活体生物体内光学成像技术及其新进展

活体生物体内光学成像技术及其新进展

摘要：活体生物体内光学成像技术是近年发展起来的新兴技术，以其操作简便、灵敏度高、创伤性小成为研究生物活体成像的一种理想方法，在生命科学研究中有着较大优势并得以不断发展。按发光模式可分为生物自发光和荧光激发光两类。其原理为采用荧光素酶基因或荧光报告基团标记的目的细胞，通过灵敏的光学检测仪器，检测活体生物体内的细胞活动和基因行为。利用光学标记的转基因动物模型可以研究疾病的发生发展过程，进行药物研究及筛选等。本文综述了现有活体生物体内光学成像技术的基本原理、分类、比较以及发展应用。

关键词：活体生物体内光学成像；生物自发光成像；荧光激发光成像；文献综述

利用生物体内发出的能够穿透组织的光进行全身成像，是研究生物学过程的重要方法之一。活体生物体内光学成像技术主要采用生物自发光和荧光激发光两种技术。生物自发光是用荧光素酶基因标记或DNA，而荧光激发光则采用荧光报告基团进行标记[1]。成像试剂标记后，利用灵敏的光学检测仪器，可以直接检测活体生物体内的细胞活动和基因行为，是近年来发展起来的新兴技术。与其它的活体内成像技术，如超声、计算机断层显像、核磁共振成像、正电子衍射成像相比，活体生物体内光学成像技术有着灵敏度高、安全、易操作、结果直观、测量快速、数据真实可靠、费用低廉等特点。目前该技术已被广泛应用于生命科学、医学研究和药物研发等领域[2]。

1 活体生物体内光学成像技术的分类及其原理

活体生物体内光学成像系统由作为报告基因的荧光素酶或荧光蛋白、灵敏的光学检测仪器及其分析软件组成。报告基因被插入的多种基因启动之后，通过检测报告基因的表达情况，从而实现靶细胞或靶分子表达的实时检测[3,4]。目前活体生物光学成像仪的最高辨析度为0.1mm左右。活体生物体内光学成像技术按发光模式可分为两类,一种是采用生物发光技术, 另一种是采用荧光激发光技术。现分别加以介绍说明。

1.1 生物自发光技术

1995年，Contag首次在小动物体内检测到含有Lux操纵子的病原菌发出的可见光[5]。1997年，他又首次观察到表达Fluc基因的转基因小鼠在注入荧光素酶底物后后生物发光现象。从此，荧光素酶被广泛应用于小动物成像技术。细菌Lux 操纵子由荧光素酶基因和其底物合成酶基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光。哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素

酶。在ATP及氧气存在时，外源给予底物荧光素，荧光素酶催化荧光素进行氧化反应并发光。只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目成正比。目标细胞产生荧光后，利用高敏感活体生物光学成像系统即可实现生物发光的检测。生物发光技术有以下优势：有着较高的敏感度,可以检测活体内最低至100个左右被标记的细胞, 生物发光对环境变化反应迅速、成像速度快以及图像清晰等。常用的荧光素酶有两类, 一类来自甲虫类动物, 如荧火虫荧光素酶，其底物是荧光素，激活后发出红光，更容易透过组织；另一类来自海底发光动物，如海肾荧光素酶或高细亚荧光素酶，其底物是腔肠素，激活后发出蓝光，由于腔肠素会引起非特异性发光，所以常使用荧火虫荧光素酶。

1.2 荧光激发光技术

近年来，研究者改进了原有的体外荧光成像技术，发展出适用于生物体内的成像系统。其主要原理是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后发射出波长更长的可见光，形成体内生物光源，进行检测。常用的有绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白(DsRed)及其它荧光报告基团，标记方法与体外荧光成像相似，由于红光的穿透性要好于蓝绿光的穿透性，通常选用近红外荧光观测生理指标。荧光激发光技术具有标记靶点的多样性、一次可以应用不同荧光的基因标记不同细胞的优点，因而在进行一些分子生物学以及小分子体内代谢研究中得到了广泛的应用[3]。

2 生物自发光技术与荧光激发光技术的比较

活体生物自发光成像和荧光激发光成像同属于体内可见光成像，均可用于活体内细胞生命活动和基因行为的监测[6]。但两种技术仍存在一定区别。首先，生物自发光成像不需要激发光，而荧光成像则通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光。除标记基因外，荧光成像也可以标记蛋白、多肽等。其次，生物自发光成像需要应用底物荧光素，而荧光激发光成像不需使用底物，操作简单，成本也相对低廉。此外，两种技术发射光的性质也不同。生物自发光技术是以酶和底物的特异作用而发光，特异性极强，因动物本身没有任何自发光，使得生物发光具有极低的背景、极高的信噪比，可以用于精确测量，灵敏度及成像质量较高，在生物体内可检测到10 2数量级的细胞；使用荧光激发光技术时，在受到激发光激发时，生物体很多物质都会发光，例如皮肤、毛发和各种组织等，特别是当被标记的靶点在组织内部，需要较高能量的激发光时，也产生了很强的非特异性荧光，虽然荧光信号远远强于生物发光，发光时间长，对信号检测仪器的要求相对较低，但由于这些非特异性荧光产生的背景噪音使其信噪比远远低于生物发光，使其较难进行定量，灵敏度相对较低，最多只能在生物体内可检测到10 5数量级的细胞。

通过比较可以看到，两种技术各自有着不同的优势，对于不同的研究或同一研究的不同阶段，可根据二者的特点选择合适的方法。在最新的技术进展中，两种技术也存在着联合应用的可能性。有文献报道[7]，可利用绿色荧光蛋白和荧光素酶对细胞或动物进行双重标记，用荧光激发光技术进行体外检测，进行分子生物学和细胞生物学研究，然后利用生物自发光技术进行体内检测，进行活体生物体内研究，这样既取长补短，又能发挥各自的优势，一举两得。

3 活体生物体内光学成像技术的应用

活体生物体内光学成像主要的功能是追踪并检测标记细胞在体内的活动标记基因在体内的表达。这类技术已用于许多领域，具有广泛的适用性。下面介绍几个主要方面。

3.1 癌症及抗癌药物研究

目前的肿瘤研究模型通常是将肿瘤细胞植入动物体内，然后通过肉眼观察、处死动物后的肿瘤体积测定、称重及组织学切片观察等传统的体外方法进行研究。应用活体生物体内光学成像技术可以直接快速地测量各种肿瘤模型中肿瘤的生长和转移，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时的原位置的活体的观测和评价。目前，活体生物体内光学成像能够无创伤地定量检测小鼠整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤。新型的生物成像技术也提高了检测的灵敏度，即使微小的转移灶也能被检测到（可以检测到体内102数量级细胞的微转移）。在基因治疗中，应用体内成效技术可以实时监测目的基因及其表达产物的数量、分布和治疗效果，并进行这些参数的测定以及相互之间的关联分析，优化治疗过程中各种条件，这些会很大程度的加速癌症新疗法的研究。

3.2 干细胞研究

干细胞和在肿瘤治疗、组织工程和细胞治疗等方面拥有巨大的潜力。如果在活体内，在各种组织和器官都保持完整的情况下能够观察干细胞的行为和生物学特性，则会大力促进基于干细胞的各种疾病治疗方法的研究工作，而活体生物自发光与荧光激发光成像技术使这一设想成为了现实。将荧光素酶标记的造血干细胞移植入脾及骨髓，可用于实时观测动物活体体内干细胞造血过程的早期事件及动力学变化。将荧光素酶基因标记的单个造血干细胞植入受射线照射的骨髓损伤的小鼠体内，应用活体生物体内光学成像技术对其进行研究监测。在移植后的早期，可以发现造血干细胞产生离散的聚集点分别分布在脾和骨髓部位；随后早期可检测到的聚集点会扩大，形成新的聚集点或以不同的速度消失；经过进一段的培养后，在小鼠体内发光信号遍布全身。这些研究结果揭示了人造血干细胞可引发造血系统的重建[8]。此外，该技术还可应用于胚胎干细胞肝向分化的研究[8]。

3.3 蛋白质互相作用研究