浙江大学生物化学实验甲 复件 酵母蔗糖酶的提取原理

酵母蔗糖酶的制备原理

一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介

蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。

酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。

二、酵母蔗糖酶的分离纯化

本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，离子交换柱层析分离纯化。

前三步分离纯化的原理如下：

甲苯石英砂离心上层（甲苯层）：脂溶性物质

酵母细胞破细胞中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等

研磨下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等

取中层50℃水浴中上清：蔗糖酶、可溶性糖等

（水层）保温30分钟沉淀：变性蛋白

取上清加乙醇使蔗糖酶沉淀上清：杂蛋白及可溶性糖等

冰浴中20分钟沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等

三、蔗糖酶活力的测定原理

蔗糖酶

蔗糖葡萄糖+ 果糖(G和F都具半缩醛羟基，该半缩醛羟基可被pH4.5~5.5 氧化为羧基，这样的糖称还原糖)

OH -

还原糖+ 3，5-二硝基水杨酸糖酸+ 3-氨基-5-硝基水杨酸

△（棕红色，540nm处具特征光吸收，OD值与

还原糖含量成正比，可据此进行比色测定）蔗糖酶活力单位定义：一定条件下（50℃，pH4.6），一分钟内能产生1mg 还原糖的酶量。有不舒服记得找医生，千万不要小不舒服酿成大问题