8 抗体酶、核酶和极端酶
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可找出其结构功能域和必需基团，据此可进 行分子改造，以获得分子更小的、高效的 ribozyme
研究热点：
从催化分子内反应的自我剪切ribozyme设计
出催化分子间反应的ribozyme.
Ribozyme的固定化
Ribozyme的固定化已成功，将在医学、工业上获得应用。
意义： 对各种RNA-蛋白质复合物酶的分离鉴定，对许多具有特别 重要生物功能的RNA和蛋白质构成的颗粒体。在自然界将会 发现更多的具有自我剪接或自我剪切的RNA分子和以非RNA
+GpN
2）Ⅱ类内含子的自我剪接
Ⅱ型IVS是与细胞核mRNA前体的IVS结构
相似的间隔序列。通过转磷酸酯反应， 生成成熟的RNA及套环状的IVS。催化的 剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但 仍需要镁离子(Mg2+)。 剪接机制
2‘
p 5‘
HO-A
Ⅱ
p
3‘
套环的形成
Mg 2+
3’
OH
p-A
p
外显子连接 p
剪切位点
•四个螺旋区、三
个连接区和两个环。 •剪切反应发生在 底物识别序列GUC 的5‘端。
3‘ 5‘
2) 异体催化剪切型
核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶， 是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前 体的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH 和 5’-磷酸末端。
RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。
3 引入法
将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结
合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可 利用蛋白质工程和基因工程技术
引入法举例
四、抗体酶的应用
1.戒毒:
用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半 抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解， 水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。
2. 肿瘤治疗
3‘
GOH 3’ G-IVS
5’GAAA 19nt L-19IVS
1、转核苷酸作用
2CpCpCpCpC
2、水解作用 CpCpCpCpC 3、转磷酸作用
CpCpCpCpCpC
+CpCpCpC CpCpCpC + pC
CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpUpCpUpN CpCpCpCpC +Pi +G CpUpCpU 5、限制性内切酶作用
自然界存在催化分子内反应（in cis）的
ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)和催化 分子间反应(in trans)的ribozyme。
自我剪接ribozyme分类
自我剪接ribozyme可分为两类：
Ⅰ型IVS：均与四膜虫大核rRNA前体的IVS结构相似、催化 自我剪接需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+参与。 Ⅱ型IVS ：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中
蛋白质类：天然酶
极端酶 抗体酶 生物催化剂 （Biocatalyst）
enzyme
extremozyme abzyme
生物工程酶 核酸类:
Ribozyme Deoxyribozyme
克隆酶
其它：模拟酶
遗传修饰酶 蛋白质工程新酶 、
二、核酶的分类
I型内含子
剪接型核酶
II型内含子
锤头核酶 剪切型核酶 发夹核酶 自体催化 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP 异体催化
ribozyme的发现
80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的
Thomas Cech和美国耶鲁大学的Sidnery
Altman各自独立地发现RNA具有生物催化功
能.从而改变了生物催比剂的传统概念。
为此，T.Cech和S.Altman共同获得了1989
年度诺贝尔化学奖。
一、核酶的概念
具有生物催化功能的RNA。
的IVS相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，
但仍需Mg2+
2．自我剪切ribozyme的分类
自我剪切ribozyme, 自我剪切的RNA结构有
锤头结构和发夹结构，其中尖头指出自我剪 切的部位。 自我剪接ribozyme：包含剪切与连接两个步 骤。
几种能进行自我剪切的RNA结构
催化分子间反应的ribozyme的分 类
为底物的ribozyme
第三节 极端酶（extremozyme）
一、极端微生物和极端酶
1.极端微生物：
又称嗜极菌（extremophiles），是在
超常生态环境条件下生存的微生物。
根据所耐受的环境条件不同，分为：
嗜热菌（thermophiles） 超嗜热菌（hyperthermophiles） 嗜冷菌（psychrophiles） 嗜盐菌（halophiles） 嗜酸菌（acidophiles） 嗜碱菌（alkaliphiles）
对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与
骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆
抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。
2. 拷贝法
用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗 体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化， 获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选， 获得具有原来酶活性的抗体酶。
缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产 生新酶.
类 内 含 子 的 剪 接 机 制
P-A
HO 3’
2.剪切型核酶
这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。 1）自体催化剪切型 剪切机制
剪 切 机 制
转酯化过程：
由靠近切割 位点3‘端的2’OH或 氧原子对切割位
点的磷原子实施
亲核攻击，产生
5‘-OH 和2’，3‘环磷酸二酯。
核酶自身剪切反应
锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图
pGpA 5' UO H G pU
第二次转酯反应 5' pGpA 5' U pU 3'
3'
GO H3'
IVS 5‘
UCUAAA Pre-rRNA
A A A
GUAA
3‘
四 膜 虫 前 体 自 我 剪 接 反 应
rRNA
5‘
UCU
pGOH
GUAA
3‘
5‘GAAA GUAA 3‘
5‘
UCUoH3’
5‘
UCUUAA rRNA
7. 光诱导反应
a.光聚合反应（二聚作用）
b.光裂解反应
研究展望
1． 研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功
能间关系的一般规律。 2． 获得一类新型的蛋白酶。 3． 催化天然酶不能催化的反应。
第二节 核 酶（Ribozyme)
一、核酶的概念 二、核酶的种类 三、核酶的应用 四、核酶面临的问题 五、影响核酶活性的因素
抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放出 肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶 通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给 药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体
酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。
抗体酶的催化反应
1．酰基转移反应
2．重排反应
3．氧化还原反应
5．磷酸酯水解反应
6．磷酸酯闭环反应
五、影响核酶活性的因素
1、pH值对活性的影响： pH7.0- 7.5时核酶活性最高。 2、二价金属阳离子对活性的影响: Mg2+ 4、变性剂对活性的影响: 5、温度对活性的影响: Mn2+
3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应
Ribozyme研究进展与展望
对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。
三、核酶的应用
1. 基础理论：生命起源的探索 2. 医药： 1）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达， 抑制效率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免 疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV- Ⅰ)、抗肿瘤。 2）免疫原性低，很少引起免疫反应。 3. 植物抗病毒
四、核酶面临的问题
1、核酶催化效率低。
2、核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶 RNase破坏。
二、抗体酶的定义
抗体酶又称催化抗体（catalytic antibody），是抗体的高度选择性和酶 的高效催化能力巧妙结合的产物，本 质上是一类具有催化活力的免疫球蛋 白，在其可变区赋予了酶的属性。
三、抗体酶的制备 1. 诱导法
用设计好的半抗原，通过与载体蛋白
（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后
3’ HO-G
GMP,GDP,GTP
Ⅰ
p 5‘
P-G 3’ OH
p Mg
2+或Mn 2+
p
类 内 含 子 的 剪 接 机 制
3‘ HO
p
P-G
外显子
内含子或居间序列 （Intervening sequence,IVS)
内含子
5'
5'外显子
3'外显子 U pA G pU 3'
第一次转酯反应
pG-OH
•三个双螺旋区。 •13个核苷酸残基 保守序列。
•剪切反应在右上 方GUX序列的3‘端 自动发生。
发夹（hairpin ）结构
1989年汉普（Hample）研究烟草环斑病毒 （sTRSV）的负链RNA的自我剪切反应，提 出发夹结构（hairpin structure）模型。
发夹核酶结构模型
发夹二级结构模型
如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多 种分子间反应。
1.剪接型核酶
剪接型核酶的作用机制是通过既剪
又接的方式除去内含子（Intron)。
1）I类内含子的自我剪接(Self-splicing)
I型IVS是与四膜虫26srRNA前体的IVS结构 相似的间隔序列，具有环状结构。通过转 磷酸酯反应，生成成熟的26srRNA及G-IVS， G-IVS经两次环化生成L-19IVS。催化过程 需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。 剪接机制 L-19IVS在体外的多种酶活性
抗体酶 核酶 极源自文库酶
Abzyme Ribozyme extremozyme
第一节 抗体酶（Abzyme)
一、抗体酶的理论基础
1. 抗体蛋白的特性：
抗体（antibody）：
抗原（antigen）： 半抗原（hapten）：
IgG的三级结构
IgG与抗原形成 的交联晶格
抗体与酶的异同：
相同点：
嗜压菌（barophiles）
抗辐射的微生物
2. 极端酶的制备
1）天然极端酶的筛选和生产 2）蛋白质工程生产极端酶
思考题：
都是蛋白质，都有特异性。
不同点：
1）抗体无催化活力，酶有催化活力。
2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择
结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合 的物质。
3）酶的活性和合成受到代谢调节， 种类有限。 抗体只有在抗原存在时才产生，种 类无限。
2.酶与底物形成过渡态理论
酶的催化在于能结合底物产生过渡 态，降低能障（反应的活化能）。 以过渡态类似物作为半抗原，诱导 与其互补构象的抗体，使其具有催化活 性，可观察到抗体催化相应底物发生化 学反应。
研究热点：
从催化分子内反应的自我剪切ribozyme设计
出催化分子间反应的ribozyme.
Ribozyme的固定化
Ribozyme的固定化已成功，将在医学、工业上获得应用。
意义： 对各种RNA-蛋白质复合物酶的分离鉴定，对许多具有特别 重要生物功能的RNA和蛋白质构成的颗粒体。在自然界将会 发现更多的具有自我剪接或自我剪切的RNA分子和以非RNA
+GpN
2）Ⅱ类内含子的自我剪接
Ⅱ型IVS是与细胞核mRNA前体的IVS结构
相似的间隔序列。通过转磷酸酯反应， 生成成熟的RNA及套环状的IVS。催化的 剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但 仍需要镁离子(Mg2+)。 剪接机制
2‘
p 5‘
HO-A
Ⅱ
p
3‘
套环的形成
Mg 2+
3’
OH
p-A
p
外显子连接 p
剪切位点
•四个螺旋区、三
个连接区和两个环。 •剪切反应发生在 底物识别序列GUC 的5‘端。
3‘ 5‘
2) 异体催化剪切型
核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶， 是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前 体的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH 和 5’-磷酸末端。
RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。
3 引入法
将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结
合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可 利用蛋白质工程和基因工程技术
引入法举例
四、抗体酶的应用
1.戒毒:
用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半 抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解， 水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。
2. 肿瘤治疗
3‘
GOH 3’ G-IVS
5’GAAA 19nt L-19IVS
1、转核苷酸作用
2CpCpCpCpC
2、水解作用 CpCpCpCpC 3、转磷酸作用
CpCpCpCpCpC
+CpCpCpC CpCpCpC + pC
CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpUpCpUpN CpCpCpCpC +Pi +G CpUpCpU 5、限制性内切酶作用
自然界存在催化分子内反应（in cis）的
ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)和催化 分子间反应(in trans)的ribozyme。
自我剪接ribozyme分类
自我剪接ribozyme可分为两类：
Ⅰ型IVS：均与四膜虫大核rRNA前体的IVS结构相似、催化 自我剪接需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+参与。 Ⅱ型IVS ：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中
蛋白质类：天然酶
极端酶 抗体酶 生物催化剂 （Biocatalyst）
enzyme
extremozyme abzyme
生物工程酶 核酸类:
Ribozyme Deoxyribozyme
克隆酶
其它：模拟酶
遗传修饰酶 蛋白质工程新酶 、
二、核酶的分类
I型内含子
剪接型核酶
II型内含子
锤头核酶 剪切型核酶 发夹核酶 自体催化 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP 异体催化
ribozyme的发现
80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的
Thomas Cech和美国耶鲁大学的Sidnery
Altman各自独立地发现RNA具有生物催化功
能.从而改变了生物催比剂的传统概念。
为此，T.Cech和S.Altman共同获得了1989
年度诺贝尔化学奖。
一、核酶的概念
具有生物催化功能的RNA。
的IVS相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，
但仍需Mg2+
2．自我剪切ribozyme的分类
自我剪切ribozyme, 自我剪切的RNA结构有
锤头结构和发夹结构，其中尖头指出自我剪 切的部位。 自我剪接ribozyme：包含剪切与连接两个步 骤。
几种能进行自我剪切的RNA结构
催化分子间反应的ribozyme的分 类
为底物的ribozyme
第三节 极端酶（extremozyme）
一、极端微生物和极端酶
1.极端微生物：
又称嗜极菌（extremophiles），是在
超常生态环境条件下生存的微生物。
根据所耐受的环境条件不同，分为：
嗜热菌（thermophiles） 超嗜热菌（hyperthermophiles） 嗜冷菌（psychrophiles） 嗜盐菌（halophiles） 嗜酸菌（acidophiles） 嗜碱菌（alkaliphiles）
对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与
骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆
抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。
2. 拷贝法
用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗 体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化， 获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选， 获得具有原来酶活性的抗体酶。
缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产 生新酶.
类 内 含 子 的 剪 接 机 制
P-A
HO 3’
2.剪切型核酶
这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。 1）自体催化剪切型 剪切机制
剪 切 机 制
转酯化过程：
由靠近切割 位点3‘端的2’OH或 氧原子对切割位
点的磷原子实施
亲核攻击，产生
5‘-OH 和2’，3‘环磷酸二酯。
核酶自身剪切反应
锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图
pGpA 5' UO H G pU
第二次转酯反应 5' pGpA 5' U pU 3'
3'
GO H3'
IVS 5‘
UCUAAA Pre-rRNA
A A A
GUAA
3‘
四 膜 虫 前 体 自 我 剪 接 反 应
rRNA
5‘
UCU
pGOH
GUAA
3‘
5‘GAAA GUAA 3‘
5‘
UCUoH3’
5‘
UCUUAA rRNA
7. 光诱导反应
a.光聚合反应（二聚作用）
b.光裂解反应
研究展望
1． 研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功
能间关系的一般规律。 2． 获得一类新型的蛋白酶。 3． 催化天然酶不能催化的反应。
第二节 核 酶（Ribozyme)
一、核酶的概念 二、核酶的种类 三、核酶的应用 四、核酶面临的问题 五、影响核酶活性的因素
抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放出 肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶 通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给 药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体
酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。
抗体酶的催化反应
1．酰基转移反应
2．重排反应
3．氧化还原反应
5．磷酸酯水解反应
6．磷酸酯闭环反应
五、影响核酶活性的因素
1、pH值对活性的影响： pH7.0- 7.5时核酶活性最高。 2、二价金属阳离子对活性的影响: Mg2+ 4、变性剂对活性的影响: 5、温度对活性的影响: Mn2+
3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应
Ribozyme研究进展与展望
对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。
三、核酶的应用
1. 基础理论：生命起源的探索 2. 医药： 1）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达， 抑制效率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免 疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV- Ⅰ)、抗肿瘤。 2）免疫原性低，很少引起免疫反应。 3. 植物抗病毒
四、核酶面临的问题
1、核酶催化效率低。
2、核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶 RNase破坏。
二、抗体酶的定义
抗体酶又称催化抗体（catalytic antibody），是抗体的高度选择性和酶 的高效催化能力巧妙结合的产物，本 质上是一类具有催化活力的免疫球蛋 白，在其可变区赋予了酶的属性。
三、抗体酶的制备 1. 诱导法
用设计好的半抗原，通过与载体蛋白
（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后
3’ HO-G
GMP,GDP,GTP
Ⅰ
p 5‘
P-G 3’ OH
p Mg
2+或Mn 2+
p
类 内 含 子 的 剪 接 机 制
3‘ HO
p
P-G
外显子
内含子或居间序列 （Intervening sequence,IVS)
内含子
5'
5'外显子
3'外显子 U pA G pU 3'
第一次转酯反应
pG-OH
•三个双螺旋区。 •13个核苷酸残基 保守序列。
•剪切反应在右上 方GUX序列的3‘端 自动发生。
发夹（hairpin ）结构
1989年汉普（Hample）研究烟草环斑病毒 （sTRSV）的负链RNA的自我剪切反应，提 出发夹结构（hairpin structure）模型。
发夹核酶结构模型
发夹二级结构模型
如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多 种分子间反应。
1.剪接型核酶
剪接型核酶的作用机制是通过既剪
又接的方式除去内含子（Intron)。
1）I类内含子的自我剪接(Self-splicing)
I型IVS是与四膜虫26srRNA前体的IVS结构 相似的间隔序列，具有环状结构。通过转 磷酸酯反应，生成成熟的26srRNA及G-IVS， G-IVS经两次环化生成L-19IVS。催化过程 需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。 剪接机制 L-19IVS在体外的多种酶活性
抗体酶 核酶 极源自文库酶
Abzyme Ribozyme extremozyme
第一节 抗体酶（Abzyme)
一、抗体酶的理论基础
1. 抗体蛋白的特性：
抗体（antibody）：
抗原（antigen）： 半抗原（hapten）：
IgG的三级结构
IgG与抗原形成 的交联晶格
抗体与酶的异同：
相同点：
嗜压菌（barophiles）
抗辐射的微生物
2. 极端酶的制备
1）天然极端酶的筛选和生产 2）蛋白质工程生产极端酶
思考题：
都是蛋白质，都有特异性。
不同点：
1）抗体无催化活力，酶有催化活力。
2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择
结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合 的物质。
3）酶的活性和合成受到代谢调节， 种类有限。 抗体只有在抗原存在时才产生，种 类无限。
2.酶与底物形成过渡态理论
酶的催化在于能结合底物产生过渡 态，降低能障（反应的活化能）。 以过渡态类似物作为半抗原，诱导 与其互补构象的抗体，使其具有催化活 性，可观察到抗体催化相应底物发生化 学反应。