微生物实验

二、实验目的和意义
1.掌握大肠杆菌在选择培养基上生长特点 大肠杆菌在 SS.Maccokey 平板均可以正常生长，在麦康凯琼脂（弱选择培养基）上形成 圆形凸起、光滑、湿润的直径 2~3 毫米的粉红色菌落；镑检可见杆状的红色短杆菌。在 SS 培养基（强选择培养基）上形成圆形凸起、表面光滑、边缘整齐中等大小直径 2~3 毫米红色 菌落，能分解乳糖，不产生硫化氢。掌握大肠杆菌在培养基上的生长与分布，对以后的科学 研究打好基础。 2.掌握大肠杆菌菌群的生化反应 细菌和其他生物一样，具有一定的化学组成和物理性状。细菌在新陈代谢过程中进行着 各种生物化学反应。因细菌的种类不同，催化这些反应的酶类及其活性也都有所差异，代谢 过程中所产生的代谢产物亦各不相同。故可利用生化反应的方法，测定细菌的各种代谢产物， 借以区别和鉴定细菌。 大肠杆菌代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体 的危害，还能合成维生素 B 和 K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。因此掌握大肠杆菌的生化 反应鉴别大肠杆菌十分有必要和意义。 大肠杆菌生化反应分为初步生化反应和系统生化反应，利用生化反应可以对大肠杆菌进 行鉴别，同时也可以加深对大肠杆菌的一些生物学特性的了解，为以后的科学研究打下基础。 3.掌握大肠杆菌的鉴定要点； 大肠杆菌可以通过细菌的革兰氏染色、生化反应来鉴定。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，革 兰氏染色后应为红色。 4 掌握大肠杆菌的药敏实验； 用自制药敏试纸对所鉴定出的大肠杆菌进行耐药性检测，分别测出其抑苗圃的大小。一 般直径大于 15-20 毫米为高敏．直径 10—15 毫米为中敏，直径小于 10 毫米为低敏，没有抑 菌圈可以判断为不敏感 抗菌药对细菌性传染病的控制起到了非常重要的作用，但由于治疗过程中不科学 的、盲目的滥用抗菌药，很多致病性细菌产生了耐药性，使得抗菌药对细菌性疾病的 控制效果越来越差，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给病人造成了很大的经济 损失。 随着新型致病菌的不断出现，抗菌药的防治效果越来越差。并且各种致病菌对不
指导教师： 指导教师： 实验日期： 实验日期：
安徽理工大学医学院 二○一一 年 三 月
一、实验概述
细菌属典型的原核细胞型微生物，无核膜、核仁，核呈环状裸 DNA 团块结构。其种类多、数量 大、分布广，绝大多数对人类是有利的，有些还是人类所必需的，仅少数细菌可使人类致病或条件 致病。自荷兰学者列文虎克（Antory Van Leeuwenhoek，1632～1723）1676 年用自磨镜片制造了世 界上第一架显微镜（约放大 40～270 倍） ，从雨水、池塘水等标本中第一次观察和描述细菌以来， 不断有新的细菌被发现，有些还与人类的致病性密切相关，如大肠杆菌 O157 等。 肠道菌群是指一大类存在于人类和动物肠道内的形态、生物学特性十分相似的 G-杆菌，大多 数细菌对人体有益，如大肠杆菌能合成人体所需的 VitB12、VitK、叶酸等。少数细菌可引起人类腹 泻或肠外感染，如志贺氏菌属、沙门氏菌属等。肠道条件致病菌是指一部分细菌通常情况下对人体 无害，但在一定条件下（如人体免疫功能低下、危重病人、慢性病患者、寄居部位改变、抗生素滥 用致菌群失调时）能够引起感染，称为条件致病菌。近年来，因条件致病菌所致的感染在临床感染 中所占比率逐渐增加。 大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）)是人和动物肠道中最主要和数量最多的一种 G-短杆菌，大小 0.5×1～3µm，周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类，产酸、产气，是人和动物肠道中采集 的正常菌。 其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长， 减少蛋白质分解产物对人体的危害， 还能合成维生素 B 和 K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。 大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小 0.5×1～3 微米。周身鞭毛，能运 动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳 进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产 物对人体的危害， 还能合成维生素 B 和 K， 以及有杀菌作用的大肠杆菌素。 正常栖居条件下不致病。 但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的 1/3。兼性厌氧菌。在 环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便 污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物 （或药物）的卫生学标准。 （国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过 3 个）大肠杆菌的抗原 成分复杂，可分为菌体抗原（O） 、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K） ，后者有抗机体吞噬和抗补体的 能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为 150 多型，其中有 16 个血清型为致病性大肠杆菌， 常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是 1954 年在大肠杆菌 K12 菌株中发现的。莱德伯格（Lederberg）采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进 行实验，奠定了研究细菌接合方法学上的基础，以及基因工程的研究。
大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。它侵入人 体一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为 胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。 大肠杆菌（E. coli）为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多不致病，为人和动物肠道中的常 居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称致病性大肠 杆菌。 该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经 60 分钟或 60℃加热 15 分钟仍有部分细菌存活。 在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑 制作用。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有 R 因子的质粒转移而获得的。 细菌在新陈代谢过程中进行着各种生物化学反应。细菌的种类不同，其代谢的酶类及其活性也 有所差异，代谢过程中所产生的代谢产物亦各不相同。利用生物化学的方法测定细菌在新陈代谢过 程中所产生的代谢产物以鉴定细菌的种类，称为细菌的生化反应。采用的生化反应包括初步生化反 应和系统生化反应。 药敏试验指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原菌有无抑制作 用，因其不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对较低，是一种既经济又有效 的方法，可为临床合理应用抗生素，预防耐药菌株的出现，提供重要实验依据。 本实验以大肠杆菌为样品，探讨大肠杆菌菌群的分离、培养、鉴定和药敏，了解大肠杆菌菌群 分布状况及对常用抗生素的敏感性，为预防大肠杆菌感染和合理使用抗生素提供实验依据。
三级学科
工业微生物学 工业微生物学
项目编号码__________
项目——导师制实验报告 项目——导师制实验报告 ——
实验名称： 实验名称： 分离培养
学生姓名： 学生姓名：_________________________________ 年 专 级： 业：
同的抗菌药物的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也有差异。 长期以来，各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药物往往失去药效，以及不能很 好的掌握药物对细菌的敏感度，所以，用药敏实验进行药物敏感度的测定，可供临床 医师选用抗菌药物的参考，以便准确有效的利用药物进行治疗。
三、实验应具备的物质条件
2、仪器：Olympus 显微镜（日本 Olympus 公司产） 、仪器： ，VS-800 型超净工作台（苏州净化装备有限公 司） 37℃恒温培养箱， ， Microfuge 18 型高速离心机 （美国 Beckman 公司产） 5415D 型速离心机 ， （德 国 Eppendorf 公司产） ，电泳仪，电泳槽，移液器；BP-Ⅱ型架盘药物天平（上海医用激光仪器厂） ， YXQ SG41.280 型便携式高压灭菌锅（上海华线医用核子仪器有限公司） ，电炉（1500w） ； 3、其它：PH 试纸，平皿，称量纸，量筒、三角烧瓶、烧杯、接种环，接种针，酒精灯，二甲苯， 、其它： 香柏油，檫镜纸，无齿镊子，玻片，记号笔，Eppendorf 管，Tip 头（20µl、200µl） 、Tip 头盒、铝 制饭盒等。
1、试剂：SS、MacConkey 培养基；KIA、MIU 初步生化反应管；系统生化反应管；志贺氏菌属、 、试剂： 沙门氏菌属多价及单价诊断血清；药敏纸片；Gram’s stain 染色液，氧化酶、触酶试剂。 琼脂粉（日本进口分装，批号：；布氏肉汤粉（杭州微生物试剂有限公司，批号：20050527） ） ； 克氏双糖铁（KIA）琼脂（杭州微生物试剂有限公司，批号：20060622） ；营养琼脂（北京奥博星 生物技术有限责任公司，批号：20080808） ；SS 琼脂（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号： 20080708） ；Macconkey 琼脂（杭州微生物试剂有限公司，批号：20060928）；药敏纸片（杭州微 ； 生物试剂有限公司。丙氟哌酸，批号：100823,5ug/片；庆大霉素，批号：100915,10ug/片； 头孢氨噻肟，批号：090819,30ug/片；氯霉素，批号：100915,30ug/片；）系统生化反应管 （蔗糖，批号：20100819；纤二糖，批号：20100819；麦芽糖，批号：20100819；硫化氢， 批号：20100927；赖氨酸，批号：20100916；ONPG,批号：20100906 等）
四、注意事项
1、可疑菌落的鉴别； 2、生化反应的判断和分析； 3、药敏试验分析； 4、细菌的裂解。
五、实验设计原理
1、采用分离划线法分离培养可疑菌落； 接把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通 过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种 单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反 复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀 释而达到分离目的的。种环每次划线都会造成菌体分布更为稀疏，最终达到单菌落 2、采用初步生化反应和系统生化反应鉴定肠道致病菌和肠道条件致病菌； 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存 在差别。细菌的这种代谢方式可供鉴别细菌之用。用生理生化试验的方法检测细菌对各种基 质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称为细菌的生理生化反应。有些细菌能 发酵葡萄糖，而不能分解乳糖；有些细菌能分解某种糖产生有机酸和气体；有的细菌则只产 酸不产气 1）初步生化试验：一、克氏双糖铁（KIA）实验：KIA 是含葡萄糖、乳糖、酚红和枸橼 酸铁的蛋白胨琼脂培养基，未接种前是粉红色。对培养基进行穿刺接种，培养一定时间后进 行观察。凡培养基变为黄色及产生气泡则表示该菌发酵此糖产酸产气，凡培养基不变色的， 表示该菌不发酵此糖。培养基变黑表示产生硫化氢。二、动力-吲哚-尿素（MIU）试验：MIU 是含胰蛋白、酚红、尿素的复合培养基。用接种针通过培养基中心接种，培养一定时间后进 行观察。凡细菌有鞭毛能运动者，则部分或全部半固体琼脂变馄浊．凡不运动者细菌仅在穿 刺线上生长，穿刺线外围培养基仍然透明。 （2）系统生化反应：对分别含有麦芽糖、木糖、蔗糖、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、甘露 醇、硫化氢、ONPG 等物质的培养基进行穿刺接种，培养一定时间后进行观察。凡培养基前 后颜色发生变化的，表明大肠杆菌对此物质具有分解作用。 3、大肠杆菌的 Gram’s stain 染色、镜检原理： (1).通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物， 革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因 失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘 复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、 肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网