霍乱弧菌实验室检测【实用参考】
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▪ 分离培养要点（两管三板法）：
➢挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择 性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第一板）。
➢第一管碱性蛋白胨水在３７ ℃增菌６－８小时，沾取菌膜下表层液体， 划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第二板），同时吸取 0.1～0.2 ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。
➢胶体金检测条 ➢荧光PCR检测
检测工作中应关注的事项
霍乱弧菌实验室检测
样品的采集和运输
采集：
➢病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品…… ➢监测：水样，水产品等
运输：
一般要求在3小时内室温（20-25 ℃ ）条件下送达实验室检测 ➢ C-B运输培养基（pH8.4）; （或文腊二氏保存液） ➢ 碱性蛋白胨水（pH8.4-9.2） ：不是最佳的，尤其6小时内还不能进 行培养时，尽量采用 C-B运输培养基。
平板分离及可疑菌落挑取
▪ 平板分离
➢选择性分离平板应采用9cm分离平板（不建议采用7cm平板），一个平
板分离一个样品（严禁一个平板分离2份或以上样品！！ ）。
➢样品平板分离时应进行分区划线分离，平板分离的单个菌落数量应该达到
50个以上。
▪ 可疑菌落挑取
➢经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜 面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验， 鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片 凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌 落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集 的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良 好后再次进行玻片凝集试验加以确证。
霍乱弧菌的实验室检测
霍乱弧菌实验室检测
▪ 目的:提高检出率,减少漏检以及误判的发 生
▪ 手段: 检测人员是否有足够的责任心? 检测试剂准备是否齐全且符合要求? 是否严格按照检测流程进行操作?
霍乱弧菌实验室检测
霍乱概述
▪ 什么是霍乱?
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌（V．cholerae）
引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波 及范围广、危害严重的甲类传染病。
霍乱弧菌实验室检测
水产品分离流程及技术要点
▪ 水产品的采集与保存运送
➢通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生 动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置 ➢涂抹采集： 使用无菌棉签涂抹5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到 20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。
➢整体或局部采集：
在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠内容物25克剪碎后，置灭菌均 质杯或均质袋中，加入225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物， 则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨 水增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外 壳等)整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。
➢第二管碱性蛋白胨水增菌１８小时后划线分离选择性平板（庆大／四号 ／ＴＣＢＳ平板，第三板）。
霍乱弧菌实验室检测
水体分离流程及技术要点
▪ 水体的采集与保存运送
水体的采集一般用无菌的500ml水样瓶采集相对静止的表层水(深度为 30cm以内)500ml，密封加盖后于室温（20-25 ℃ ）3小时内送达实验室 检测。
霍乱弧菌
O1群 非O1群
古典生物型 埃尔托生物型
小川型 Ogawa (AB) 稻叶型 Inaba (AC) 彦岛型 Hikojim (ABC)
霍乱病原菌
O139群（Bengal）
O2-O200群
腹泻病原菌
霍乱弧菌实验室检测
▪ 病原体
O1群，O139群霍乱弧菌
▪ 发病百度文库征：
剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡 不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20－50％（重症病人达70－ 100％）
▪ 分离培养（两管两板法）：
接种后的碱性蛋白胨水37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养 基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）．同时吸0.1～0.2 ml表层培养物转种于 10ml碱性胨水管中作二次霍增乱弧菌菌，实3验7室℃检培测养6～8h再划线接种于选择性培养基 （庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）。
霍乱弧菌实验室检测
▪ 分离培养要点（十倍浓缩碱胨水增菌培养法）：
取450ml水样，用1M 氢氧化钠调整至pH 8.4-9.2。然后加10倍浓缩碱性 胨水50ml。再加入1%亚碲酸钾0.25～0.5 ml和1000单位/ ml青霉素1 ml。 37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大／四号／ ＴＣＢＳ平板）分离培养，同时吸0.1～0.2 ml表层培养物转种于碱性胨 水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基（庆大／ 四号／ＴＣＢＳ平板）。
霍乱弧菌实验室检测
粪便分离流程及技术要点
▪ 粪便的采集与保存运送
以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取1～3mL，成形便采取 指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3～5cm处 采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（ＰＨ8.６-9.2）， 同时划线分离选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板），如不能在６ 小时内送达实验室检测的样品，应插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基 （或文腊二氏保存液）中送检。标本与保存液比例约为1∶5。
▪ 培养特性：
营养要求不高，兼性厌氧，37℃生长，怕酸嗜碱， pH:7.4-9.6快速生 长
▪ 检验依据：
WS 289-2008 《霍乱诊断标准》 霍乱防治手册（1999年第五版）
霍乱弧菌实验室检测
霍乱的实验室检测
样品的采集和运输 不同样品的病原分离流程及技术要点
➢粪便 ➢水体 ➢水产品，食品等
平板分离及可疑菌落挑取 菌落鉴定 常用快速检测方法
➢庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并 随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。 ➢TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、 润湿、稍凸起、边缘整齐霍。乱（弧T菌C实B验S平室检板测生长的菌落不能直挑取进行玻片凝 集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）
➢挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择 性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第一板）。
➢第一管碱性蛋白胨水在３７ ℃增菌６－８小时，沾取菌膜下表层液体， 划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第二板），同时吸取 0.1～0.2 ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。
➢胶体金检测条 ➢荧光PCR检测
检测工作中应关注的事项
霍乱弧菌实验室检测
样品的采集和运输
采集：
➢病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品…… ➢监测：水样，水产品等
运输：
一般要求在3小时内室温（20-25 ℃ ）条件下送达实验室检测 ➢ C-B运输培养基（pH8.4）; （或文腊二氏保存液） ➢ 碱性蛋白胨水（pH8.4-9.2） ：不是最佳的，尤其6小时内还不能进 行培养时，尽量采用 C-B运输培养基。
平板分离及可疑菌落挑取
▪ 平板分离
➢选择性分离平板应采用9cm分离平板（不建议采用7cm平板），一个平
板分离一个样品（严禁一个平板分离2份或以上样品！！ ）。
➢样品平板分离时应进行分区划线分离，平板分离的单个菌落数量应该达到
50个以上。
▪ 可疑菌落挑取
➢经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜 面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验， 鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片 凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌 落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集 的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良 好后再次进行玻片凝集试验加以确证。
霍乱弧菌的实验室检测
霍乱弧菌实验室检测
▪ 目的:提高检出率,减少漏检以及误判的发 生
▪ 手段: 检测人员是否有足够的责任心? 检测试剂准备是否齐全且符合要求? 是否严格按照检测流程进行操作?
霍乱弧菌实验室检测
霍乱概述
▪ 什么是霍乱?
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌（V．cholerae）
引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波 及范围广、危害严重的甲类传染病。
霍乱弧菌实验室检测
水产品分离流程及技术要点
▪ 水产品的采集与保存运送
➢通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生 动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置 ➢涂抹采集： 使用无菌棉签涂抹5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到 20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。
➢整体或局部采集：
在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠内容物25克剪碎后，置灭菌均 质杯或均质袋中，加入225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物， 则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨 水增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外 壳等)整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。
➢第二管碱性蛋白胨水增菌１８小时后划线分离选择性平板（庆大／四号 ／ＴＣＢＳ平板，第三板）。
霍乱弧菌实验室检测
水体分离流程及技术要点
▪ 水体的采集与保存运送
水体的采集一般用无菌的500ml水样瓶采集相对静止的表层水(深度为 30cm以内)500ml，密封加盖后于室温（20-25 ℃ ）3小时内送达实验室 检测。
霍乱弧菌
O1群 非O1群
古典生物型 埃尔托生物型
小川型 Ogawa (AB) 稻叶型 Inaba (AC) 彦岛型 Hikojim (ABC)
霍乱病原菌
O139群（Bengal）
O2-O200群
腹泻病原菌
霍乱弧菌实验室检测
▪ 病原体
O1群，O139群霍乱弧菌
▪ 发病百度文库征：
剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡 不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20－50％（重症病人达70－ 100％）
▪ 分离培养（两管两板法）：
接种后的碱性蛋白胨水37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养 基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）．同时吸0.1～0.2 ml表层培养物转种于 10ml碱性胨水管中作二次霍增乱弧菌菌，实3验7室℃检培测养6～8h再划线接种于选择性培养基 （庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）。
霍乱弧菌实验室检测
▪ 分离培养要点（十倍浓缩碱胨水增菌培养法）：
取450ml水样，用1M 氢氧化钠调整至pH 8.4-9.2。然后加10倍浓缩碱性 胨水50ml。再加入1%亚碲酸钾0.25～0.5 ml和1000单位/ ml青霉素1 ml。 37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大／四号／ ＴＣＢＳ平板）分离培养，同时吸0.1～0.2 ml表层培养物转种于碱性胨 水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基（庆大／ 四号／ＴＣＢＳ平板）。
霍乱弧菌实验室检测
粪便分离流程及技术要点
▪ 粪便的采集与保存运送
以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取1～3mL，成形便采取 指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3～5cm处 采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（ＰＨ8.６-9.2）， 同时划线分离选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板），如不能在６ 小时内送达实验室检测的样品，应插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基 （或文腊二氏保存液）中送检。标本与保存液比例约为1∶5。
▪ 培养特性：
营养要求不高，兼性厌氧，37℃生长，怕酸嗜碱， pH:7.4-9.6快速生 长
▪ 检验依据：
WS 289-2008 《霍乱诊断标准》 霍乱防治手册（1999年第五版）
霍乱弧菌实验室检测
霍乱的实验室检测
样品的采集和运输 不同样品的病原分离流程及技术要点
➢粪便 ➢水体 ➢水产品，食品等
平板分离及可疑菌落挑取 菌落鉴定 常用快速检测方法
➢庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并 随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。 ➢TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、 润湿、稍凸起、边缘整齐霍。乱（弧T菌C实B验S平室检板测生长的菌落不能直挑取进行玻片凝 集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）