ELISA方法确定制备抗体效价的标准操作规程
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用于检测抗原或抗体的免疫学实验方法。
本文旨在提供一份标准的ELISA操作规程，以确保实验的准确性和可重复性。
二、材料和试剂准备1. ELISA板：96孔板，具有高吸附性能。
2. 样品：待测物质的纯化样品或生物体液样品。
3. 阻断缓冲液：常用的阻断缓冲液包括牛血清蛋白（BSA）或牛血清白蛋白（BSA）。
4. 洗涤缓冲液：含有洗涤缓冲液的磷缓冲盐溶液。
5. 抗原或抗体：用于检测的抗原或抗体。
6. 酶标记的二抗：与检测抗体特异性结合的酶标记的二抗。
7. 底物：与酶标记的二抗反应产生可测定信号的底物。
8. 停止液：停止底物反应的化学物质。
三、ELISA操作步骤1. 预处理a. 将ELISA板中的孔洗净，并加入阻断缓冲液，孵育一段时间以阻断非特异性结合位点。
b. 倒出阻断缓冲液，用洗涤缓冲液洗涤孔，重复此步骤3次。
c. 将待测样品或标准品加入孔中，每孔加入相同体积的样品。
d. 盖上盖膜，孵育一段时间，使抗原或抗体与样品中的目标物质结合。
2. 洗涤a. 将洗涤缓冲液加入孔中，摇动ELISA板，使洗涤液充分接触每个孔的底部。
b. 倒出洗涤缓冲液，重复此步骤3次。
3. 结合a. 加入特异性结合抗体，使其与目标物质结合。
b. 孵育一段时间，使抗原或抗体与特异性结合抗体结合。
4. 洗涤a. 重复步骤2中的洗涤步骤。
5. 酶标记的二抗结合a. 加入酶标记的二抗，使其与特异性结合抗体结合。
b. 孵育一段时间，使酶标记的二抗与特异性结合抗体结合。
6. 洗涤a. 重复步骤2中的洗涤步骤。
7. 底物反应a. 加入底物，使其与酶标记的二抗反应。
b. 孵育一段时间，使底物反应产生可测定的信号。
8. 反应停止a. 加入停止液，停止底物的反应。
b. 使用光度计测量吸光度，记录结果。
四、质量控制和数据分析1. 质量控制a. 包括正负对照组，以确保实验的准确性和可靠性。
b. 正负对照组应具有已知的抗原或抗体浓度，用于验证实验结果。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在。
本文档旨在提供一份详细的ELISA操作规程，以确保实验的准确性和可重复性。
二、材料和试剂1. 微孔板：96孔的聚合物微孔板。
2. 洗涤缓冲液：含有洗涤剂的磷酸盐缓冲液。
3. 标准品：已知浓度的抗原或抗体。
4. 样品：待测的抗原或抗体。
5. 酶标记的二抗：与待测物特异性结合的酶标记二抗。
6. 底物溶液：含有酶底物的缓冲液。
7. 停止溶液：停止底物反应的溶液。
三、实验步骤1. 预处理a. 将微孔板中的96孔填满洗涤缓冲液，轻轻摇动，倒掉液体。
b. 重复上述步骤三次，以确保孔内的洗涤剂充分清洗。
c. 将微孔板倒置在吸水纸上，用纸巾轻轻拍干。
2. 标准曲线制备a. 取出标准品，按照不同浓度分别加入微孔板中的孔中，每个浓度加入3个孔。
b. 加入相同体积的洗涤缓冲液作为空白对照组，每个浓度加入3个孔。
c. 将微孔板盖上密封膜，孵育一段时间（根据实验需求而定）。
d. 将密封膜去除，倒掉孔内液体。
3. 样品处理a. 取出待测样品，根据实验需求适当稀释。
b. 将样品加入微孔板中的孔中，每个样品加入3个孔。
c. 将微孔板盖上密封膜，孵育一段时间（根据实验需求而定）。
d. 将密封膜去除，倒掉孔内液体。
4. 酶标记二抗添加a. 取出酶标记的二抗，按照实验需求适当稀释。
b. 将酶标记二抗加入微孔板中的孔中，每个孔加入相同体积的二抗。
c. 将微孔板盖上密封膜，孵育一段时间（根据实验需求而定）。
d. 将密封膜去除，倒掉孔内液体。
5. 底物反应a. 取出底物溶液，加入微孔板中的孔中，每个孔加入相同体积的底物溶液。
b. 将微孔板盖上密封膜，孵育一段时间（根据实验需求而定）。
6. 反应停止a. 取出停止溶液，加入微孔板中的孔中，每个孔加入相同体积的停止溶液。
b. 轻轻摇动微孔板，确保溶液混合均匀。
7. 测量和分析a. 使用ELISA阅读器测量每个孔的吸光度值。
抗体效价检测 标准
抗体效价检测标准
抗体效价检测是测定抗体的物理状态及其在体内的滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果的一种方法。
通常用于诊断和治疗某些免疫相关疾病。
抗体效价检测的具体标准可能因疾病、检测方法和实验室而异，但一般都会遵循以下步骤：
1. 准备试剂：包括抗体样本、抗原、缓冲液、标记物等。
2. 样本处理：将抗体样本进行处理，如稀释、离心等，以去除杂质和干扰因素。
3. 抗原-抗体反应：将抗原与抗体样本混合，在一定温度下反应一定时间，使抗原和抗体充分结合。
4. 洗涤：去除未结合的抗原、抗体和干扰物质。
5. 检测：根据所采用的检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术等，对反应产物进行检测。
6. 结果判断：根据实验结果判断抗体效价是否正常。
通常，效价高于正常值表示抗体水平较高，可能存在免疫相关疾病或感染；效价低于正常值则表示抗体水平较低，可能存在免疫缺陷或疾病进展。
需要注意的是，不同的检测方法和实验室可能有不同的标准范围和操作流程。
因此，在进行抗体效价检测时，应遵循所采用的方法和实验室的标准操作规程。
elisa检测抗体效价
实验目的：实验材料：1、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、浓硫酸、Tween-20 、BSA等。
2、酶标抗小鼠IgG3、TMB溶液配制：1、抗原包被液：PH9.6的碳酸盐缓冲液（0.05 M）批号：称取：Na2CO3（分子量105.99） 1.59 gNaHCO3（分子量84.01） 2.9 g加蒸馏水至1000ml，调PH值。
滤膜（0.45 μm）过滤，4℃保存。
2、洗涤缓冲液(PBS-T) 批号：PBS缓冲液1000 mlTween-20: 0.5 ml调PH值至7.39。
滤膜（0.45 μm）过滤，室温保存或4℃保存。
3、封闭液（1.0% BSA/PBS-T）批号：洗涤缓冲液1000 mlBSA: 10 g现用现配。
4、血清稀释液(pH7.4 PBS)：0.0067 M(PO4+)5、洗涤用PBS (pH7.4), 0.15 M(PO4+) 批号：称取：NaCl8.0 gNa2HPO4·12H2O 2.9 gKH2PO40.2 gKCl0.2 g加蒸馏水至1000 ml，调PH值至7.39。
滤膜（0.45 μm）过滤，室温或4℃保存。
6、二抗稀释液：同洗涤缓冲液7、终止液：2M H2SO4批号：水90ml浓硫酸10.64ml浓硫酸逐滴加入水中，不断搅拌，防止局部过热。
4℃保存。
实验器材：1、1 ml枪头；200 μl枪头；10 μl枪头，。
2、1.5 ml EP管。
3、移液器1 ml、200 μl、100 μl、20 μl、10 μl、2 μl。
4、96孔板（costor，美国）。
5、电子天枰。
6、酶标仪（Labsystems DragonMK3，芬兰）。
7、洗板机（BIORAD MODEL 1575，美国）。
8、电子pH计（SevenEasy S20）。
方法步骤：1 包被抗原：用μg/ml 的蛋白包被，每孔100μl。
密封，4℃过夜。
2 洗板：取出预先4℃包被过夜的96孔板，用PBS-T洗液300 μl/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。
ELISA法检测抗体效价
ELISA间接法检测抗体效价实验原理：ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），酶联免疫吸附实验。
指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
ELISA操作过程：（一）抗原包被（蛋白包被浓度一般是0.5 ug-10 ug）①准备ELISA酶标板，根据检测的量包被抗原。
②用包被液（NaHCO3-Na2CO3溶液）梯度稀释抗原，包被100 ul/孔，设置双复孔。
③用保鲜膜密封酶标板，盖上盖，放在装有湿棉花的饭盒中，4℃过夜（16h-24h）。
（二）洗涤①取出酶标板，弃掉保鲜膜，甩掉其中液体，吸水纸上拍干。
②加入洗涤液，300 ul/孔，震荡，室温放置3 min。
甩掉其中液体，吸水纸上拍干。
③共洗涤3次。
④用纯水再洗两次。
（三）封闭①用PBS配制好5%的FBS溶液（封闭液，现用现配）。
②洗涤后加入封闭液300 ul/孔。
③保鲜膜密封酶标板，装饭盒中，37 ℃培养箱2h。
④封闭之后无需洗涤。
（四）一抗孵育①封闭快好前的30分钟准备好一抗（单克隆抗体），用封闭液稀释，稀释梯度1：1000，1：3000，1：9000，1：27000。
同时设置空白组（空白封闭液），阴性对照组（未免疫细胞上清），阳性对照组（多抗）。
②加入一抗100 ul/孔。
③孵育：37℃，1h。
（五）洗涤（六）二抗孵育①用封闭液稀释二抗，二抗稀释度是1：3000。
②洗涤后，加入二抗，100 ul/孔。
③孵育：37℃，45 min。
（七）洗涤（洗涤五次，再用纯水洗涤两次）（八）底物显色①配制底物液（一块板用量，96孔，10 ml）：1×甲液4.86 ml +1×乙液5.14 ml + 4 mgOPD（3-4粒），迅速混匀。
待充分溶解后加入30% H2O2 50ul 即可。
注：OPD（邻苯二胺）有致癌性，操作时应戴手套。
底物液需现用现配，H2O2最后加，不然过一会儿就变黄了。
抗体效价的Elisa测定实验步骤
60年代初期，Averameas & Ram等 建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白 蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体，统称为酶标记物或酶结 合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定
抗体效价的Elisa测定实验步骤
petitive elisa same epitope Coat with bait pr Incubate with primary antibody anti bait pr and various
concentration prey protein
抗体效价的Elisa测定实验步骤
抗体效价的Elisa测定实验步骤
免疫标记技术
抗体效价的Elisa测定实验步骤
标记抗体或抗原
荧光素、放射性同位素、酶、 铁蛋白、胶体金及化学(或生物) 发光剂
镜检观察或进行自 动化测定
荧光显微镜，射线测量仪，酶标 检测仪，电子显微镜和发光免疫 测定仪等
直接在细胞、亚细胞、 应用各种液相和固相免疫
超微结构及分子水平上, 分析方法，对体液中的半
按“METHOD”键选择测试的波长类型（Single或Dual）、波 长大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板类型(96孔、 48孔或24孔)。
按 “ MAP” 键 选 择 阅 读 方 式 ( Auto 或 Manual) 、 阅 读 方 向 （Down或Across）、重复方向（Down或Across）、阅读起 始 位 置 （ 输 入 编 号 ） 、 空 白 Map （ Air 、 Full 、 Const 、 Column、P-Down、P-Across）。
ELISA法测定单克隆抗体的效价的操作步骤
ELISA法测定单克隆抗体的效价的操作步骤摘要：ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。
该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。
找产品，上生物帮>> >>一、实验目的1、深入了解ELISA法测定抗体效价的原理。
2、掌握ELISA法测定单克隆抗体效价的方法。
间接ELISA效价图二、实验原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。
该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。
ELISA法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。
在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。
在ELISA法中。
酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。
目前常用的几种ELISA方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。
本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。
其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。
三、仪器、原料和试剂仪器聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、水浴锅。
原料单克隆抗体试剂1、抗原及酶标记抗体①抗原：兔抗人IgG(RabbitAanti-humanIgG，CodeNo.A0423);②酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP(RabbitAnti-mouseIgG-HRP，CodeNo.P0260);均为DAKO公司产品，使用时按照说明书要求稀释。
ELISA操作规程
ELISA操作规程引言概述：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定分子，如抗体、抗原、蛋白质等。
ELISA操作规程是进行ELISA 实验的关键，它确保实验的准确性和可重复性。
本文将详细介绍ELISA操作规程的内容。
正文内容：1. 准备实验材料1.1 准备试剂和标准品：根据实验需要，准备适当的试剂和标准品，如抗体、底物、酶标记物等。
确保试剂的保存条件符合要求，标准品的浓度准确。
1.2 准备样本：收集样本后，按照实验要求进行处理和储存。
确保样本的质量和数量满足实验需求。
2. 准备实验设备2.1 洗板机：清洗洗板机，确保洗板机的清洁度，避免交叉污染。
2.2 酶标仪：校准酶标仪，确保测量结果的准确性。
2.3 微量移液器：校准微量移液器，确保样品的准确加入。
2.4 96孔板：准备好96孔板，标记好每个孔的内容。
3. 进行实验步骤3.1 固定抗原：将待测抗原加入96孔板中，使其吸附在孔壁上。
3.2 阻断：加入阻断剂，阻断非特异性吸附位点。
3.3 添加抗体：加入特异性抗体，与抗原结合。
3.4 添加酶标记物：加入酶标记的二抗或底物，与抗体结合。
3.5 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤孔壁，去除未结合的物质。
3.6 反应底物：加入底物，使酶催化反应发生。
3.7 终止反应：加入终止液，停止酶催化反应。
4. 测量和数据处理4.1 使用酶标仪测量吸光度值，记录每个孔的读数。
4.2 绘制标准曲线：根据标准品的吸光度值，绘制标准曲线。
4.3 计算样本浓度：根据样本的吸光度值，通过标准曲线计算样本的浓度。
5. 实验注意事项5.1 严格按照操作规程进行操作，避免实验误差。
5.2 保持实验环境的清洁和无菌，避免污染。
5.3 注意实验材料的保存和使用期限，确保实验结果的准确性。
总结：ELISA操作规程是进行ELISA实验的重要指南。
准备实验材料和设备、按照规定的步骤进行实验、正确测量和处理数据以及注意实验细节是保证实验结果准确性和可重复性的关键。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在。
该操作规程旨在提供一个标准化的操作流程，确保实验结果的准确性和可重复性。
二、实验材料1. 酶标板：96孔酶联免疫吸附板。
2. 抗原或抗体：待检测的抗原或抗体样品。
3. 阻断缓冲液：用于阻断非特异性结合位点。
4. 洗涤缓冲液：用于洗涤酶标板孔。
5. 一抗：与待检测抗原或抗体反应的第一抗体。
6. 二抗：与一抗反应的酶标记的第二抗体。
7. 底物：用于检测酶标记的第二抗体的底物。
8. 停止液：用于终止底物的反应。
三、实验步骤1. 酶标板涂覆a. 取出所需数量的酶标板，并在每个孔中加入待测抗原或抗体。
b. 将酶标板置于4℃的冰箱中，静置过夜或至少2小时，使抗原或抗体充分吸附在孔壁上。
c. 倒出孔内未吸附的抗原或抗体，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次。
2. 阻断a. 加入阻断缓冲液至每个孔中，覆盖整个孔底。
b. 将酶标板密封，并在室温下孵育1小时，以防止非特异性结合。
3. 加入一抗a. 倒出阻断缓冲液，并加入稀释后的一抗至每个孔中。
b. 将酶标板密封，并在室温下孵育1小时，使一抗与待检测抗原或抗体发生特异性结合。
c. 用洗涤缓冲液洗涤孔3次。
4. 加入二抗a. 倒出洗涤缓冲液，并加入稀释后的二抗至每个孔中。
b. 将酶标板密封，并在室温下孵育1小时，使二抗与一抗发生特异性结合。
c. 用洗涤缓冲液洗涤孔3次。
5. 底物反应a. 倒出洗涤缓冲液，并加入底物至每个孔中。
b. 将酶标板密封，并在室温下孵育一定时间，使底物与酶发生反应。
c. 根据实验要求，控制反应时间，避免过度反应。
6. 反应终止a. 加入停止液至每个孔中，终止底物的反应。
b. 使用酶标仪测量各孔的吸光度，记录实验结果。
四、质量控制1. 阳性对照：使用已知含有特定抗原或抗体的样品作为阳性对照，确保实验的准确性和可重复性。
2. 阴性对照：使用不含特定抗原或抗体的样品作为阴性对照，排除非特异性结合的干扰。
抗体效价文档
抗体效价1. 简介抗体效价是用于衡量抗体对特定抗原的亲和力和活性的指标。
抗体效价通常用于评估抗体在抗体结合反应中的强度，并可用于确定抗体的适用范围和最佳使用浓度。
本文将介绍抗体效价的定义、测定方法以及影响抗体效价的因素。
2. 定义抗体效价是指一定条件下抗体与抗原相互作用的强度。
它通常用于评估抗体的亲和力和活性，衡量抗体与抗原结合的强度。
抗体的效价越高，其与抗原的结合能力越强，抗体的活性也就越强。
3. 测定方法3.1 双抗体夹心ELISA法双抗体夹心ELISA法是一种常用的测定抗体效价的方法。
该方法的原理是将待测抗体与特定抗原结合，然后通过加入二抗进行检测。
具体步骤如下：1.在96孔板中涂布目标抗原。
2.加入一定浓度的待测抗体，并孵育一段时间，使抗体与抗原结合。
3.清洗孔板，去除未结合的抗体。
4.加入二抗，它会与待测抗体结合。
5.加入底物并进行反应，测定反应产物的吸光度。
根据吸光度值可以计算出抗体的效价。
3.2 免疫沉淀法免疫沉淀法也是一种测定抗体效价的常用方法。
该方法的原理是将待测抗体与特定抗原结合，然后通过沉淀的方式去除未结合的抗体。
具体步骤如下：1.在待测抗原的溶液中加入一定浓度的待测抗体，并孵育一段时间，使抗体与抗原结合。
2.加入沉淀剂，将未结合的抗体和抗原沉淀下来。
3.用洗涤液清洗沉淀后的样品，去除沉淀剂。
4.进行离心，将沉淀物与上清分离。
5.用适当的缓冲液溶解沉淀物，获得抗体效价。
3.3 其他方法除了双抗体夹心ELISA法和免疫沉淀法，还有其他一些测定抗体效价的方法，如放射免疫法、荧光免疫法等。
这些方法各有特点，适用于不同类型的抗体和抗原。
4. 影响因素抗体效价受多种因素影响，包括抗体和抗原的浓度、孵育时间、温度等。
以下是一些常见的影响因素：4.1 抗体浓度抗体浓度是影响抗体效价的关键因素之一。
一般来说，抗体浓度越高，效价也就越高。
但是，过高的抗体浓度可能会造成非特异性结合，降低效价的准确性。
ELISA方法确定制备抗体效价的标准操作规程
ELISA方法确定制备抗体效价的标准操作规程ELISA方法确定制备抗体效价的标准操作规程（编号：033）1、目的及适用范围该SOP用于规范利用ELISA方法检测制备抗体的标价的操作。
2、主要仪器及试剂离心机、冰箱、37℃恒温箱、酶标仪、洗板机、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液、0.2M Na2HPO4、0.1 M 柠檬酸、0.1 M EDTA、A、B底物反应液、终止液、HRP标记二抗（ELISA效价1:10000-100000）3、操作步骤3.1 目的蛋白的纯化；3.2 免疫兔子或小鼠；3.3 采集免疫动物的血清；3.4 抗原包被，每孔包被抗原50-200ng，4℃包被过夜或37℃包被5h；3.5 用封闭液37℃封闭3h或4℃封闭过夜，然后用PBST洗涤3次，每次2min；3.6 将抗体（免疫血清）和阴性血清分别按1:1000，1:2000，1:5000，1:10000和1:50000稀释后，每孔加入50μL，37℃温育45min，用PBST洗涤5次；3.7 加入相应的HRP标记二抗，37℃温育30min，用PBST洗涤5次；3.8 每孔分别加入50μL A液和B液，然后每孔加入50μL终止液；3.9 测定其A450nm，如果样品孔与阴性对照孔A450nm比值大于2.1最高稀释倍数为抗体效价。
3.10 抗体效价评定：一般来说，用重组蛋白作为抗原免疫动物所得到的免疫血清，其ELISA效价应不低于1:5,000。
为了能更充分验证制备抗体的效价及特异性，最好是联合Western-blot及IFA 等方法一起来检测制备抗体的效价及特异性。
4、注意事项4.1免疫抗原选择要点4.1.1尽量选择标签比较小的载体来纯化目的蛋白，而且在克隆目的基因时尽量去除载体序列。
如可以选择PET-30a载体(His标签)作为表达载体时，尽量选择Nde I/Xho I这两个酶切位点来克隆目的基因。
4.1.2重组蛋白纯度应不低于90％。
自制多克隆抗体效价ELISA测定方法
自制多克隆抗体效价ELISA测定方法实验目的ELISA 方法检测自制多克隆抗体效价。
实验试剂均为常规试剂，尽量购买同一批次试剂，以保证实验的均一性。
实验设备和材料可拆卸ELISA板为JET公司产品。
操作步骤（一）最佳包被浓度的确定（方阵法）将重组蛋白1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400倍稀释，以100 μL每孔于四度包被过夜，PBST洗涤三次，每次350 μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净，用5%的脱脂奶粉37℃封闭2 h，用阴性血清和阳性血清分别稀释1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12 800、1:25600倍稀释作为一抗，100 μL每孔，37℃孵育1 h，PBST洗涤三次后，用HRP标记的羊抗鼠二抗（具体浓度参考不同公司说明书的ELISA工作浓度），100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗涤三次后，加入新鲜配制的显色液，50 μL/孔，37℃作用15～30 min，加入终止液，50 μL/孔，然后在酶标仪上读取OD450 nm吸光值。
以阳性血清孔的OD值接近1.0，P/N 最大的抗原血清稀释度作为抗原最佳包被浓度。
（二）效价测定最佳包被浓度100 μL每孔包被ELISA板，4℃放置过夜，PBST洗涤三次，每次350μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净。
5%脱脂乳37℃包被2 h，PBST洗涤三次，每次300 μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净。
将阴性和阳性血清1:400开始进行四倍比稀释后，稀释12孔，以100 μL/孔加入ELISA板作为一抗37℃孵育1 h，PBST洗涤三次，每次350 μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净。
加入HRP标记的羊抗鼠二抗，100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗涤三次每次350 μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净。
加入新鲜配制的显色液，50 μL/孔，37℃作用15-30 min，加入终止液，50 μL/孔，然后在酶标仪上读取OD450 nm吸光值。
抗体制备标准操作规程(3篇)
第1篇一、目的为了规范抗体制备过程，确保抗体质量，特制定本操作规程。
二、适用范围适用于各类抗体制备，包括免疫原制备、免疫接种、抗体采集、抗体纯化等环节。
三、职责1. 抗体制备负责人：负责制定抗体制备方案，监督实施，确保抗体制备质量。
2. 研究员：负责免疫原制备、免疫接种、抗体采集等具体操作。
3. 技术员：负责抗体纯化、质量检测等具体操作。
四、标准操作程序1. 免疫原制备（1）选择合适的免疫原，如蛋白质、多肽、DNA等。
（2）将免疫原进行化学或生物合成，制备成适宜的免疫原形式。
（3）对免疫原进行纯化，去除杂质。
2. 免疫接种（1）选择合适的动物模型，如小鼠、大鼠、兔等。
（2）根据动物种类和免疫原特性，确定免疫接种方案，如免疫途径、免疫间隔、免疫次数等。
（3）按接种方案对动物进行免疫接种，注意观察动物反应，如体重、食欲、活动等。
3. 抗体采集（1）在免疫结束后，根据抗体产生时间，选择合适的抗体采集时间。
（2）采集抗体，如血清、腹水等，注意无菌操作。
（3）将采集到的抗体进行分离、过滤，去除杂质。
4. 抗体纯化（1）选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。
（2）根据抗体特性和纯化方法，制备纯化柱或选择合适的纯化试剂。
（3）将抗体溶液过柱，收集洗脱液，进行抗体浓度测定。
5. 抗体质量检测（1）检测抗体效价，如ELISA、Western blot等。
（2）检测抗体特异性，如竞争ELISA、免疫印迹等。
（3）检测抗体稳定性，如冻融稳定性、pH稳定性等。
五、注意事项1. 操作过程中应严格遵循无菌操作原则，防止污染。
2. 抗体制备过程中，应密切关注动物反应，如体重、食欲、活动等，确保动物健康。
3. 抗体制备过程中，应做好记录，包括免疫原、免疫方案、抗体采集时间、纯化方法等。
4. 抗体制备完成后，应对抗体进行质量检测，确保抗体质量。
六、附则本规程自发布之日起实施，如有未尽事宜，由抗体制备负责人负责解释。
ELISA酶联免疫吸附(ELISA)法检测抗体的效价 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术
免疫标记技术
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射 性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通 过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。
2.分类：
ü 放射免疫测定法：131I，32P ü 免疫荧光技术：FITC，PE ü 免疫酶测定法：HRP，AP
ü 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS（氯化钠 8.5g,十二水磷酸氢二钠2.85克或二水磷酸氢二钠1.13克， 氯化钾0.2克，磷酸二氢钾0.27克，蒸馏水1000毫升 ）
ü 底物溶液：TMB溶液 ü 2M H2SO4 （市售浓硫酸为18.4M，根据要配制的2M硫酸体
酶联免疫吸附试验
（以间接性ELISA为例）：
实验材料
ü 牛血清白蛋白（BSA)—— 抗原，2%（W/V）溶液，PBS 配制
ü 小鼠抗血清—— 待测样品，用PBST从1：1000开始倍 比稀释，连续稀释8个稀释度
ü HRP标记羊抗小鼠IgG —— 二抗（按说明书稀释使用， 用PBST稀释）
ü 包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液（NaHCO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加水至1L）
• 阳性：显色为黄色 • 阴性：无色
1 23 4
阴性 阴性 阳性 阳性
注意事项
• 洗涤彻底，避免交叉污染。 • 按顺序加样，孔底无气泡。 • 包被和温育在湿盒内进行。
12 34
空 阴阳待 白 性性测
3.加二抗：
甩干孔内液体 以洗涤液（200色：
各孔加入酶标二抗100μL/孔 37℃，保鲜膜包好，45min
甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤4次，3min/次
ELISA操作规程
ELISA操作规程标题：ELISA操作规程引言概述：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的生物化学分析技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前准备、试剂配制、板涂覆、标准曲线绘制、样品检测等五个部分。
一、实验前准备：1.1 清洗实验用具：使用去离子水和洗涤剂彻底清洗酶标仪、试剂瓶、试管、多孔板等实验用具，确保无任何污染物残留。
1.2 检查试剂有效期：查看试剂瓶上的标签，确保试剂的有效期未过期，避免实验结果的误差。
1.3 准备实验台：清洁实验台面，并准备好所需的实验用品，如移液器、离心机、显微镜等。
二、试剂配制：2.1 样品稀释液的配制：根据实验需要，选择适当的稀释液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或BSA（牛血清白蛋白）溶液，并按照比例将其与样品混合。
2.2 酶标板涂层液的配制：将涂层抗体或抗原稀释至适当浓度，并将其均匀涂布在酶标板上，以便捕获待测物。
2.3 酶标记液的配制：将酶标记的抗体与酶底物反应，形成酶标记复合物，用于检测酶标板上的待测物。
三、板涂覆：3.1 预处理酶标板：将酶标板孔位用PBS或BSA溶液预处理，以避免非特异性吸附。
3.2 加入涂层液：将配制好的涂层液加入到酶标板孔位中，保持孔位内液体的均匀分布，避免气泡的产生。
3.3 孵育酶标板：将涂层的酶标板在适当的温度和时间下进行孵育，以促使待测物与涂层抗体或抗原发生特异性结合。
四、标准曲线绘制：4.1 准备标准品：选择适当的标准品，按照不同浓度进行稀释，以建立标准曲线。
4.2 加入标准品：将不同浓度的标准品加入到酶标板孔位中，每个浓度设置多个重复孔位，以获得可靠的结果。
4.3 检测与测定：使用酶标仪测定各个孔位的吸光度值，并根据标准品的吸光度值绘制标准曲线，以后续样品的检测提供参考。
五、样品检测：5.1 样品处理：将待测样品与稀释液混合，并按照操作规程将混合液加入到酶标板孔位中。
ELISA操作规程
ELISA操作规程引言概述：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的生物化学实验技术，广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。
本文将详细介绍ELISA操作规程，并按照一、二、三、四、五这样的顺序，分为五个部份进行阐述。
一、试剂准备1.1 根据实验需要，准备ELISA板、酶标板液、洗涤缓冲液、样本稀释液等试剂。
1.2 检查试剂的有效期和储存条件，确保试剂的质量。
1.3 根据实验方案，按照规定的比例和方法，将试剂进行稀释和配制。
二、样本处理2.1 采集样本，并根据实验要求进行标记和编号。
2.2 根据实验方案，对样本进行预处理，如离心、稀释等。
2.3 确保样本的质量和数量符合实验要求，并进行必要的记录和标记。
三、板涂覆3.1 将ELISA板放置在工作台上，并按照实验方案要求，在每一个孔中加入特定抗原或者抗体。
3.2 保持ELISA板在适当的温度下孵育一段时间，以确保抗原或者抗体的吸附。
3.3 将孔中的液体倒出，并用洗涤缓冲液洗涤孔，以去除未吸附的物质。
四、标记物检测4.1 准备酶标记的抗体或者抗原，并按照实验方案要求进行稀释和标记。
4.2 将标记物加入到ELISA板的每一个孔中，并在适当的温度下孵育一段时间，使标记物与抗原或者抗体结合。
4.3 将孔中的液体倒出，并用洗涤缓冲液洗涤孔，以去除未结合的标记物。
五、结果分析5.1 加入底物溶液，使酶标记物发生可见的颜色反应。
5.2 在适当的时间内住手反应，并用酶标仪或者其他仪器测量吸光度。
5.3 根据实验方案和标准曲线，计算样本中目标物质的浓度或者活性。
总结：ELISA操作规程是进行ELISA实验的基本指南。
通过试剂准备、样本处理、板涂覆、标记物检测和结果分析等五个部份的详细阐述，可以确保实验的准确性和可重复性。
在操作过程中，需要严格遵守实验室的安全操作规范，并根据实验方案进行操作。
惟独正确操作，才干获得准确可靠的实验结果。
间接ELISA测定抗体的效价
间接ELISA测定抗体的效价【目的】测定样品中抗体的效价（Titer）【基本原理】将特异性抗原包被在固相载体上，加入含待测抗体的样品，使之与固相抗原结合（Ag-Ab），再加入酶标记的抗抗体（亦称二抗），与上述Ag-Ab复合物结合形成Ag-Ab-α-Ab-E复合物。
此时加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色，以酶与底物的显色反应程度来确定待测抗体的效价。
由于每步之间均有冲洗步骤，因此若样品中不含相应的抗体，酶标抗体则将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
1.包被固相载体常用聚苯乙烯微孔板，因为聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
吸附主要为物理吸附，不发生化学反应，效果与缓冲液的浓度、pH、温育时间，载体表面性质等有关。
缓冲液宜偏碱性，离子强度较低，有利于蛋白质的吸附。
2.封闭由于血清中含有高浓度的非特异性抗体，因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质(例如牛血清蛋白)再包被一次，以封闭固相上的空余间隙。
可用含1％BSA、1％明胶3－5％脱脂奶粉封闭。
酶标抗体可以用含BSA的PBS稀释，以减少非特异性吸附。
3.温育温育最好用水浴，室温也可，微孔板浮在水浴面可使温度迅速平衡。
且板上应加盖，避免蒸发。
应用酶促反应动力学原理，低温可提高结合率，高温可加速反应。
4.待测样品待测样品溶液中需不存在与标记酶相同的酶、底物、酶抵制剂和其它干扰因素，以防止干扰作用。
在检测过程中样本须先行稀释到适当浓度(1:40~1:200)，以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
5.洗涤洗涤实验操作过程中决定实验成败的一个关键步骤。
目的是除去未结合的免疫反应物，终止抗原抗体的继续结合，除去标本中与反应无关的成分和游离的酶结合物以及反应过程中吸附在固相载体上的非特异性干扰物。
洗涤次数一般为3～4次，每次3分钟,要微微震荡，特别是最后一次，如有酶结合物的非特异吸附及残留，会使空白值升高，所以要使洗涤彻底。
18多克隆抗体制备——抗体效价的检测(ELISA)
间接ELISA法效价检测抗血清效价通过间接ELISA法来确定抗原最佳包被浓度 (方阵滴定，也叫棋盘滴定法) 。
以兔高免血清多抗效价检测为例1. 抗原用包被缓冲液CBS (0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)按1μg/ml浓度用作连续1:2倍比稀释，每个稀释度包被一行（12孔/行）,100μl/孔加入酶标板中，覆膜密封（防止水分挥发）4℃包被过夜(12h以上)。
2. 次日甩掉板中液体，在吸水纸上拍干板子，每孔加入150μl封闭液(含2% BSA的包被缓冲液CBS），室温（25℃）2h以上。
3. 用洗涤液PBST[含0.05% Tween-20的PBS(pH7.4)]洗板3次，此时将待测高免阳性血清和空白阴性血清用抗体稀释液（含1% BSA 的PBS缓冲液,pH7.4）分别从1:500开始做连续1:2倍比稀释，按下图分布模式100μl/孔，37℃ 1h。
4. 取出拍干，洗涤液洗板3次，每孔加入100μl二抗工作液（用抗体稀释液1:3000稀释HRP标记羊抗兔IgG，Frdbio，Cat No.:SAB90200H）,37℃孵育1h。
5. 取出拍干，洗涤液洗板3次，每孔加入100μl单组份TMB底物（Frdbio,Cat No.:ELS0010），室温孵育5～20min（根据颜色的改变速度）。
6. 每孔加入50μl终止液（0.5M H2SO4）。
7. 在酶标仪上读取450nm/630nm的吸光度。
标准的结果分布模式应该如上图所示： ELISA酶标板显色由阴阳性区域第一行第一列孔向外显均匀放射状递减；如果在包被梯度方向上OD450过高无梯度，应该继续降低包被浓度；反之，则增加。
同理，如果在免疫血清稀释度方向上OD450过高无梯度，则应继续加大稀释度，反之，则减小。
8. 最佳包被浓度的确定:阳性血清区域内某个孔对应的OD值与其上/其左孔OD值恰好为2倍关系且OD值不低于1.2,且此孔对应的阴性血清区域OD值与空白对照孔OD值无差异，此孔包被的抗原浓度的2倍确定为抗原的最佳包被浓度。
抗体效价测定操作规程
抗体效价测定操作规程 Hessen was revised in January 2021抗体效价测定操作规程操作步骤：一．IgG类1.IgG类抗体效价滴定，须取适量血清200μL加等体积2—Me溶液混合，封口，置37℃水浴箱作用60分钟，先稀释血清：200L病人血清600L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，在第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。
2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。
（如待检血清抗体为抗A，则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B，则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B，则倍量稀释两份血清，一份加入A型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）3.先直接观察离心结果，之后在每管分别加入凝聚胺试剂盒中的R1液3d，混合30S均匀后，在各加R2液2滴，操作方法同凝聚胺交叉配血法，然后判读结果。
通常以肉眼观察到的第一个“±”的凝集管作为判断的终点，终点血清稀释度的倒数为效价（Titer），或称滴度。
二．IgM1.血清连续倍量稀释法先稀释血清：100L病人血清+700L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。
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ELISA方法确定制备抗体效价的标准操作规程（编号：033）
1、目的及适用范围
该SOP用于规范利用ELISA方法检测制备抗体的标价的操作。
2、主要仪器及试剂
离心机、冰箱、37℃恒温箱、酶标仪、洗板机、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液、0.2M Na2HPO4、0.1 M 柠檬酸、0.1 M EDTA、A、B底物反应液、终止液、HRP标记二抗（ELISA效价1:10000-100000）3、操作步骤
3.1 目的蛋白的纯化；
3.2 免疫兔子或小鼠；
3.3 采集免疫动物的血清；
3.4 抗原包被，每孔包被抗原50-200ng，4℃包被过夜或37℃包被5h；
3.5 用封闭液37℃封闭3h或4℃封闭过夜，然后用PBST洗涤3次，每次2min；
3.6 将抗体（免疫血清）和阴性血清分别按1:1000，1:2000，1:5000，1:10000和1:50000稀释后，每孔加入50μL，37℃温育45min，用PBST洗涤5次；
3.7 加入相应的HRP标记二抗，37℃温育30min，用PBST洗涤5次；
3.8 每孔分别加入50μL A液和B液，然后每孔加入50μL终止液；
3.9 测定其A450nm，如果样品孔与阴性对照孔A450nm比值大于2.1最高稀释倍数为抗体效价。
3.10 抗体效价评定：一般来说，用重组蛋白作为抗原免疫动物所得到的免疫血清，其ELISA效价应不低于1:5,000。
为了能更充分验证制备抗体的效价及特异性，最好是联合Western-blot及IFA 等方法一起来检测制备抗体的效价及特异性。
4、注意事项
4.1免疫抗原选择要点
4.1.1尽量选择标签比较小的载体来纯化目的蛋白，而且在克隆目的基因时尽量去除载体序列。
如可以选择PET-30a载体(His标签)作为表达载体时，尽量选择Nde I/Xho I这两个酶切位点来克隆目的基因。
4.1.2重组蛋白纯度应不低于90％。
一般来说，纯度在90％以上的蛋白，取10μg电泳，在SDS-PAGE 胶上应基本看不到杂带。
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