核酶和抗体酶
抗体酶核酶和固定化酶的基本概念和应用
抗体酶核酶和固定化酶的基本概念和应用咱们今天聊聊抗体酶核酶和固定化酶，这些东西听起来是不是有点绕？别着急，咱们慢慢讲，保证你听了以后啥都懂。
咱得说一下这些词到底是什么意思。
抗体酶核酶？嗯，乍一听是不是像是医学科幻片里的东西？它的原理比想象的要简单得多。
你可以把它看作是一种“聪明”的工具，它集合了抗体、酶和核酸三者的优点。
这些东西就像是“超能战士”，可以识别特定的物质，还能加速化学反应，甚至还能解决一些日常生活中的难题。
举个例子，它们可以帮助检测疾病，或者像化学工厂一样促进化学反应，真的是神奇得不要不要的。
那什么是固定化酶呢？这个就更简单了。
你可以把固定化酶想象成你家厨房里的调料瓶，酶就是调料，而固定化就是把它固定在瓶子里。
这样，你在做菜的时候，调料不会掉来掉去，方便又省事。
固定化酶的工作原理也是一样的。
它把酶固定在一个“平台”上，这个平台可以是塑料、玻璃，甚至是一些天然的东西。
这样一来，酶就能一直待在那里，不容易被浪费掉，而且还能多次重复使用，像是永不干涸的泉水，节省了大量的成本。
你看这些酶其实都不是什么新鲜的东西。
早在很久以前，人类就发现了酶的神奇作用。
它们是自然界里的“催化剂”，就像是车上的加速器，不推动车走就没意思了。
科学家们早就知道，酶能加速化学反应，甚至能在没有高温高压的情况下，完成那些看似不可能的反应。
但是酶也有个小问题，那就是它们容易被环境影响，比如温度、酸碱度，甚至是空气中的一些物质。
一不小心，酶就像跑得太快的马，飞驰到一个无法控制的地方，反而啥也做不成了。
为了让酶更稳定、更高效，科学家们就想出了固定化的办法。
想象一下你做饭的时候，如果把调料瓶随便扔在桌上，它可能就会翻倒、撒一地，到时候你得重新找，浪费时间。
可是如果你把调料瓶固定在一个固定的位置，它不仅不容易乱，还能更方便地拿取。
固定化酶就是这么一个聪明的发明，它让酶能在合适的环境中更好地工作，减少浪费，增加效率。
就好像是做事的“老司机”，让一切变得得心应手。
第六章 酶
（三） Ｋ值与Ｖ值的测定
1、 双倒数作图法
Vmax[S] 1/V
V = Km+[S]
1/Vmax
两边同取倒数
Km 1/V= Vmax 1/[S] +1/Vmax （林－贝氏方程）
-1/Km
1/[S]
2、Hanes作图法
在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S]
[S]/V
[S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax
Vmax ：
①定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度， 与酶浓度成正比。
②意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从Ｖmax计算 酶的转换数，即动力学常数Ｋ3。
酶的转换数：
定义 — 当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个 酶分子催化底物转变为产物的分子数。 意义 — 可用来比较每单位酶的催化能力
(二）维生素与辅酶的关系
名 称 NAD+、NADP+ FAD、FMN TPP CoA 硫辛酸 所含维生素 维生素PP 维生素B2 维生素B1 泛酸 硫辛酸 转移基团 氢原子 氢原子 醛基 酰基 酰基
钴胺素类
生物素
维生素
生物素
烷基
二氧化碳
磷酸吡哆醛
四氢叶酸
维生素
叶酸
氨基
一碳单位
（三）蛋白质类辅酶
酶促反应的特点：
1、酶是蛋白质，极易受外界条件的影响。 2、酶具有高度催化效率。
3、酶具有高度专一性
4、酶的活性是受到调节和控制的
二、酶作用的专一性
1、立体化学专一性
⑴立体异构专一性 ⑵几何异构专一性 2、非立体化学专一性 ⑴键的专一性 ⑵基团专一性 ⑶绝对专一性
三、酶的分类与命名
核酶抗体酶ppt课件
3、核酶作用的特点
化学本质 RNA 底物 RNA 肽键 ā-葡聚糖分支酶 反应特异性(专一性）碱基 催化效率 低 产物
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4.核酶的分类
锤头核酶
发夹核酶 剪切型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶
根据催化反应
RNaseP
I内含子
剪接型核酶 II内含子
2. 免疫源性低，很少引起免疫反应。 3. 针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产 物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
二、在其他领域的应用
防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链 的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变 核酶的克隆等
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剪切位点
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RNaseP底物的二级结构
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1、转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC
2、水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC
3、转磷酸作用 CpCpCpCpCpCp+UpCpU
CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用
核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核
糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的 5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH 和 5’磷酸末端。
RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。
体外： M1RNA具催化作用
蛋白质作为辅助因子
体内： M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的。
2、1剪切机制 Mg 2+
2、2结构与功能的关系 M1RNA 5‘端完 整结构对维持催化活性是必需的。
酶工程 核酶和抗体酶(6.4)--6.1
什么是抗体酶？抗体酶有何特性？答：抗体酶指既是抗体又具有催化功能的蛋白质。
因为它是具有催化活性的抗体，故又称为“催化性抗体”。
抗体酶具有典型的酶反应特性；与配体(底物)结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性；具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快104～108倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。
抗体酶与天然酶相比，最大的优点在于抗体的种类繁多，抗体的精细识别性使其能结合几乎任何天然的或合成的分子，制备成功的抗体酶不但能催化一些天然酶能催化的反应，而且还能催化一些天然酶不能催化的反应。
简述抗体酶的制备原理。
答：抗体酶的制备主要有诱导法、引入法、拷贝法等方法。
诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶；引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能；拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。
核酶是如何发现的? 核酶的发现有什么重要意义？答：1982年，美国的T.Cech等研究发现原生动物四膜虫的26SrRNA前体能够在完全没有蛋白质的情况下，自我加工、拼接，得到成熟的rRNA。
1983年，S.Altman等研究RNaseP时发现，将RNaseP的蛋白质与RNA分离，分别测定，发现蛋白质部分没有催化活性；RNaseP的蛋白质部分除去并提高Mg2+，则留下的RNA部分具有与全酶相同的催化活性。
1986年，T.Cech与连接，具有核糖核酸酶和RNA聚合酶的活性。
核酶的发现，证明了核酸既是信息分子，又是功能分子，对于研究生命的起源，了解核酸新功能，以及重新认识酶的概念等都具有重要意义。
简述L19 RNA（L19 IVS）的生成及其催化反应。
答：1982年Cech等人在研究四膜虫前体rENA拼接机制时发现，在没有仟何蛋白质酶参与下，几秒钟内自动切除含有413nt的IVS(间插序列片段interveningsequcnce，IVS)，并产生成熟的rRNA，但反应体系需镁离子和鸟苷酸或鸟苷(均需有3¢-OH)参与。
Chapter9核酶和抗体酶解析
需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+参与。
Ⅱ型IVS ：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的IVS相 似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+
2．自我剪切ribozyme的分类
自我剪切ribozyme, 自我剪切的RNA结构有锤头结构和发 夹结构，其中尖头指出自我剪切的部位。
1．酰基转移反应
2．重排反应
3．氧化还原反应
4．金属螯和合反应
5．磷酸酯水解反应
6．磷酸酯闭环反应
7. 光诱导反应
a.光聚合反应（二聚作用）
b.光裂解反应
四. 制备方法
i. 诱导法：即用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白 （例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准 的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶。
自我剪接ribozyme：包含剪切与连接两个步骤。
几种能进行自我剪切的RNA结构
3．催化分子间反应的ribozyme的分类
如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多种分 子间反应。
三．Ribozyme研究进展与展望
对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。可找出其 结构功能域和必需基团，据此可进行分子改造，以获得 分子更小的、高效的ribozyme
连接酶活性 金属螯合酶活性 磷酸酯酶活性
生物学意义
第二节结束
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第三节 抗体酶
一. 概念 是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变 区赋予了酶的属性。
二. 抗体酶概述
酶与抗体的差别：酶是能与反应过渡态选择结合
核酶和抗体酶2
内含子
Ⅰ
型
5'外显子
5'
U pA
3'外显子
G pU
3'
内
第一次转酯反应
含
pG-OH
子
pGpA
的 5'
UOH
G pU
3'
自
我
第二次转酯反应
剪
5' pGpA
接
5'
U pU
3'
GOH 3'
I类内含子催化其他RNA分子 反应的几种类型
1、转核苷酸作用
2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC+CpCpCpC
• 这两个位点对于剪接是十分重要的，一旦发 生突变无论在体内还是在体外，会抑制剪接。
• 此法则几乎适合于所有真核生物的核基因， 这意味着它们切除内含子的机制是相同的， 但不适用于Ⅰ类内含子。
RNA的催化功能
• 核酶首先是美国 Colorado 大学Cech在研 究四膜虫rRNA剪接机制时发现的。
–一方面证明了四膜虫rRNA的剪接机制； –另一方面证明了L-19 分子的催化活性。
四膜虫rRNA内含子 ---Ⅰ型内含子
I型内含子的结构特点
1、拼接点序列为 5U··· ···G3
2、中部核心结构 3、内部引导序列 4、剪接通过转酯反应进行
引导序列
保守序列 G结合位点
剪接部位
Ⅰ型内含子二级结构通式
内部引导序列
• 内含子中可与外显子配对的序列称为内部引导序列 • 其作用是决定剪接的专一性。
+ 外显子1 外显子2 内含子1
•剪接产物通过凝胶电泳见到: rRNA前体 + + + + 核抽取物 - + - + GTP - + + -
分子酶学名词解释简答
分子酶学复习重点1 剪接型核酶:定义：指RNA分子被磷酸二酯酶切割后，伴随着形成新的磷酸二酯键，即磷酸二酯键的转移反应或称转酯反应。
2 剪切型核酶: 这类核酶的作用是只剪不接，催化自身RNA或不同的RNA分子，切下特异行核苷酸序列。
3 探针酶：既保持高度的反应性，又能在DNA中任意选定的区域内进行切割的酶。
实质是核酸内切酶，由两部分组成，第一部分叫做切割系统，为核酸切割试剂或酶，第二部分叫做识别系统，可以识别核酸底物的特定核苷酸序列。
4 人工酶：人工合成的具有催化活性的蛋白质或多肽。
5 模拟酶：利用有机化学合成的一些比酶结构简单得多但具有催化功能的非蛋白质分子。
6 抗体酶：又称催化抗体，是一类具有催化能力的免疫球蛋白，即通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它既具有相应的免疫活性，又能像酶那样催化化学反应。
7 克隆酶：基因工程将某种酶基因导入宿主细胞中大量表达其产物为克隆酶，即用基因工程技术生产的酶。
8 突变酶：用基因定位突变技术修饰天然酶基因，然后用基因工程技术生产该突变基因的酶，被称为突变酶。
9 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
10 酶的比活力：单位质量样品中的酶活力；1mg蛋白质中所含的U数；1Kg蛋白质中所含的Kat数。
11 酶的转换数（K cat）：当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子所转换底物分子数，又叫转换数（简称TN）, Kcat可以用来衡量酶的催化效率，越大效率越高。
12 亲和标记：利用酶对S的特殊亲和力，将酶加以修饰标记，故称之为亲和标记。
13差别修饰法（差别标记）：这种方法是非特异性试剂标记法的一个发展。
它利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性中心，使非特异性试剂只修饰活性中心以外的基团，然后透析除去保护剂（即竞争性抑制剂或底物），再用同位素标记的非特异性试剂修饰活性中心的基团。
经氨基酸分析可知哪些基团位于活性中心。
抗体酶与核酸酶的名词解释
抗体酶与核酸酶的名词解释介绍：在生物学领域中，抗体酶与核酸酶是两个重要的概念。
它们分别代表了抗体与核酸相关的酶活性。
本文将对抗体酶和核酸酶进行详细解释，并探讨它们在生物学中的作用和应用。
一、抗体酶（Antibody Enzyme）抗体酶是将抗体与酶活性结合的一种融合蛋白质。
它的独特结构使其能够同时具备免疫识别和酶活性两种功能。
通常，抗体酶由通过基因工程技术构建的单克隆抗体与酶分子相结合而成。
抗体酶的作用：抗体酶在生物学研究、医学诊断和治疗等领域具有重要应用。
首先，它可以用于免疫组织化学分析，通过特异性抗体的结合，检测与某种蛋白质或细胞相关的特定抗原。
其次，抗体酶还广泛应用于免疫诊断试剂盒中，如妊娠试纸、艾滋病病毒检测试剂等。
此外，抗体酶对于治疗肿瘤和炎症疾病等方面也有很大作用。
二、核酸酶（Nuclease）核酸酶是一类能够分解核酸分子的酶，主要包括DNase（脱氧核酸酶）和RNase（核糖核酸酶）两种。
核酸酶能够加速酶解核酸链的过程，并参与核酸代谢和细胞生命周期的调控。
DNase的作用：DNase主要作用于DNA分子，能够在酶解作用下使DNA链断裂。
在细胞凋亡（细胞程序性死亡）过程中，DNase起到关键作用，它能够将DNA分子断裂成较小的片段，进一步促使细胞死亡。
此外，DNase还在DNA修复和DNA重组等生物过程中发挥重要作用。
RNase的作用：RNase主要作用于RNA分子，它能够酶解RNA链，从而控制RNA在细胞内的代谢。
RNase在维持基因表达平衡、调节蛋白合成等方面发挥着重要作用。
另外，RNase还参与RNA降解、RNA修复和基因调控等生物过程。
抗体酶与核酸酶的应用抗体酶与核酸酶不仅在生物学研究中发挥作用，还在医学诊断和治疗中得到广泛应用。
1. 生物学研究中的应用抗体酶可以通过免疫组织化学、免疫印迹等技术，用于鉴定和定位特定蛋白质或细胞上的抗原。
核酸酶在基因表达和调控研究中也起到关键作用，通过核酸酶酶切，可以获取特定片段的DNA或RNA，进行进一步的分析。
第八章核酶和抗体酶
大肠杆菌得4、5sRNA前体可被RNA亚基剪切,但如 果当蛋白质亚基存在时,则剪接速度可加快几百倍以上。 另外,RNA亚基对3’端带CCA顺序得前体tRNA比对3’ 端CCA顺序缺失得前体tRNA得裂解效率更高,但当有 蛋白质亚基存在时,则剪接这两类前体tRNA得效率几 乎相同,这说明蛋白质亚基决定着RNaseP全酶对不同 底物得剪接效率,可能对RNA亚基功能起着某种调控 作用。
DNA就是双股核酸,而且其分子量非常巨大, 因此无法自由卷绕成特定构象,都只就是形成 长长得双螺旋结构。
1982年,切赫(Cech)发 现四膜虫前体rRNA得自我剪接
1983年,阿尔特曼(Altman)发现核 糖核酸酶P得RNA部分具有催化能力。
1989年,二者获得诺贝尔化学奖
一、切赫:四膜虫rRNA前体得自我剪接实验
又如,白血病就是造血系统得恶性肿瘤,目前尚缺少有效得治 疗方法。核酶得发现,尤其就是锤头状核酶,为白血病得基 因治疗带来了新得希望。近些年,在国外得一些国家已经在 小白鼠体内得到较好得效果。
基因工程中得工具酶
基因工程中得工具酶: ------主要包括用于DNA和RNA分子得切割、连接、
聚合、逆转录等相关得各种酶类。
第八章核酶和抗体酶
RNA
碱基配对原则:
A —— U(T) G —— C
至于RNA得分子结构,就其化学组成上看,也就是由四种核苷 酸组成得多聚体。她与DNA得不同,
首先在于以U代替了T,其次就是用核糖代替了脱氧核糖,
此外,还有一个重要得不同点,就就是绝大部分RNA以单链形式 存在,但可以折叠起来形成若干双链区域。在这些区域内,凡互 补得碱基对间可以形成氢键(图)。但有一些以RNA为遗传物质 得动物病毒含有双链RNA。
第八章 核酶和抗体酶 PPT课件
一、 抗体酶概述
概念
• 是一种具有催化功能的免疫球蛋白(抗体分子)， 在其可变区赋予了酶的属性，属于化学人工酶
酶与抗体的差别
酶是能与反应过渡态选择结合的催化性物质，抗 体是和基态分子结合的非催化性物质
二、 抗体酶的催化反应
1、酰基转移反应
二、 抗体酶的催化反应
2、重排反应
二、 抗体酶的催化反应
Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA
一、核酶的发现
1983年美国S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋 白质和80%的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可 催化E. coli tRNA的前体加工
Sidney Altman Yale University New
这类RNA进行自 身催化的反应是只切 不接。
特点：在 Mg 2+ 或其 他二价金属离子存在 下，在特定的位点， 自我剪切，产生5’OH 和2’，3’-环磷酸 二酯末端。
核酶自身剪切反应
锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图
三个双螺旋区 13个核苷酸残基保 守序列
剪切反应在右上方 GUX序列的3’端自 动发生
3、氧化还原反应
二、 抗体酶的催化反应
4、金属螯和合反应
二、 抗体酶的催化反应
5、磷酸酯水解反应
二、 抗体酶的催化反应
6、磷酸酯闭环反应
二、 抗体酶的催化反应
7、光诱导反应
a. 光聚合反应（二聚作用）
二、 抗体酶的催化反应
7、光诱导反应
b. 光裂解反应
三、 抗体酶的制备方法
1、拷贝法 2、引入法
I型内含子
根 剪接型核酶
第四节 核酶、抗体酶、同功酶、酶工程
2. 生物酶工程
酶学和DNA重组技术相结合。
基因工程技术大量生产克隆酶 基因定点突变，获得遗传修饰酶
设计新酶基因，合成优质酶
Fig.2-42 Schematic illustration of DNA cloning.
天然存在的酶。
指当细胞加入特定诱导物后诱导产生 的酶。诱导物一般是底物或其类似物。
例：大肠杆菌-半乳糖苷酶的诱导生成
去掉
-半乳糖苷酶 （ g ）
诱导物
加入
诱导物
细菌蛋白总量（g）
Fig.3ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ28 -半乳糖苷酶的诱导生成
五、 酶工程
（一）酶在工业、农业、医药及科学研究中的巨大作用
工业：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、凝乳酶等。 农业：淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等 医药：血清GPT、GOT; 乳酸脱氢酶H4、 M4
抗原结合部位 重链（H） 轻链（L） 铰链区 V：可变区 C：恒定区 Fc：基部片断 Fab: 臂片断（抗原结合片断）
免疫球蛋白（抗体）的结构
抗体酶本质上是抗体，但在可变区具有酶活性，所以称为 抗体酶。
磷酸吡哆醛
（a）半抗原-载体蛋白 （b）抗体酶催化的氨基转移反应
羟酯
环状过渡态
内酯
环状磷酸酯
第四节
核酶、抗体酶、 同工酶、酶工程
一、核酶（ ribozyme）
• 定义： 化学本质为RNA的酶。它具有识别和转化单链
RNA的能力。
例：L19RNA 1982， Cech 等，研究四膜虫rRNA 前体的成熟。 L19RNA —395个核苷酸构成的线状 RNA分子
外显子 鸟苷
内含子
名词解释
三、名词解释：1.限制性核酸内切酶: 能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）2.遗传密码：mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸，这种核苷酸三联体称为遗传密码3.核酸的一级结构：核酸的一级结构是指组成核酸的核苷酸之间的连接方式及排列顺序。
4.增色效应：指与天然DNA相比，变性DNA因其双螺旋破坏，使碱基充分外露，因此紫外吸收增加，这种现象叫增色效应。
5.Tm 值：加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸收度增加，达到其最大值一半时的温度，就是DNA的变性温度（解链温度，Tm）。
6.核酸的变性：在理化因素作用下，核酸双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致核酸的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为核酸的变性。
7.核酶：具有自身催化作用的RNA称为核酶8.核酸分子杂交：两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交。
四、简答题1 ．答：DNA 双螺旋结构模型的要点是：（ 1 ） DNA 是一反向平行的双链结构，脱氧核糖基和磷酸基骨架位于双链的外侧，碱基位于内侧，两条链的碱基之间以氢键相接触。
腺嘌呤始终与胸腺嘧啶配对存在，形成两个氢键（ A＝T ），鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对存在，形成三个氢键（G≡C ）。
碱基平面与线性分子结构的长轴相垂直。
一条链的走向是5'→3' ，另一条链的走向就一定是3'→5' 。
（2 ） DNA螺旋每旋转一周包含了 10 对碱基，每个碱基的旋转角度为36° 。
螺距为 3.4nm ，每个碱基平面之间的距离为 0.34nm 。
DNA 双螺旋分子存在一个大沟和一个小沟。
（3 ） DNA 双螺旋结构稳定的维系横向靠两条链间互补碱基的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持。
第五章核酶与抗体酶2010
进攻内含子与3’外显子之间的磷酸基团，从而释放出内含
子并将两个外显子连接起来。
2‘
p 5‘
HO-A
Ⅱ 类 内 含 子 的 剪 接 机 制
p
3‘
套环的形成
Mg 2+
3’
OH
p-A
p
外显子连接 p
P-A
HO 3’
核糖核酸酶P(ribonuclease P，RNase P)
核糖核酸酶P是一个核酸内切酶，它专门切除前体tRNA 5’端的附加序列。
在生物体内，只有与蛋白质结合才能更为有效地发挥
催化作用，但起催化作用的还是RNA，蛋白质的作用
是帮助稳定具有催化活性的RNA的特殊构型。
Ⅱ类内含子有一 个保守的二级结 构：
结构域Ⅰ：两个 保守内含子结构 序 列 EBS1,EBS2 与两个外显子结 构 序 列 IBS1,IBS2 互 相 配对。
intr on
1983年美国 S.Altman 等研究RNaseP（由20% 蛋白质 和80% 的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可催化E. coli
tRNA 前体加工。
Thomas Cech
Sidney Altman
Cech和Altman各自独立地发现了RNA的
催 化 活 性 ， 并 命 名 这 一 类 酶 为 ribozyme
当发夹核酶与底 物结合时，其二 级结构包括5个 环和4个螺旋。
核酶和底物组成
螺旋1、2及对称 的环1、5。
剪切反应发生在 底物识别序列 GUC的5‘端。
•发夹核酶分别为 2 个 结构域。结构域I由螺 旋1、2和环1、5组成， 结构域II由螺旋3、4 和环2、3、4组成。 •腺 苷 酸 残 基 A15 连 接 两个结构域 ， 使它们 相互靠近相互作用 ， 形成催化反应所必需 的三级结构。 •环 3被认为与催化作 用无关。
酶的命名和分类
酶的催化作用特性
酶促反应遵循米氏动力学方程
酶分子的结构 酶与底物分子之间的相互作用 酶与底物分子之间的定向效应 酶与反应过渡态的结合作用 酶与底物的手性选择性结合作用
01
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02
与酶催化特性有关的因素
（一）酶分子的结构
酶的活性中心 结合部位：专一性 空间形状和氨基酸残基组成上，利于酶－底物复合物的形成。 催化部位：高效性 与结合部位重叠或非常靠近； 含有多种具有活性侧链的氨基酸残基； 有的含有辅酶或金属离子； 激活底物或降低过渡态活化能。
01
返回
02
影响酶作用的因素
1) 温度对酶作用的影响
酶的最适温度（optimum temperature, Tm） 在一定范围内，反应速度达到最大时的温度称为酶的最适温度（optimum temperature, Tm）。 最适温度不是酶的特征物理常数。
返回
01
02
pH对酶作用的影响
辅酶和辅基的作用特点
（一）辅酶和辅基
（一）辅酶和辅基
辅酶和维生素 大多数辅酶或辅基的前体是维生素，主要是水溶性B族维生素。
”
返回
（二）酶分子中的金属离子
金属酶（mentalloenzymes)，如SOD 1） 酶蛋白与金属离子结合紧密 2）过渡金属离子：如Fe2+/Fe3+,Cu2+/Cu+， Zn2+，Mn2+等 3）通过配位健与氨基酸残基侧链基团相连 或作为酶的辅助因子 金属激活酶（metal-actived enzymes) 1）结合较松散 2）碱金属离子或碱土金属离子，如K+,Na+,Mg2+,Ca2+等
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4.5 酶的抑制剂与药物分子设计
核酶与抗体酶
陈 惠
核 酶（Ribozyme) 酶（Ribozyme)
一、概述 二、剪接型核酶 三、剪切型核酶 四、核酶的应用 五、核酶技术面临的问题 六、脱氧核酶（deoxyribozyme)
一、概 述
1、对酶及生物催化剂的认识的发展 对酶及生物催化剂的认识的发展
蛋白质类： 蛋白质类：天然酶 enzyme 极端酶 extremozyme 抗体酶 abzyme 生物催化剂 （Biocatalyst） ） 生物工程酶 核酸类: 核酸类 Ribozyme Deoxyribozyme 其它： 其它：模拟酶
四、核酶的应用
一、在医学领域中的应用：
1. 通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高， 专一性强。 2. 免疫源性低，很少引起免疫反应。 3. 针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产 物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
二、在其他领域的应用
防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链 的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变 核酶的克隆等
5 ’ 3’
Ⅱ类内含子二级结构模式
发夹二级结构模型
剪切位点 3 ‘ 5 ‘
5个环和4个螺旋形成两个 结构域 剪切反应发生在底物识别 序列GUC的5‘端 两个内部环中的碱基及在 螺旋区Ⅱ的G11和底物中 的G+1都是酶发挥作用所 必需的。
HDV RNA斧头结构模式
剪切部位 三个碱基对的茎 需要二价阳离子， 需要二价阳离子， 产生5‘ 产生 ‘-OH和 2’,3’-环 和 ’ ’环 磷酸
7位核苷酸 位核苷酸
发夹（hairpin 发夹（hairpin ）结构
发夹核酶发现于三种不同植物RNA病毒，即 烟草环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥 花叶病毒。三种发夹核酶分别是这些RNA病毒 卫星RNA的负链，英文缩写分别是 sTRSV,sCYMVT,sARMV,均为单链RNA。 发夹核酶结构模型 发夹核酶催化机制 金属离子在催化反应 中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高。
酶
目录
概念
研究各种因素对酶促反应速度的影响，并 加以定量的阐述。
影响因素包括有 酶浓度、底物浓度、pH、温度、
抑制剂、激活剂等。
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
目录
一、底物浓度对酶反应速度的影响
研究前提
I.
II.
目录
一、 酶的化学化学本质与分子组成
酶化学本质分类：蛋白酶、核酶
单纯酶
(simple enzyme)
结合酶
(conjugated enzyme)
蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme)
全酶 (holoenzyme) 辅助因子 (cofactor)
小分子有机化合物
金属离子
目录
酶的不同形式
单体酶(monomeric enzyme)：仅具有三级结 构的酶。 寡聚酶(oligomeric enzyme)：由多个相同或 不同亚基以非共价键连接组成的酶。 多酶体系(multienzyme system)：由几种不同 功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。
一种酶可有一个或多个活性中心。
目录
必需基团(essential group) 酶分子中氨基酸残
基侧链的化学基团中，
一些与酶活性密切相关 的化学基团；必需基团 也可来源于辅助因子。
目录
活性中心内的必需基团
结合基团 (binding group) 与底物相结合 活性中心外的必需基团 位于活性中心以外，维持酶活性中心应有 的空间构象所必需。
第 六 章
酶
Enzyme
目录
要 求
第一节：掌握 第二节：掌握 第三节：掌握 第四节：掌握 第五节：自学 第六节：掌握 第七节：自学
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将不同的重链和轻链基因随机组合，克隆 到合适的表达载体中，在原核细胞表达不 同的抗体，形成一个抗体库，从这个抗体 库中，用抗原可以筛选到相应的抗体基因。
引入法
随着噬菌体抗体库技术的完善，可根据需 要构建适当序列的基因片断，绕过免疫学 方法，构建全新的抗体酶。 噬菌体展示技术将组建亿万种不同特异性 抗体可变区基因库和抗体在大肠杆菌中功 能性表达，与高效快速的筛选手段结合起 来，彻底改变了抗体酶生产的传统途径。
A. 酯酶的底 物–酯
B.酯的羧基碳原子 受到亲核攻击形成 四面体过渡态
C.设计的磷酸酯 类似物,作为抗原 去免疫实验动物
O –C –
磷酸酯类似物 免
(半抗原)
疫
对酯水解反应有 催化作用的单克
隆抗体
抗体酶用于有机酯的水解，过渡态类似 物磷酸盐和磷酸酯作为免疫原诱导产生 的单克隆抗体催化水解反应比未催化反 应快104倍。
L-19IVS
G- P
- OH +
15nt
P399nt
图 13- 四膜虫 35S RNA 内含子剪接 的转酯反应模型
L-19具有酶的主要特 征：专一性强，加快 反应速度，反应前后 酶分子保持不变
L-19 IVS所催化的水解反应和连接反应
异议
引入法
用基因工程方法改造和制备全新的抗体酶 是一种很有前途和发展潜力的抗体酶制备 方法。
将催化基因引入到特异抗体的抗原结合 位点上，使其获得催化功能。 也可以针对性地改变抗体结合区的某些 氨基酸序列，以获得高效的抗体酶。
引入法
对于已产生的单抗，分析抗体结合部位 的氨基酸顺序或对应的碱基顺序。 通过对抗体酶结合部位氨基酸对应的基 因序列进行定点突变，希望能在抗体结 合部位换上有催化作用的氨基酸。 改变抗体酶的催化效率。
免疫原性 免疫反应性
❖完全抗原 ❖半抗原
半抗原 载体 +
完全抗原
B B
B
BT T
抗体
抗体
由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度互补 并与抗原具有特异结合功能的免疫球蛋白。
抗体的最显著的特征是 多样性和专一性
酶是生物催化剂
酶是一类具有催化功能的生物大分子
酶是生物催化剂
酶的作用在于降低反应活化能
❖L-19IVS是四膜虫35S rRNA剪接的最终 产物，仍具有酶的活性和特征。
rRNA
四 膜 虫 前 体 自 我 剪 接 反 应
G-OH
内含子(413nt)
外显子 A
5’
P
外显子 B -P
P-
OH-
水解
L-15 IVS
G- P
-P
+
-OH
-P +
+ 4nt
环状 IVS 395nt
水解
G- P
-OH
❖一种对酶促反应过渡态特异的抗体 结合了酶与抗体的优点，既可以起 酶促催化作用，又可以起抗体的选 择性和专一性结合抗原的作用。
抗体酶的特性
❖1、能催化一些天然酶不能催化的反应 有许多化学反应还没有已知酶催化 抗体的多样性决定了抗体酶催化反 应类型多样性 抗体酶可以根据需要人工设计
抗体酶的催化反应类型
hnRNA
转录后剪接 转运
mRNA 蛋白
翻译
内含子（introns）
真核生物细胞DNA中的间插序列 （interveningsequence，IVS） 在转录后的加工中，从最初的转 录产物除去的内部的核苷酸序列。
生物催化剂---酶
早期认识
酶是一种生物催化剂。由生物体 产生的，具有催化能力的蛋白质。 只有蛋白质才有催化功能，所有称为
过渡态理论
❖1946年，Pauling用过渡态理论阐明酶催 化的实质 酶之所以具有催化活力是因为它能特异 性结合并稳定化学反应的过渡态(底物 激态)，从而降低反应能级。
过渡态理论是解释酶催化原理的经典理论。
过渡态理论（续）
过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了 一个易于形成产物的过渡态，实际上是降 低了反应所需的活化能。
SnRNA
参与hnRNA的剪接、转运
核仁小RNA
SnoRNA
rRNA的加工、修饰
胞浆小RNA scRNA/7SL-RNA
蛋白质内质网定位合成 的信号识别体的组分
中心法则
遗传信息复制
遗传信息转换
遗传信息 最终表达
中心法则
原核细胞
DNA
mRNA
蛋白
转录
翻译
真核细胞
细胞质
细胞核
外显子
内含子
DNA
转录
静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表 面或附近，抗体酶就会将前药迅速水解释 放出抗肿瘤药物，从而提高肿瘤细胞局部 药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力，达到提 高肿瘤化疗效果的目的。
（Ribozyme)
知识回顾
核 脱氧核糖核酸（DNA） 酸 核糖核酸（RNA）
所有生物的遗传物质是：
绝大多数生物：DNA 部分病毒：RNA
（Abzyme)
内容
1 抗体酶产生的理论基础
2
抗体酶的制备方法
3
抗体酶的应用
免疫系统
免疫系统是机体不可或缺的生理系统之一
❖由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成
免疫防御 免疫自稳 免疫监视
什么是抗原?
能够刺激机体产生特异性免疫应答，并能 与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体 内外结合，发生免疫效应的物质。
❖ 1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯 （PNPPC）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似 物。
❖ 诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000 倍。
抗体酶
抗体酶（Abzyme）或催化抗体 （Catalytic antibody)
一种具有催化功能的抗体分子，在其 可变区赋予了酶的属性。
抗体酶的特性
根据这一理论，可以酶作为免疫原诱导 机体产生抗体，再利用该抗体继续免疫， 诱导产生的抗独特型抗体即可能具有催 化活性。
抗独特型抗体酶
拷贝法
利用该方法的优点是可直接利用酶诱导 机体产生抗体，进而产生与酶具有相同 活性部位的抗独特型抗体。
如果对酶的结构预先进行修饰，还有望 诱导产生底物特异性与酶不同的催化性 抗体。
酶的生物大分子都是蛋白质。
重大发现（1）
1982年，Thomas R.Cech的研究组在 《CELL》上发表了题为《自我剪接RNA： 嗜热四膜虫核糖体RNA插入序列的自我 切除和自我环化》
重大发现
四膜虫 rRNA前体中的内含子具 有催化活性，它能自动切除内含 子本身，并连接外显子得到成熟 的rRNA。
多个抗原决定基→机体→多种抗体的混合 物
单克隆抗体 （monoclonal
antibody）
由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产 生的均一性抗体
通常是指由一株B淋巴细胞杂交瘤增生 而成的单一细胞克隆所产生的一种高 度均一、高度专一性的抗体
1 4
Ag 2
3
单抗与多抗的区别：
B1
B2
B3
B4
多克隆抗体
核酸的组成
DNA
RNA
核酸的结构
DNA
DNA
RNA的种类、分布、功能
细胞核和胞液 线粒体 功
能
核蛋白体RNA rRNA
mt rRNA 核蛋白体组分
信使RNA
mRNA
mt mRNA 蛋白质合成模板
转运RNA
tRNA
mt tRNA 转运氨基酸
核内不均一RNA HnRNA
成熟mRNA的前体
核内小RNA
1986年Lerner和Schultz证实了这一设想。
抗体酶的发现
Lerner和Schultz分别领导各自的研究小组 首次观察到了抗体具有选择性的催化活性。
1986年美国Lerner和Schultz两个实验室同 时在Science上发表论文，报道他们成功地 得到了具有催化活性的抗体。
并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为催 化抗体，即抗体酶。
“制备”抗原： 设计过渡态类似物
合成半抗原 半抗原－载体
筛选抗体酶： 筛选具有催化
性能的单抗
杂交瘤细胞制备： 免疫小鼠
与骨髓瘤细胞结合 限制性稀释
筛选与半抗原具有 高亲和力的克隆
制备单克隆抗体： 将细胞培养于腹水液或
培养介质中生产单抗
纯化单抗
特异蛋白
抗原抗体
半抗原
抗原抗体
抗体 酶
诱导法制备具有酯酶活性的抗体
抗原内影像， 刺激B细胞产
生抗体
Ag
Ab1
Ab2β
Ab3β Ab3α
Ab2α
抗独特型抗体酶
拷贝法
根据Jeme提出的免疫网络学说，抗独 特型抗体中的Ab2β能识别并结合Ab1 上与抗原表位结合的补位，其具有抗 原内影像作用，可在空间结构上模拟 抗原并可能具有抗原的一些性质。
抗独特型抗体酶
拷贝法
抗体酶用于肿瘤治疗
目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗 （ADEPT）技术，即将能水解前药释放出 肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶 联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而 存在于细胞的表面。
抗体酶用于肿瘤治疗
前药 ( prodrug)是指由具有生物活性的药 物经化学修饰后转变为体外无活性的化合 物。 这种化合物在体内经酶或非酶作用，脱去 保护基，释放出母体药物而发挥治疗作用。
诱导法
产生抗体的脾脏细胞与骨髓瘤细胞相融 合，得到的杂交瘤细胞既能产生抗体又 能在体外培养；
将杂交瘤细胞克隆化，即能产生单一 均匀的抗体。
诱导法
动物免疫技术和杂交瘤技术有机结合而 产生的一种新方法。
利用这种方法所得到的抗体酶催化效果 的好坏很大程度上取决于反应过渡态类 似物，即半抗原的设计。