基因工程第五章

优 点
可以用T4连接酶连接任何DNA平端
? 5’-突出粘性末端的补齐
可用Klenow聚合酶补齐
? 3’-突出粘性末端的削平
可用T4 DNA聚合酶削平
主 要 问 题
连接效率低
? 高浓度的底物和T4 DNA连接酶
? 添加凝聚剂：如聚乙二醇
不易回收外源DNA片断
双向插入
三、修饰黏末端连接
? 同聚物加尾法：
同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。
SalⅠ片段（CAGCTG） XhoⅠ 片段(GAGCTC)
? 若均不是以上情况呢？
二、平末端的连接
平末端连接(blunt end ligation)：
在T4DNA连接酶的作用下，将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。
Gateway技术：
一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway技术的灵活性：
? 整合后的附着位点为
二、重组DNA导入大肠杆菌
重组DNA转移到大肠杆菌细胞内的过程
1.吸附：双链DNA分子吸附在受体菌表面
2.转入：双链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体菌，另一链降解；
3.自稳：外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状；
4.表达：供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。
? 用限制性内切酶如XcmI, HphI, 与MobII 酶切产生3‘末端未配对的T；
? 应用末端转移酶与双脱氧TTP加入一个突出的T残基到线形化载体的3’末端。
? 应用不依赖末端的Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性在线形化载体的3‘末端出的羟基基团上催化连接上一个T碱基。
五、Gateway载体构建系统
? cDNA 克隆的结果
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实验结果
制备的样品 1 2 3
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在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结果，在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落。在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一次，所有的平板上都没有菌落生长。接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子。从实验平板上挑出12个菌落，分离了质粒DNA，并用BamHI进行切割，其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个cDNA片段，实验终于获得成功。
对照1 只有细胞 TMTC 0 0
对照2 未切的载体 TMTC 0 >1000
对照3 省去磷酸酶处理，无cDNA TMTC 0 435
对照4 无cDNA TMTC 0 25
实验样品 TMTC 0 34
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通过在PCR引物序列的5’端突变一个或几个碱基，创造出限制酶识别位点的方法。
2.T-A克隆
利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在70～75℃活性高)，使PCR产物的3′末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3′粘性末端含一个T的线性克隆载体中.
? T载体的构建：
思考题：
试述 DNA片段的体外连接方式？
练习题：
打算将一个cDNA克隆到一个表达载体，以便在E．coli中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA的两侧具有BamHI的位点，因此计划将它从BamH[的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用BamHI切割以后，立即用碱性磷酸酶处理除去5’磷酸；接着将处理过的载体同用BamHI切割的cDNA片段混合，加入DNA连接酶后进行温育，连接之后，将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因，所以，转化的细菌能够存活。
第五章 基因的体外重组和转化
第一节 DNA片段的体外连接
第二节 重组体导入细菌细胞
一、黏性末端的连接
黏性末端连接(Cohesive end ligation)：
具有黏性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。
DNA接头（adapter）是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。
? 讨论
如何将一平末端的DNA片段与BamHⅠ形成的粘性末端连接？（P156.4）
四、PCR产物的连接
1.限制性内切酶酶切位点引入法
? 在引物上添加或引入限制酶识别位点，使PCR产物两端带有相应的限制酶识别位点，进一步与相应载体进行连接。
? 转导(transduction):重组体包装成噬菌体导入受体细胞的过程。
一、大肠杆菌感受态的制备
感受态：细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态就称为感受态。
1970年Mandel和Higa发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA。此后不久，Cohen等人用CaCl2法实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，操作原理如下：
attL（BOP’）
attR（POB’）
? 整合位点---attB attP
切除位点---attL attR
? 整合过程需要介导蛋白和重组位点。
第二节、重组体导入细菌细胞
? 转化(transformation):受体细胞捕获并表达质粒DNA的生命过程；
? 转染(transfection):受体细胞捕获并表达噬菌体DNA的生命过程；
优 点
? 经济省时，操作方便；
? 外源片段容易回收；
问 题
? 载体自身环化
? 插入片段可双向插入
2.不同限制酶酶切产生黏末端的连接
? 载体和目的基因分子上有两个相同的酶切位点
? 载体和目的基因只有一个相同的限制酶识别位点
? 无相同的限制酶识别位点，有同尾酶 Fra bibliotek！！注意
①添加保护序列
? Primer1:
5' GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
? Primer2:
5‘ GCGGggatccTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
②引入的酶切位点是单一的
（2）利用突变在引物5‘端引入酶切位点
? 注：TMTC=too many to count，多到无法计数。
? (1)你如何看待第一次的实验结果?对照1的目的是什么?
? (2)影响第二次实验结果的原因是什么?对照2的作用何在?
? (3)对照3和4各有什么作用?
? (4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体?
优 点
①不会发生自身环化作用；
②连接效率较高；
存在问题
? 操作繁琐
? 外源片段难回收
? 可能会影响基因表达
? 衔接物连接法
衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由8～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。
? DNA接头法：
实验中同时设置了4个对照：
? 对照1： 将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上；
? 对照2： 将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上；
? 对照3： 将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养乎板上；
? 对照4： 将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用DNA连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养子板上。
? 将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，再加入DNA，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。