植病研究技术---分子生物学
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技术路线的设计
(一)核酸的释放 正常情况下，无论是DNA还是RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一 步就是破碎细胞，释放核酸。细胞的破碎方法非常多，包括机械法与非机械法 两大类。 机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法。 非机械法可分为干燥法与溶胞法。 目前，大多采用溶胞法。其中采用适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂 解效率高，方法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了 广泛的应用。
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA的纯化）
植物基因组 DNA 的提取(CTAB 法）: 原理：
植物组织中绝大部分是核 DNA ,它和组蛋白、非组蛋白结合在一起,以核蛋白 （即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内. CTAB( 十六烷基三甲基溴化铵, hexadecyltrimethylammonium bromide ,简称 CTAB) 是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中 (0.7mol/L NaCl) 是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度 (0.3mol/L NaCl) 时从 溶液中沉淀,通过离心就可将 CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然 后将 CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀, CTAB 能溶解于乙醇中.
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
(三)核酸质量与提取步骤的关系 一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性 也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多 的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以 选择。
DNA提取液：100mM Tris, 20mM EDTA,1.4M NaCl （ pH8.0 ）
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化
I. 核酸的分离纯化 （DNA的纯化）
植物基因组 DNA 的提取(CTAB 法）:
研钵 匀浆机
微量离心管
微量加样器 (俗称“枪”)
高速离心机 （13000rpm）
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
对无法避免的有害因素，采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。 1. 应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸
完整性的破坏； 2. DNA酶(DNase或DNAase)的激活需要Mg2+，Ca2+等二价金属离子，若使用
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
保证核酸的完整性，在操作过程中，首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破 坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理，化学与生物学的因素。
有些因素是可以避免的： 1. 如过酸或过碱，对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，在核酸的提取过程
中，采用适宜的缓冲液，始终控制pH在4～10之间，就可以很好地避免其危 害； 2. 如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因 煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的条件下进行。
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 1. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
核酸分离纯化的原则： ① 一是保证核酸一级结构的完整性，因为完
整的一级结构是核酸结构和功能研究的最 基本的要求； ② 二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸 样品的纯度
ຫໍສະໝຸດ Baidu
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
中心法则
• 遗传信息在细胞内的生物大分子间转移的基本法则。
RNA
DNA---RNA---蛋白质
一．DNA/RNA/蛋白质的提纯
1. 生物大分子的分离与纯化 2. 基因工程
二．DNA/RNA/蛋白质的序列与结构
1. DNA序列与结构 2. RNA序列与结构 3. 蛋白质序列与结构
三．DNA/RNA/蛋白质的检测与功能分析
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （RNA的纯化）
植物基因组 RNA 的提取----RNA 易降解
DEPC：
焦碳酸二乙酯 (DEPC）是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶 活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。DEPC能与胺和巯基 反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。 闻起来香香甜甜的，可是害人不眨 眼！怀疑是致癌剂。开瓶时将瓶子远离你，内压可导致溅泼。操作时戴合适的手套，穿 工作服，并在化学通风橱里进行。
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （RNA的纯化）
植物基因组 RNA 的提取----RNA 易降解
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
(二)核酸的分离与纯化 利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效方案加以分离。这 种差异是多方面的，包括细胞定位与组织分布上的差异，物理化学性质上的不 同以及各自独特的生物学特性。 应该去除的污染物主要包括三个部分:即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸 分子和在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。 非核酸大分子污染物主要包括蛋白质，多糖和脂类物质等； 非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RNA为污染物，制备RNA时，DNA为污染 物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物； 在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影 响，往往需要很好地去除。
EDTA，柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。 3. RNA酶(RNase或RNAase)的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是
RNA提取过程中的主要危害因素。
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
中心法则
• 遗传信息在细胞内的生物大分子间转移的基本法则。 • 指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完
成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA， 即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循 的法则。在某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等） 和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致 癌病毒）是对中心法则的补充。
整体水平乃至群体水平等不同层次上的生物学问题。而分子生物学则着重在 分子（包括多分子体系）水平上研究生命活动的普遍规律； ②在分子水平上，分子生物学着重研究的是大分子，主要是蛋白质，核酸，脂质 体系以及部分多糖及其复合体系。而一些小分子物质在生物体内的转化则属 生物化学的范围； ③分子生物学研究的主要目的是在分子水平上阐明整个生物界所共同具有的基本 特征，即生命现象的本质；而研究某一特定生物体或某一种生物体内的某一 特定器官的物理、化学现象或变化，则属于生物物理学或生物化学的范畴。
1. RNase 是RNA制备的杀手 RNase酶非常稳定,是导致RNA降解最主要的物质.它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素 去除后有迅速复性.用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活.
2. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理 (a)塑料制品：原则上都必须处理方可使用.处理方法如下： (1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%. (2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部 分都浸泡到溶液中. (3)在通风柜中室温处理过夜. (4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压 蒸气灭菌至少30分钟. (5)烘箱用合适的温度烘烤至干燥.置于干净处备用. (b)玻璃和金属物品: 250°C烘烤3小时以上.
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
(四)核酸的浓缩，沉淀与洗涤 沉淀是核酸浓缩最常用的方法，核酸沉淀后，可以改变溶解缓冲液和调整核酸 溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的 纯化作用。 加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠，醋 酸钾，醋酸铵，氯化钠，氯化钾及氯化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇，异丙 醇和聚乙二醇。 核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除。对于浓度 低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁 醇对其进行浓缩处理。
植病研究技术---分子生物学
2013-2014第一学期
植病研究技术
---分子生物学技术
主讲：原雪峰
分子生物学
在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分 子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面来阐 明各种生命现象的本质。
分子生物学和生物化学及生物物理学关系十分密切，它们之间的主要区别在于： ①生物化学和生物物理学是用化学的和物理学的方法研究在分子水平，细胞水平，
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
植物基因组 DNA 的提取-DNA 的完整性:
VS
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （RNA的纯化）
植物基因组 RNA 的提取----RNA 易降解
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化
I. 核酸的分离纯化 （DNA的纯化）
植物基因组 DNA 的提取(CTAB 法）:
在 DNA 提取过程中必须始终注意以下几个关键问题: (1) DNA 的二级结构和双链易受多种因素（如强酸/碱、加热、低盐、有机溶剂、酰胺类 等）的影响引起双链解开,即“变性”,因此抽提时避免使用变性的条件. (2)抑制内外源 DNase 的活力. 方法：a 、低温操作； b 、调节 pH ,使偏碱(pH8.0)； c 、抽 提液中加表面活性剂； d 、加螯合剂(EDTA)除去酶的铺助因子(Mg2+),使酶活性丧失. (3)防止化学降解.如过酸或过碱,会使 DNA 降解,一般综合考虑,取 pH8.0 左右为宜. (4)防止物理因素降解.如温度太高或机械张力剪切等, DNA 分子特别大,极易被机械张力拉 断,甚至在细管中稍急一些的流动也会使 DNA 断裂,所以在抽提过程中要特别注意这一点, 操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数,也不要剧烈摇动. (5)植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用. 因此,一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取 DNA 的材料,这是因幼嫩的新 生组织次生代谢物较少, DNA 含量高,且易于破碎,植物材料最好是新鲜的.
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化
I. 核酸的分离纯化 （DNA的纯化）
植物基因组 DNA 的提取(CTAB 法）: 操作方法:
(1)取 200mg 样品 ( 在液氮中研磨成粉末状 ) 放入 1.5mL 离心管中,加入 600μL DNA 提取液,颠倒混匀 5-6 次. 65 ℃ 保温 35 分钟以上,其间颠倒混匀一次. (2)再加等体积的氯仿/异戊醇 (24 : 1) 溶液轻轻摇晃 30 秒,在 4 ℃ 下 10000rpm离 心 10 分钟后,取吸上清液 (450μL) (3)再加两倍体积的预冷异丙醇,混匀静止 10 分钟以上,在 4 ℃ 下 10000rpm离心 10 分钟后,弃上清. (4)用 600μL70% 乙醇洗涤沉淀,重复一次,在室温下倒置晾干. (5)沉淀用 TE 溶液溶解 DNA ,再加入 RNase 至终浓度 50μg/mL ,在 37 ℃ 下保温半 小时,将 DNA 样品放入冰箱保存.
(一)核酸的释放 正常情况下，无论是DNA还是RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一 步就是破碎细胞，释放核酸。细胞的破碎方法非常多，包括机械法与非机械法 两大类。 机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法。 非机械法可分为干燥法与溶胞法。 目前，大多采用溶胞法。其中采用适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂 解效率高，方法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了 广泛的应用。
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA的纯化）
植物基因组 DNA 的提取(CTAB 法）: 原理：
植物组织中绝大部分是核 DNA ,它和组蛋白、非组蛋白结合在一起,以核蛋白 （即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内. CTAB( 十六烷基三甲基溴化铵, hexadecyltrimethylammonium bromide ,简称 CTAB) 是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中 (0.7mol/L NaCl) 是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度 (0.3mol/L NaCl) 时从 溶液中沉淀,通过离心就可将 CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然 后将 CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀, CTAB 能溶解于乙醇中.
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
(三)核酸质量与提取步骤的关系 一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性 也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多 的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以 选择。
DNA提取液：100mM Tris, 20mM EDTA,1.4M NaCl （ pH8.0 ）
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化
I. 核酸的分离纯化 （DNA的纯化）
植物基因组 DNA 的提取(CTAB 法）:
研钵 匀浆机
微量离心管
微量加样器 (俗称“枪”)
高速离心机 （13000rpm）
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
对无法避免的有害因素，采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。 1. 应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸
完整性的破坏； 2. DNA酶(DNase或DNAase)的激活需要Mg2+，Ca2+等二价金属离子，若使用
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
保证核酸的完整性，在操作过程中，首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破 坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理，化学与生物学的因素。
有些因素是可以避免的： 1. 如过酸或过碱，对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，在核酸的提取过程
中，采用适宜的缓冲液，始终控制pH在4～10之间，就可以很好地避免其危 害； 2. 如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因 煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的条件下进行。
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 1. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
核酸分离纯化的原则： ① 一是保证核酸一级结构的完整性，因为完
整的一级结构是核酸结构和功能研究的最 基本的要求； ② 二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸 样品的纯度
ຫໍສະໝຸດ Baidu
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
中心法则
• 遗传信息在细胞内的生物大分子间转移的基本法则。
RNA
DNA---RNA---蛋白质
一．DNA/RNA/蛋白质的提纯
1. 生物大分子的分离与纯化 2. 基因工程
二．DNA/RNA/蛋白质的序列与结构
1. DNA序列与结构 2. RNA序列与结构 3. 蛋白质序列与结构
三．DNA/RNA/蛋白质的检测与功能分析
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （RNA的纯化）
植物基因组 RNA 的提取----RNA 易降解
DEPC：
焦碳酸二乙酯 (DEPC）是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶 活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。DEPC能与胺和巯基 反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。 闻起来香香甜甜的，可是害人不眨 眼！怀疑是致癌剂。开瓶时将瓶子远离你，内压可导致溅泼。操作时戴合适的手套，穿 工作服，并在化学通风橱里进行。
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （RNA的纯化）
植物基因组 RNA 的提取----RNA 易降解
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
(二)核酸的分离与纯化 利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效方案加以分离。这 种差异是多方面的，包括细胞定位与组织分布上的差异，物理化学性质上的不 同以及各自独特的生物学特性。 应该去除的污染物主要包括三个部分:即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸 分子和在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。 非核酸大分子污染物主要包括蛋白质，多糖和脂类物质等； 非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RNA为污染物，制备RNA时，DNA为污染 物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物； 在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影 响，往往需要很好地去除。
EDTA，柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。 3. RNA酶(RNase或RNAase)的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是
RNA提取过程中的主要危害因素。
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
中心法则
• 遗传信息在细胞内的生物大分子间转移的基本法则。 • 指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完
成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA， 即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循 的法则。在某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等） 和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致 癌病毒）是对中心法则的补充。
整体水平乃至群体水平等不同层次上的生物学问题。而分子生物学则着重在 分子（包括多分子体系）水平上研究生命活动的普遍规律； ②在分子水平上，分子生物学着重研究的是大分子，主要是蛋白质，核酸，脂质 体系以及部分多糖及其复合体系。而一些小分子物质在生物体内的转化则属 生物化学的范围； ③分子生物学研究的主要目的是在分子水平上阐明整个生物界所共同具有的基本 特征，即生命现象的本质；而研究某一特定生物体或某一种生物体内的某一 特定器官的物理、化学现象或变化，则属于生物物理学或生物化学的范畴。
1. RNase 是RNA制备的杀手 RNase酶非常稳定,是导致RNA降解最主要的物质.它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素 去除后有迅速复性.用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活.
2. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理 (a)塑料制品：原则上都必须处理方可使用.处理方法如下： (1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%. (2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部 分都浸泡到溶液中. (3)在通风柜中室温处理过夜. (4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压 蒸气灭菌至少30分钟. (5)烘箱用合适的温度烘烤至干燥.置于干净处备用. (b)玻璃和金属物品: 250°C烘烤3小时以上.
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
(四)核酸的浓缩，沉淀与洗涤 沉淀是核酸浓缩最常用的方法，核酸沉淀后，可以改变溶解缓冲液和调整核酸 溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的 纯化作用。 加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠，醋 酸钾，醋酸铵，氯化钠，氯化钾及氯化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇，异丙 醇和聚乙二醇。 核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除。对于浓度 低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁 醇对其进行浓缩处理。
植病研究技术---分子生物学
2013-2014第一学期
植病研究技术
---分子生物学技术
主讲：原雪峰
分子生物学
在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分 子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面来阐 明各种生命现象的本质。
分子生物学和生物化学及生物物理学关系十分密切，它们之间的主要区别在于： ①生物化学和生物物理学是用化学的和物理学的方法研究在分子水平，细胞水平，
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （DNA、RNA的纯化）
植物基因组 DNA 的提取-DNA 的完整性:
VS
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化 I. 核酸的分离纯化 （RNA的纯化）
植物基因组 RNA 的提取----RNA 易降解
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化
I. 核酸的分离纯化 （DNA的纯化）
植物基因组 DNA 的提取(CTAB 法）:
在 DNA 提取过程中必须始终注意以下几个关键问题: (1) DNA 的二级结构和双链易受多种因素（如强酸/碱、加热、低盐、有机溶剂、酰胺类 等）的影响引起双链解开,即“变性”,因此抽提时避免使用变性的条件. (2)抑制内外源 DNase 的活力. 方法：a 、低温操作； b 、调节 pH ,使偏碱(pH8.0)； c 、抽 提液中加表面活性剂； d 、加螯合剂(EDTA)除去酶的铺助因子(Mg2+),使酶活性丧失. (3)防止化学降解.如过酸或过碱,会使 DNA 降解,一般综合考虑,取 pH8.0 左右为宜. (4)防止物理因素降解.如温度太高或机械张力剪切等, DNA 分子特别大,极易被机械张力拉 断,甚至在细管中稍急一些的流动也会使 DNA 断裂,所以在抽提过程中要特别注意这一点, 操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数,也不要剧烈摇动. (5)植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用. 因此,一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取 DNA 的材料,这是因幼嫩的新 生组织次生代谢物较少, DNA 含量高,且易于破碎,植物材料最好是新鲜的.
一. DNA/RNA/蛋白质的提纯
---生物大分子的分离纯化
I. 核酸的分离纯化 （DNA的纯化）
植物基因组 DNA 的提取(CTAB 法）: 操作方法:
(1)取 200mg 样品 ( 在液氮中研磨成粉末状 ) 放入 1.5mL 离心管中,加入 600μL DNA 提取液,颠倒混匀 5-6 次. 65 ℃ 保温 35 分钟以上,其间颠倒混匀一次. (2)再加等体积的氯仿/异戊醇 (24 : 1) 溶液轻轻摇晃 30 秒,在 4 ℃ 下 10000rpm离 心 10 分钟后,取吸上清液 (450μL) (3)再加两倍体积的预冷异丙醇,混匀静止 10 分钟以上,在 4 ℃ 下 10000rpm离心 10 分钟后,弃上清. (4)用 600μL70% 乙醇洗涤沉淀,重复一次,在室温下倒置晾干. (5)沉淀用 TE 溶液溶解 DNA ,再加入 RNase 至终浓度 50μg/mL ,在 37 ℃ 下保温半 小时,将 DNA 样品放入冰箱保存.