汽灭菌过程中，要避免过度充填或过度紧密的装包，以确保封闭良好且气体能够流通。
同时，不同的灭菌器和袋子可能有不同的要求，使用前需仔细阅读说明书，按照指示进行操作。
培养基的配制和灭菌实验报告（共8篇）
培养基的配制和灭菌实验报告(共8篇) 培养基的制备与灭菌实验报告(详细)一、实验题目：培养基的制备与灭菌二、实验目的：1、明确培养基的配置原则，掌握配置方法。
2、了解灭菌的原理，学习掌握灭菌器的使用方法。
三、实验器材：1、药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水、琼脂。
2、仪器：三角瓶、培养皿、试管、线绳、棉花、烧杯、报纸、移液管、试管架、铁针、量筒。
四、实验原理：1、培养基的制备包括一下几种成分：（1）水分：主要成分。
（2）N源：包括无机氮和有机氮。
（3）C源：主要是含碳有机物、碳氢化合物等。
（4）无机盐：如NaCl、KH2PO4等。
微量元素：Cu、K、Mg、S、P、Zn。
有些还需要添加“生长因子”，通常是维生素类、某些氨基酸或核酸等。
2、培养基配置的原则根据不同的培养对象及培养目的，选用不同的培养基，但有机物总量不得超过15%，盐类一般不超过1%。
培养基有以下分类：按成分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基按状态：固体培养基、半固体培养基、液体培养基按用途：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基培养基配好后应立即灭菌，防止营养物质中的微生物富集。
3、灭菌：用理化手段杀灭一切微生物的营养体，包括芽孢和孢子，在实验中应对所有仪器、操作场所、药品及培养基灭菌或消毒。
（1）高压蒸汽灭菌：将物品放入封闭的加压灭菌器，加热使灭菌锅套间的水沸腾产生蒸汽，将冷空气排尽，压力上升，使水沸点变高，导致菌体蛋白质变性，一般0.1MPa、121℃、15~30min 可以彻底灭菌，本次实验灭菌20min。
若是含糖培养基，110℃、30min。
（2）干热灭菌：微生物细胞内蛋白质因高温而凝固变性。
因高温，所以含水量小，不利于蛋白质受热变性，所以温度高，时间长。
（3）紫外灭菌：诱导胸腺嘧啶二聚体形成抑制DNA复制。
（4）过滤除菌：实验室中用微孔滤膜（孔径一般为0.22μm）。
除病菌需更小。
五、实验步骤：1、牛肉膏蛋白胨培养基的制备依次准确称取0.5g牛肉粉、1.0g蛋白胨、0.5gNaCl放入烧杯，加入100mL水，用玻璃棒搅匀溶解，移入三角瓶，并加入1.5g琼脂。
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图2-21 锥形蒸煮锅 1-加料口 2-排汽阀 3-锅耳 4-取样器 5-加热蒸汽管 6-排醪管 7-衬套 8-压力表
第三节 纤维素和半纤维素的水解
可以利用的生物质资源很多，包括各种农业残余 物 、林业残余物、专门栽培的作物以及各种废弃物。 这些木质纤维材料完全可望将它们降解转化为糖类， 并生物加工成有用的物质，如生物能源等。 一、蒸汽爆裂法 二、稀酸预处理法 三、酸酶水解法
一、糖蜜稀释器
二、糖蜜原料的澄清
一、糖蜜稀释器
1. 水平式糖蜜连续稀释器 为圆筒形水平管子沿管长装臵若干隔板和筛板，分成 若干部分。为了使糖蜜与水很好地混合，隔板上的孔 上下交错地配臵，以改变糖液流动形式。隔板上的孔 径要保证液体在稀释器内湍流流动。隔板固定在两根 水平杆上，能与杆一起装卸，以便清理，并可以从管 子中取出来。为使糖蜜容易流出，稀释器安装时，通 常出口的一端向下倾斜。这种稀释器的混合效果较好， 没有搅拌器，节省动力。 该器装有供应热水、营养盐类、冷水和酒精液体的连 接管。
二、间歇蒸煮糖化
间歇糖化法在整个糖化过程中主要有前冷却、糖化、 后冷却以及将糖醪送入发酵罐等操作，间歇糖化的生 产操作是在一个具有搅拌和冷却装臵的糖化锅内完成 的。 间歇糖化法的工艺流程：蒸煮醪→糖化锅＋加水 ＋冷却（120℃至60℃）＋加酸十加曲十糖化十冷却 （60至30℃）→发酵罐（或酒母罐）
2. 稀酸水解的几种常用方法
纤维原料稀酸水解
稀酸加压水解
稀酸常压水解
固 定 水 解 法
分 段 水 解 法
渗 滤 水 解 法
3. 稀酸水解生产流程和设备
三、酸酶水解法
蔗渣 预处理 爆破膨化（或碱煮）
内切木聚糖酶
酶解反应器
低聚木糖液
清净
真空浓缩
低聚木糖浆
酶解渣
多级串联水解
六碳糖液
连续发酵酒精
酸
水解残渣（燃料、肥料或填料）
灭菌好的培养液 蒸汽
水冷 却段
热回 收段
加热 段
维持段 冷却水 生培养液 图2-6 薄板换热器连续灭菌流程
分批灭菌过程与设备
全过程包括升温、保温、降温三个过程。
出 气 口 排气 消沫剂管 排气
排 进 气 料 接 口 种 管 排气 进 汽
进汽 冷却水出口
进气管
进汽 取 样 管
冷 凝 水
进汽 排 料 管
粗馏
精馏
脱水
无水ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ精
两段水解的第一段为半纤维素水解，方法有化学或
微生物或物理方法。第一段制低聚木糖方法是：蔗 髓（即蔗渣糠）等半纤维素降解有采用热水蒸煮、 酸水解、微波降解和酶解等方法。采用蒸汽膨胀爆 破方法
方法是将蔗髓裂解后用热水或稀酸浸泡获木聚糖液，
然后加入能分泌内切木聚糖酶的微生物培养液将木 聚糖降解为木二糖和木三糖。
培养基连续灭菌 培养基湿罐灭菌 把发酵罐先灭菌好，
将培养基在发酵罐 外采用高效设备连 续不断地进行加热， 保温灭菌和冷却， 然后连续进入已灭 菌好的发酵罐里。
常用的灭菌方法
化学灭菌 采用化学试剂进行灭菌 射线灭菌 用紫外线、高能量的电磁 波或粒子辐射进行灭菌
灭菌方法
干热灭菌 用160℃，保温1-2h 湿热灭菌 用高压蒸汽对物料或设备 容器灭菌 过滤灭菌 用微孔0.22滤膜过滤截留微生物
二、稀酸预处理法
优点：稀酸处理既对纤维物料进行预处理，又可以得
到半纤维素水解的糖液。
缺点：糖的得率较低，能量消耗较大（因为要在高温
高压下进行）和仍需要耐酸材料（比浓酸要好些）。
过程：第一阶段在较温和的条件下（100℃）左右进
行，使半纤维素分解，所得半纤维素水解液可用来生 产SCP或酒精等产品。剩下的物料进入第二阶段水解， 即在较强烈的条件下进行纤维素分解。
2. 喷射加热-真空冷却流程
培养基用泵打入喷射加热器，以较高速度自喷嘴 喷出，借高速流体的抽吸作用与蒸汽混合后进入 管道维持器，经一定维持时间后通过一膨胀阀进 入真空闪急蒸发室，因真空作用使水分急骤蒸发 而冷却到70-80℃左右，再进入发酵罐冷却到接种 温度。
蒸汽 喷射加热器 生培养液 膨胀阀 维持管 急聚蒸发室 真空
1.影响酸水解的因素
原料的种类和粉碎度
原料和酸的接触面越大，水解效果越理想。 酸的种类和用量 盐酸催化能力较强，但价格较高，腐蚀性也强。所 以工业生产上往往使用粗硫酸作为水解用酸。 液比系数 水解时液体和纤维素原料的比例叫液比系数。 水解时间和温度 温度越高，纤维素酸水解的速度越快。但是已生成 的单糖的分解速度也越快。
4．真空冷却器
真空冷却指的是醪液在一定的真空度下（即醪 液进入负压状态）醪液本身产生大量蒸气（二 次蒸气），并被抽出，这样便消耗了醪液大量 的热量，因而醪液很快冷到与真空度相应的温 度，这种醪液冷却法就称为真空冷却。
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真空冷却器器身为圆筒锥 底，醪液由切线方向进入， 顶中心有二次蒸汽排出口， 连接膜式塔，用冷水在膜 料液 式塔中冷凝二次蒸汽，不 凝性气体经真空泵或蒸汽 喷射器抽走，造成器内真 空。
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无菌 压缩 空气 2 糊化醪
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糖 化 醪
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图2-19 连续糖化罐 糊化醪进管 2-水和液体曲或曲乳或糖化酶进入 3-无菌压缩空气管 4-人孔 5-温度计测温口 6-杀菌蒸汽进口管 7-糖化醪出口 8-搅拌器
b A 2 3 c 8 9 1 4 e f d
a
g 图2-20 真空糖化装置 a 汽液分离器（最后 个后热器）b-糖化曲液计量罐 c-真空糖化罐 d-冷凝器 e-三级真空冷却器 f-三级冷凝器 g-糖化醪泵 1，2，8-阀 3，4，6，7，9-控制阀及管 5-测温管
第四节 糖蜜原料的稀释与澄清
糖蜜是一种非结晶糖分，因其本身就含有相当数量 的可发酵性糖，无需糖化，因此是微生物工业大规 模发酵生产酒精、甘油、丙酮丁醇、柠檬酸、谷氨 酸、食用酵母及液态饲料等的良好原料。由于原糖 蜜的浓度一般都在80°Bx以上，胶体物质与灰分多， 产酸细菌多，所以糖蜜酒精发酵前需进行稀释、酸 化、灭菌、澄清等处理过程。
冲子
热压器
沸腾器
水份控制器 同轴喷 射器
控制点
收料器
喷射器进料处
排阀器
图2-27 蔗渣蒸汽裂解膨化流程示意图
提取木聚糖后的酶解渣用化学法进行第二段水解， 目的使纤维素降解成葡萄糖。方法是将酶解渣加 酸放入立式蒸煮锅中，在6～8公斤压力下蒸煮， 硫酸用量是干渣（酶解渣干固物）的3～5%，因 此液比约1∶5，蒸煮水解时间50～60分钟，水解 液得糖率是纤维素应得糖的40%左右。
第二章 生物细胞培养基制 备过程与设备
1、液体培养基的灭菌 2、淀粉质原料的蒸煮与糖化 3、纤维素和半纤维素的水解 4、糖蜜原料的稀释与澄清 5、啤酒生产中麦芽汁的制备设备 6、固体培养基制备
第一节 液体培养基的灭菌
灭菌是利用物理或化学方法杀灭或 除去物料及设备中生物体的过程。
培养基分批灭菌
将培养基配制在发 酵罐里，用蒸汽直 接加热，以达到预 定灭菌温度并保温 维持一段时间，然 后冷却到发酵温度。
2．柱式连续蒸煮设备
特点是高温快速蒸煮，预热后的粉浆经泵送入加热器， 被高压蒸汽从相对方向喷射进行瞬间高温蒸煮，然后流 入缓冲器，再均匀地流入后面几根柱子内，在一定温度 下继续蒸煮。第一根柱子内装有锐孔，第二根柱子内装 有挡板，料液经过锐孔和挡板缺口时，流速增快，压力 发生骤变，原料细胞膜突然膨胀而部分破裂，细胞内容 物流出，得到充分蒸煮。但柱子容积不大，料液在里面 维持的时间不长，为使原料的淀粉糊化，一般在柱子后 面再连接1~2个后熟器，使料液在一定温度下继续维持 一定时间，保证淀粉糊化比较彻底。
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4 1 2 图2-15 柱式连续蒸煮流程图 1-粉浆罐 2-泵 3-加热器 4-缓冲器 5-柱子 6-后熟器
粉 浆
（1）加热器
加热器是利用高压蒸汽加 蒸汽 热粉浆，使汽液相对喷射， 紧密接触，能在短时间内 蒸汽 达到较高的温度。 高压蒸汽从内、外层管进 入，穿过小孔向粉浆液流 两旁喷射，由于高压蒸汽 从侧喷射，接触均匀，加 热比较全面，故能在很短 时间就达到蒸煮温度 145℃-150℃。
灭菌好的培养液
图2-5 加热-真空冷却连续灭菌流程
3. 板式换热器灭菌流程
采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，培养 液在设备中同时完成预热、灭菌及冷却过程，蒸汽加 热段使培养液的温度升高，经维持段保温一段时间， 然后在薄板换热器的另一段冷却，从而使培养基的预 热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。
一、蒸汽爆裂法
向装有植物纤维物质的压力罐通入高压蒸汽，使罐温 度达到200-240℃左右，原料中的半纤维素会迅速分 解释放出有机酸，发生自水解作用而可溶化。细胞间 的木质素熔化，并发生部分降解，变得易为热水、有 机溶剂或稀碱抽提。加上突然减压爆碎的机械分离作 用，使植物细胞间质或细胞壁变疏松，细胞游离，纤 维素的可酶解性明显增强。蒸汽爆碎技术的成败在于 精确控制处理强度（蒸汽温度和处理时间）和处理的 均匀度。控制不当，半纤维素等未充分降解或降解产 生的单糖被进一步降解破坏，得糖率往往会低于理论 值的65% 。
二、常用的连续灭菌流程
1.连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程 配好的培养基用泵打入连消塔与蒸汽直接 混合，达到灭菌温度后进入维持罐，维持一 定时间后经喷淋冷却器冷却至一定温度后进 入发酵罐。
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图2-4 连续灭菌设备流程示意图 1-配料罐（拌料罐）2-蒸汽入口 3-连消塔 4-维持罐 5-培养基出口 6-喷淋冷却 7-冷却水
热水
营养 酒精 盐类 液体