慢病毒转染增强剂说明书复习过程
慢病毒转染
慢病毒转染
1、实验前一天，以每毫升3-5×10 4个目的细胞接种96孔培养板中的12孔，体积为90ul。
（不使用边上的孔，保持细胞状态良好）
2、感染预实验共分为四组，每组三个不同的MOI：1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml
3、实验开始，配备1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml，如病毒滴度为1×108TU/ml，取5ul病毒液稀释到45ul的ENi.S.中，在进行一次10被稀释即可。
4、取2ul10mg/mlpolybrene稀释到400ul，备用。
5、将10ul三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。
6、再设定需要添加polybrene的孔中加入10ulpolybrene稀释液。
7、混匀后继续培养，8-12小时候观察细胞生长状态，并更换为新鲜培养基。
8、感染3-4天后，观察荧光表达情况。
9、通过细胞感染效果，确认目的细胞的感染条件和感染参数。
选取效果最优的一组实验条件按相同的实验方法进行正式转染实验。
慢病毒转染步骤
转染法步骤：
1分至适宜浓度的细胞到六孔板中，次日细胞应30%~50%融合
2.第二天，吸掉板中的生长培养基并加入新的含聚凝胺的培养基，加入适当数量的病毒于细胞中（见“决定慢病毒效价”部分），每孔溶液终体积为3ml
注意：考虑到细胞在自旋过程中不一定能完全被培养基覆盖，不推崇减少六孔板中的溶液终体积。
调整孔中聚凝胺的终浓度为8mg/ml.通过涡旋六孔板轻轻地混合培养基，病毒以及聚凝胺。
3.为减少自旋-转染过程中悬浮物质的形成以及孔与孔之间液体接触的情况发生，用无菌微孔密封膜封闭六孔板（直接盖在板上），封闭好后，再在密封膜上加上一层未经灭菌的密封箔，最后盖上六孔板盖。
4.在标准的组织培养离心机中，37°C，2250rpm（1200g）条件下自旋-转染细胞60min.
5.一自旋-转染后就移走密封膜和密封箔，将孔中原有的培养基换为新鲜的生长培养基（每孔2ml就足够）
6.转染24h后，吸掉孔中的培养基并每孔加入新鲜的含有嘌呤霉素的2ml生长培养基。
注意：嘌呤霉素的浓度应被每个细胞株充分利用，一般规定在1-5μg/mL
7.进一步的培养时间主要取决于细胞株的类型以及转染后的实验分析。
通常，嘌呤霉素筛选细胞需要大约48h。
下面推荐的是结合给定的细胞株和分析实验来得到的嘌呤霉素筛选
时间
>转染后实验分析嘌呤霉素筛选细胞时间> mRNA knockdown (qPCR) 2+ days
> Protein knockdown (Western) 3+ days
> Phenotypic assay 表型分析3+ days
8.检测目的感染细胞的表面分子。
慢病毒转染增强剂说明书
慢病毒转染增强剂说明书慢病毒转染增强剂说明书产品描述:Polybre ne （聚凝胺）是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA专染实验以增强脂质体的转染效率。
Polybrene目前广泛用于逆转录病毒介导的基因转染，慢病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。
Polybrene也是一种有名的抗肝素剂（肝素拮抗剂）, 常用来生产非特异性凝集的红细胞。
另外Polybrene也多用于蛋白测序，因为小剂量的Polybrene在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象。
PVDF膜加入polybrene还能提高膜的亲和性。
注：Polybrene对某些细胞（如末端分化的神经元，DC细胞）毒性较大，初次应用建议先做毒性测试［1］。
基本属性：另U 名：1,5-dimethyl-1,5-diaza un decamethyle ne polymethobromideCAS No.: 28728-55-4纯度：》94% （titration）溶解方法：溶于水，溶解能力高达10% 0.9%Nacl溶液配制1mg/mL的储存液，可以滤膜除菌或高压灭菌。
保存与稳定性：粉末2-8 C保存，避免潮湿。
1mg/mL储存液2-8 C, 至少一年保持稳定。
操作步骤(仅作参考)：实验1逆转录病毒感染(Retroviral Infection )(1)重组逆转录病毒原液的制备：取5ml生长培养基(5%血清) 加入约含单层转染逆转录包装细胞的100mm培养盘内。
孵育24h后，吸去培养液并用0.45卩m滤器过滤。
(2)待感染细胞的培养：100mm培养盘内加入10ml完全培养基，细胞密度为5X 105/盘。
(3)病毒感染：细胞培养24h后，吸去完全培养液。
用含polybrene 的2ml病毒上清(或将病毒原液稀释到2ml)感染细胞，polybrene 的终浓度为5卩g-10卩g/ml。
构建细胞稳转株
构建细胞稳转株（一）慢病毒包装：1．转染前24小时，将293T细胞以4-5×106接种于10cm的大皿中，加入10ml DMEM 完全培养基，轻轻摇晃，混匀，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
注：细胞转染前密度应达到80%-90%。
3．充分混匀，离心管1，离心管2室温孵育5分钟。
4．将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。
注意加入顺序非常重要。
5．室温孵育转染混合液15分钟6．将步骤1准备的细胞换液（95%DMEM+5%灭活FBS）。
7．将1ml转染混合液逐滴加入换液好的细胞培养皿中，前后晃动培养皿，充分混匀。
8．37℃培养。
4-6小时后，用10ml培养基换液（90%DMEM+5%灭活FBS+5%双抗）。
9．转染48小时收集细胞培养上清。
500g离心10min去除细胞碎片。
该上清可以直接用于慢病毒感染，也可进行病毒滴度测定或病毒浓缩。
如需长时间保存，可-80℃冻存。
注意每次冻融将导致病毒滴度下降2-4倍。
（二）慢病毒感染待测细胞：1.取新包装的或冻存于-80℃冰箱的慢病毒于冰上缓慢解冻。
2.慢病毒与培养基（DMEM+5%灭活FBS+1%双抗）按一定的体积混匀，加转染增强剂polybrene至终浓度为10μg/ml。
3.待转染的细胞吸去原培养液，PBS洗3次。
4.把混合好的慢病毒培养基加到细胞培养瓶中进行感染。
5.将细胞培养瓶放回培养箱中培养过夜，PBS洗3次，更换为完全培养基继续培养。
6.感染72h后，荧光显微镜观察荧光，拍照，分析细胞生长状态。
（三）稳转细胞株筛选：将慢病毒感染成功的细胞继续培养，并在培养基中加入嘌呤霉素进行筛选。
筛选持续一周，在荧光显微镜下观察，至感染效率达到80%嘌呤霉素最佳筛选浓度测定：将对数生长期的细胞消化，均匀铺在24孔板上，5×104/孔。
隔夜将细胞换液，并设置嘌呤霉素梯度：0 ug/ml；0.5 ug/ml；1.0 ug/ml；1.5 ug/ml；2.0 ug/ml；2.5 ug/ml48 h后换正常培养基。
慢病毒专用转染试剂说明书
慢病毒专用转染试剂LentiFit TM使用说明书产品简介：LentiFit TM脂质体转染试剂是一种高效的阳离子脂质体转染试剂。
与其他脂质体转染试剂相比，汉恒生物独立研发的LentiFit TM脂质体转染试剂具有转染效率高，重复性好，操作简单，无明显细胞毒性，抗血清干扰等优点。
对于大多数细胞，用LentiFit TM转染后72小时内不更换培养液无明显细胞毒性。
同时，血清的存在不影响LentiFit TM的转染效率，这样可以减小无血清对细胞的损伤。
基于以上优点，LentiFit TM常用做慢病毒包装的转染试剂。
包装清单以及储存条件：试剂名货号储存条件规格有效期LentiFit TM转染试剂Let10004℃保存 1 mL12个月使用方法：1.细胞培养：以1个10 cm培养皿转染293T细胞为例，转染前一天接种细胞(20-24小时)，接种细胞约3.5×106，接种体积10 mL，确保第二天转染时细胞汇合度（confluent）能达到约50%~70%。
2.在进行转染步骤前，把10 cm培养皿中的培养液更换成新鲜细胞培养液，培养液的体积为5 mL，放回培养箱中继续培养，并准备转染体系（步骤3-6）。
3. 把LentiFit TM脂质体转染试剂轻轻混匀。
4. 对于待转染的10 cm培养皿中的细胞，取一只洁净无菌离心管，加入24 µg质粒（目的质粒和辅助质粒的比例根据不同包装系统进行调整）到500 µL DMEM溶液，用枪轻轻吹打混匀。
5. 取另一只洁净无菌离心管，加入500 µL DMEM溶液，再加入40 µL LentiFit TM，用枪轻轻吹打混匀,室温放置5分钟。
6. 将步骤4与5中的质粒溶液与LentiFit TM溶液混合，用枪轻轻吹打混匀。
不可V ortex 或离心。
室温孵育20分钟。
有可能出现絮状沉淀物，属正常现象，不会影响转染效率。
7. 将转染复合物逐滴加入到培养皿中，轻轻“8”字形摇晃混匀后，放回培养箱继续培养。
慢病毒转染实验流程
慢病毒转染实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 病毒液与靶细胞准备。
将慢病毒液从-80℃冰箱中取出，置于冰上融化。
悬浮细胞慢病毒转染步骤及方法
悬浮细胞慢病毒转染步骤及方法
实验材料与方法
一、细胞培养人红白血病细胞Kasumi-1，常规培养使用含10% FBS(GIBCO)的RPMI 1640 培养基（Hyclone）（含1.5 mg/L-Glutamine，100 U/mL Penicillin，100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。
二、病毒侵染实验材料及试剂
DMEM培养基+ 10% FBSRPMI 1640培养基+10% FBSD-Hank’s Solution96孔板（Corning）24孔板（Corning）Lentivirus-病毒液（GenePharma，1×108 TU/mL）步骤1. 稀释病毒：稀释液（靶细胞维持液培养基）400 μL + 终浓度5 μg/mL Polybrene，将慢病毒原液按1:20、1:10、1:5 加入到稀释液中；
2. 24-well，按4×105 cells/well（根据细胞种类调整），1000 RPM 3min，取细胞沉淀。
将Step 1 中各份病毒稀释液分别与每份细胞沉淀重悬，同时建立对照（blank、negative），37°C 5% CO2中培养；
3. 12~24h 后离心移去细胞侵染后的病毒液，加入0.5 mL 完全培液，37°C 5% CO2过夜
4. 根据细胞状态和类型，如果必要分出1/3~1/5，加入0.5 mL完全培养，继续培养24~48h；荧光倒置显微镜下观察结果。
慢病毒转染原理
慢病毒转染原理慢病毒转染是一种常用的基因转染方法，适用于长期表达外源基因的研究。
慢病毒转染原理主要是利用慢病毒载体将外源基因导入宿主细胞，并将其整合入宿主细胞基因组中，从而实现外源基因的稳定表达。
本文将从慢病毒转染的原理、步骤和应用等方面进行介绍。
慢病毒转染原理。
慢病毒转染的原理主要包括以下几个步骤，首先，将外源基因插入慢病毒载体中，构建成慢病毒表达载体；然后，将慢病毒表达载体转染至包装细胞中，利用包装细胞的辅助病毒蛋白包装慢病毒颗粒；最后，将包装好的慢病毒颗粒用于感染目标细胞，外源基因被整合入宿主细胞基因组中，实现稳定表达。
慢病毒转染步骤。
慢病毒转染的步骤包括慢病毒载体构建、包装细胞培养、病毒颗粒包装和目标细胞感染等。
首先，构建慢病毒表达载体时，需要选择合适的慢病毒载体和适当的启动子，将外源基因插入载体中，并经过序列分析和酶切验证。
其次，包装细胞的培养和病毒颗粒包装是慢病毒转染的关键步骤，需要选择合适的包装细胞系，转染慢病毒表达载体并培养包装细胞，最终收集包装好的慢病毒颗粒。
最后，利用包装好的慢病毒颗粒感染目标细胞，实现外源基因的稳定表达。
慢病毒转染应用。
慢病毒转染在基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域具有广泛的应用。
在基因功能研究中，可以利用慢病毒转染实现基因敲除、过表达和靶向修饰等，进而研究基因在生理和病理过程中的功能。
在基因治疗中，慢病毒转染可以用于治疗遗传性疾病、肿瘤和传染病等，为基因治疗提供了重要的技术支持。
在细胞工程中，慢病毒转染可以用于改良细胞系，提高细胞的表达稳定性和产量，满足生物制药和工业生产的需要。
总结。
慢病毒转染是一种重要的基因转染方法，具有稳定、高效、广泛应用等特点。
通过慢病毒转染，可以实现外源基因在宿主细胞中的稳定表达，为基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域提供了重要的技术支持。
因此，深入理解慢病毒转染的原理和步骤，对于开展相关研究具有重要的意义。
慢病毒转染操作
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
慢病毒转染增强剂说明书
慢病毒转染增强剂说明书产品描述:Polybre ne （聚凝胺）是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA专染实验以增强脂质体的转染效率。
Polybrene目前广泛用于逆转录病毒介导的基因转染，慢病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。
Polybrene也是一种有名的抗肝素剂（肝素拮抗剂）, 常用来生产非特异性凝集的红细胞。
另外Polybrene也多用于蛋白测序，因为小剂量的Polybrene在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象。
PVDF膜加入polybrene还能提高膜的亲和性。
注：Polybrene对某些细胞（如末端分化的神经元，DC细胞）毒性较大，初次应用建议先做毒性测试［1］。
基本属性：另U 名：1,5-dimethyl-1,5-diaza un decamethyle ne polymethobromideCAS No.: 28728-55-4纯度：》94% （titration）溶解方法：溶于水，溶解能力高达10% 0.9%Nacl溶液配制1mg/mL的储存液，可以滤膜除菌或高压灭菌。
保存与稳定性：粉末2-8 C保存，避免潮湿。
1mg/mL储存液2-8 C, 至少一年保持稳定。
操作步骤(仅作参考)：实验1逆转录病毒感染(Retroviral Infection )(1)重组逆转录病毒原液的制备：取5ml生长培养基(5%血清) 加入约含单层转染逆转录包装细胞的100mm培养盘内。
孵育24h后，吸去培养液并用0.45卩m滤器过滤。
(2)待感染细胞的培养：100mm培养盘内加入10ml完全培养基，细胞密度为5X 105/盘。
(3)病毒感染：细胞培养24h后，吸去完全培养液。
用含polybrene 的2ml病毒上清 (或将病毒原液稀释到2ml)感染细胞，polybrene 的终浓度为5卩g-10卩g/ml。
37° C孵育3-6h。
慢病毒包装及质粒转染手册
使用Fugene进行慢病毒包埋步骤
注意：所有操作必须在BSL-2实验室环境进行
第一节：制作慢病毒存储液
293FT细胞的培养：细胞每周按照1:4 - 1:6的比例传代3次，保持其融合度在50%以下
第1天293FT铺板
以30%融合度左右进行10cm皿铺板，37°C, 5% CO 2条件下培养24小时
第2天转染
本实验中pcmv△R8.91:PLP-VSVG :DNA=2:2:2, Total DNA:PEI=1:3
2. 试管2：对每管的转染试剂，加入570ul Opti-MEM,将30ul Fugene加入试管正中
心，避免接触任何管壁，轻轻振荡（不能使用移液器），室温下孵育5min.
3. 将加入Opti-MEM- Fugene混合液加入试管1(DNA)，轻轻震荡混匀。
4．短暂离心使管壁液体流下。
5.室温下孵育15分钟
6. 15分钟后，将Optimem/DNA/Fugene加入细胞，摇动培养皿混匀。
7. 37°C, 5% CO 2培养过夜（12-16小时）
第3天换液
第4天。
回顾慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤.docx
一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
慢病毒使用操作指南
慢病毒使用操作指南慢病毒是一种常用的实验工具，广泛应用于细胞和分子生物学研究。
本文档旨在提供慢病毒使用的操作指南，帮助研究人员更好地利用慢病毒进行实验研究。
第一部分：慢病毒基本知识1. 什么是慢病毒？慢病毒是一种具有RNA基因组的病毒，属于反转录病毒。
它能够将自身的RNA基因组逆转录成DNA，再与宿主细胞的基因组融合，长期稳定地存在于宿主细胞中。
2. 利用慢病毒进行基因转染的优势相比其他常用的基因转染方法，慢病毒具有以下优势：- 高效性：慢病毒能够高效地转染多种类型的细胞，包括非分裂细胞。
- 长期稳定性：慢病毒转染的基因能够长期稳定地存在于宿主细胞中。
- 遗传稳定性：慢病毒转染的基因可以遗传给后代细胞，因此适用于长期实验研究。
第二部分：慢病毒使用的关键步骤1. 选择合适的慢病毒载体慢病毒载体是慢病毒的基础构建单元，其中包含转录启动子、报告基因等必要的元件。
根据实验需要选择合适的载体。
2. 包装慢病毒慢病毒的包装是将慢病毒载体与包装载体共转染至特定细胞株，通过包装载体中的包装酶，将慢病毒的RNA基因组逆转录成DNA，形成可复制的慢病毒。
3. 提取慢病毒经包装后的细胞培养基中含有包装好的慢病毒。
可通过超速离心等方法，将细胞培养物离心，提取慢病毒。
4. 病毒滴定病毒滴定是用来确定病毒滴度的重要步骤。
通过适当稀释提取的慢病毒，将其感染指定细胞株，计算出感染单位的浓度。
5. 慢病毒感染及筛选将提取的慢病毒添加至目标细胞中，通过细胞培养和筛选，筛选出具有所需基因的细胞株。
第三部分：慢病毒使用的注意事项1. 安全操作慢病毒具有一定的传染性，进行实验时需要遵守生物安全操作规范，佩戴一次性手套、口罩等个人防护装备，避免直接接触慢病毒。
2. 避免交叉感染实验室中使用慢病毒时，应尽可能避免交叉感染。
定期对实验室环境进行消毒，使用一次性材料，避免共享器械等措施可以减少交叉感染的风险。
3. 合理控制病毒滴度对于不同类型的细胞，需要确定合适的病毒滴度，以避免过度感染或感染不足的情况。
lentivirusgeneration慢病毒转染手册
Generation o f L entivirusReagents•293T: ATCC•Fugene 6 transfection reagent: Roche cat# 11814443001•FBS: Invitrogen cat# 16000-044•DMEM: Invitrogen cat# 11965-118•Pen/strep: Invitrogen cat# 15140-155•L-glutamine: Invitrogen cat# 25030-156•Non essential amino acid (NEAA): Invitrogen cat# 11140-050•Amicon Ultra Ultracel 100K: Millipore: cat# UFC910024•Beckman centrifuge tubes: Beckman: cat# 344058293T/fibroblast media (500 mls):DMEM (450 ml)10% FBS (50 ml)Pen/strep (5ml)L-glutamine (5ml)NEAA (5 ml)Reagent setupLentiviral vectors:Prepare all vector plasmids with Qiagen Maxiprep kits, including lentiviral packaging vectors and lentiviral transfer vectorsA. Production of Virus1. Seed 2x106 293T cells on a 100-cm tissue culture dish and incubate overnight until cellsreach ~70% confluence (~1-2 days). Replace with 10 ml of fresh media 2 hours before transfection.2. Mix lentiviral transfer vector and packaging vectors in 600 ul of DMEM in an eppendorftube. Add 50 ul of Fugene6 directly to the DNA mixture, making sure Fugene6 does not come in contact with the plastic. Gently vortex tube containing transfection mixture and incubate at RT for 20 min.Second generation packaging systemTransfer vector 10 ugpMD2.G 5 ugpsPAX2 5 ugThird generation packaging systemTransfer vector 10 ugpMDL g/pRRE 5 ugpRSV-Rev 2.5 ugpMD2.G 2.5 ug3. Add transfection mixture dropwise to cells; incubate 4 hrs to overnight (16 hours) andreplace with fresh medium.4. Collect virus-containing medium 48 hours after transfection and replace with freshmedium. Collect virus every 12 hours for up to 3 times total. Keep all viral media at 4Cuntil all collections are done. Pass viral media through a 0.45uM low protein-binding filter.At this point, the viral supernatant can be used to infect cells, frozen at -80C orconcentrated.Concentration using Amicon Ultra Centrifugal Filters:Transfer viral supernatnat to Amicon Filter and spin filter in tabletop centrifuge at 3000 rpm for 10-20 min at 4C. Concentrated virus can be aliquoted and stored at -80C. Thaw analiquot on ice before use; do not refreeze.Concentration by ultracentrifugation:1. Transfer viral supernatant to 33ml Beckman ultracentrifugation tubes and spin for 2hrs at 24,000 rpm using SW32Ti or SW28Ti.2. Pour off supernatant carefully and resuspend viral pellet using 100-ul pipette tip withappropriate amount of DMEM to concentrate virus 100x. It may take 30 min toovernight at 4C for the pellet to completely dissolve.3. Store virus in aliquots at -80C. Thaw an aliquot on ice before each use; do notrefreeze.。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基,培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技(上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料(一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒.1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM （含10% FBS).贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0。
25％的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时,去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中.3、细胞计数，将细胞全部晃下,加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10% DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格,每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释）,即为实际 n万/mL 细胞浓度.4、细胞离心,1000rpm，5min。
病毒转染原理及步骤word精品
病毒转染原理及步骤在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。
以慢病毒为例。
慢病毒(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
L■町析*riVMvsIk]?对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。
本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。
一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。
慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。
这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。
二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。
2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。
三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。
2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。
3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。
4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。
5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。
6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。
四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。
2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。
3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。
4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。
5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。
6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。
如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。
慢病毒使用手册
1.慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：如果用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80 ℃冰箱（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）。
A．病毒可以-80 ℃保存6个月，滴度不会明显下降；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。
B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰上融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4 ℃保存(请尽量在三天内用完) 。
1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和细胞建系1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用细胞培养板，如96孔板、24孔板等等检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A.测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B.在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C.我们提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
如：病毒滴度为1E8TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1E8个具有生物活性的慢病毒颗粒。
慢病毒侵染及分子克隆最全知识讲解，学习这一篇就够了！
慢病毒侵染及分子克隆最全知识讲解，学习这一篇就够了！一、慢病毒基础简介二、慢病毒体外包装三、慢病毒体外侵染四、慢病毒滴度测定五、慢病毒体内侵染六、慢病毒质粒构建一、慢病毒基础简介简介：1.慢病毒是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体；2. 逆转录病毒载体；3. 它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力；4. 在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。
形态结构：侵染过程：二、慢病毒体外包装1.人工体外包装生产慢病毒慢病毒包装的条件：①包装细胞（HEK293T)②辅助质粒（RRE , REV, Vsvg)③目的慢病毒质粒④转染2. 过表达目的基因的慢病毒包装①试剂：1）包装细胞（HEK293T)2）辅助质粒（RRE , REV, Vsvg)3）携带GFP基因CDNA的质粒（Fugw-GFP, Plx304)4）脂质体转染②步骤：1)传代293T细胞；2)24h 后，取1.5 ml EP管，加入OPTI-MED，加入RRE , REV, Vsvg，加入携带表达目的基因的Fugw-GFP质粒，混匀，加入脂质体，吹打混匀；3）静止30min,加入到HEK293T 细胞，等待48 h；4）收集上清即为慢病毒。
3.干扰目的基因表达的慢病毒包装①试剂：1）包装细胞（HEK293T)2）辅助质粒（RRE , REV, Vsvg)3）携带干扰目的基因表达的shRNA的质粒（Fugw, PLKO.1)4）脂质体转染②步骤：1）传代293T细胞；2）24h 后，取1.5 ml EP管，加入OPTI-MED，加入RRE , REV, Vsvg，加入携带干扰目的基因表达的质粒PLKO.1 ，混匀，加入脂质体，吹打混匀；3)静止30min,加入到HEK293T 细胞，等待48 h；4）收集上清即为慢病毒。
三、慢病毒体外侵染1.慢病毒体外侵染步骤：①细胞培养箱取出细胞到无菌操作台；②取慢病毒上清直接加入到目的细胞的培养基中，轻轻摇晃；③把细胞放回培养箱，放置2-4 天。
慢病毒转染实验流程
慢病毒转染实验流程英文回答：Lentiviral Transduction Protocol.Materials:Lentiviral vector.Target cells.Transfection reagent (e.g., Polybrene)。
Culture medium.Selection reagent (optional)。
Procedure:1. Prepare virus and target cells:Thaw the lentiviral vector and aliquot it into appropriate volumes for your experiment.Count and prepare the target cells at a suitable density for transduction.2. Add the transfection reagent:Add the transfection reagent (e.g., Polybrene) to the virus-containing solution according to the manufacturer's instructions. Incubate for the recommended time.3. Incubate virus with cells:Add the virus solution to the target cells and incubate for 24-72 hours. The optimal incubation time may vary depending on the target cell type and lentiviral vector used.4. Remove virus and select for transduced cells:Remove the virus-containing medium and wash the cells with fresh culture medium.If desired, select for transduced cells using an appropriate selection reagent (e.g., antibiotic resistance marker or fluorescent protein).5. Culture and analyze transduced cells:Culture the transduced cells in the appropriate medium and conditions.Analyze the cells for transduction efficiency and transgene expression using methods such as flow cytometry, microscopy, or Western blotting.Additional Notes:Optimization of the transduction protocol may be necessary for different target cell types and lentiviral vectors.Safety precautions should be taken when handling lentiviral vectors, as they contain potentially infectious material.The use of a spin infection protocol can enhance transduction efficiency.Transduction can be scaled up or down as needed by adjusting the volumes used.中文回答：慢病毒转染实验流程。
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慢病毒转染增强剂说明书产品描述：
Polybrene（聚凝胺）是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA转染实验以增强脂质体的转染效率。
Polybrene目前广泛用于逆转录病毒介导的基因转染，慢病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。
Polybrene也是一种有名的抗肝素剂（肝素拮抗剂），常用来生产非特异性凝集的红细胞。
另外Polybrene也多用于蛋白测序，因为小剂量的Polybrene在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象。
PVDF膜加入polybrene还能提高膜的亲和性。
注：Polybrene对某些细胞（如末端分化的神经元，DC细胞）毒性较大，初次应用建议先做毒性测试[1]。
基本属性：
别名：1,5-dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide
CAS No.：28728-55-4
纯度：≥94% (titration)
溶解方法：溶于水，溶解能力高达10%。
0.9%Nacl溶液配制1mg/mL
的储存液，可以滤膜除菌或高压灭菌。
保存与稳定性：粉末2-8℃保存，避免潮湿。
1mg/mL储存液2-8℃，至少一年保持稳定。
操作步骤（仅作参考）：
实验1：逆转录病毒感染（Retroviral Infection）
（1）重组逆转录病毒原液的制备：取5ml生长培养基（5%血清）加入约含单层转染逆转录包装细胞的100mm培养盘内。
孵育24h后，吸去培养液并用0.45μm滤器过滤。
（2）待感染细胞的培养：100mm培养盘内加入10ml完全培养基，细胞密度为5×105/盘。
（3）病毒感染：细胞培养24h后，吸去完全培养液。
用含polybrene 的2ml病毒上清（或将病毒原液稀释到2ml）感染细胞，polybrene 的终浓度为5μg-10μg/ml。
37°C孵育3-6h。
（4）收集病毒颗粒：加入8ml完全培养基。
感染3天后，按照1:5的比例用选择培养基裂解细胞。
实验2：转染
（1）完全生长培养基培养细胞,培养细胞密度约50%；
（2）孵育细胞18-24h后准备DNA-培养基-Polybrene混合液，按如下操作制备混合液：①添加完全培养基（60mm培养皿2ml，100mm 培养皿3ml），37°C预热；②添加10ng~10µg质粒轻轻混匀；③加入Polybrene至终浓度为5μg-10μg/ml。
轻轻混匀。
以上每个成分需要按顺序加入。
（3）去除培养基，在细胞中加入DNA-培养基-Polybrene溶液，在37°C孵育细胞6-20h。
细胞培养的前6h内约每1.5h轻柔混匀。
（4）去除DNA-培养基-Polybrene溶液。
用DMSO shock solution （15%DMSO in1X HBSS）轻轻盖住细胞（60mm培养
（5）立即去除DMSO shock solution，用完全生长培养基轻轻清洗细胞2次。
对于60mm培养皿每次用5ml培养液清洗，100mm培养皿每次用10ml培养液清洗。
皿3ml，100mm培养皿4ml）。
每次加入溶液时用手轻晃培养盘10s，使得液体均匀分布。
然后37°C孵育细胞4min。
（6）加入完全培养基到细胞中；
（7）稳定转化：去除生长培养基，按照1:5的比例用选择培养基裂解细胞。
瞬时表达：去除生长培养基，加入新鲜的生长培养基。
24-72h后收获细胞。
使用浓度（详细步骤见文献）：
Polybrene的具体使用浓度依据细胞种类，转染方法等影响，以下使用浓度仅作参考。
（1）为提高腺病毒转染效率和LacZ转基因表达，使用6μg/ml Polybrene处理病毒载体后转入BHK-21细胞（MOI为100），转染率提高到95%，没有用Polybrene处理的只有2.3%转染率[2]。
（2）在KSHV(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus)纯化和转染实验中，浓缩的病毒与8μg/ml Polybrene加到BCBL-1细胞中
37℃下孵育2h[3]。
（3)在逆转录病毒构建研究中，用v-rasHa逆转录病毒转染角质细胞（Keratinocytes）后在含有4μg/ml Polybrene培养基中培养3天，病毒滴度为1×107virus/ml，MOI为1[4]。
（4)在shRNA编码的慢病毒载体的转染研究中，病毒上清中加入8μg/ml Polybrene，转染到HEK293细胞中[5]。
（5)在慢病毒shRNA转染研究中，将含有6μg/ml Polybrene的新鲜培养基加入到培养24h的RCC10细胞中，用慢病毒颗粒转染细胞[6]。