转录组组装

Next-generation transcriptome assembly 应用第二代测序技术的转录组组装 (2)

第一部分：总体介绍挑战与机遇 (2)

第二部分：实验提取与数据分析 (2)

组装前： (2)

组装策略： (3)

选择策略 (4)

选择组装软件 (4)

评价组装的质量 (5)

总结和未来的展望 (5)

全文完 (5)

Next-generation transcriptome assembly 应用第二代测序技术的转录组组装

第一部分：总体介绍挑战与机遇

1.现有的转录组组装技术主要有三大方向：基于参考序列的组装，从头组装，两

者结合的组装方法

2.第二代测序与Sanger测序在转录组中的优势：高灵敏度，高精度，高深度，检

测范围广甚至包括起调节作用的稀有转录本，

3.第二代测序与其他高通量技术如基因芯片技术相比在转录本中的优势：能达到

单碱基水平的分辨率，能反应表达水平的动态变化，能进行从头基因注释

4.第二代测序在组装中的挑战：测序片段(reads)短，质量值偏低，数据量大，要

求大内存或者多核计算机。现在已经有一些软件能解决这些问题如：Velvet，

ABYSS，ALLPATH等

5.转录本组装与基因组组装的差别：1.测序深度问题：各个转录本的深度不一致2.

链特异性，组装软件需要考虑正义链和反义链之间的overlap 3.转录本变异：例

如可变剪切

第二部分：实验提取与数据分析

组装前：

1.文库构建：A. 为了多的构建转录本，核糖体RNA (rRNA) 和丰度过高的转

录本应该被移除，但是如果实验要研究转录本的丰度数值的话，应该构建不

经过移除处理的文库。B. 是否取消文库构建的PCR过程，因为PCR导致高

GC含量的转录本测序深度偏低。需要研发免扩增的技术(Amplification-free

protocols)，最新的单分子测序技术则不需要PCR扩增,尤其是Helicos甚至不

需要构建cDNA文库，但是这种测序技术会大幅增加错误率。应用免扩增的技

术使得转录本的测序深度更平均，更连续，有利于组装。C. 利用链特异性

的RNA测序技术则可以利用互补链的转录本信息来辅助组装。这在基因密度

较大的基因组如细菌，古细菌和低等真核生物中尤为重要。此外在检测高等

生物的antisense transcription中也有应用。

https://www.360docs.net/doc/899336016.html,/bbs/topic/20719610

https://www.360docs.net/doc/899336016.html,/wiki/Antisense_RNA

需要看参考文献27：什么是链特异的RNA测序

2.测序：A. 测序平台的选择：454 SOLiD Solexa B. 测序片段长度：越长越好

C. 是否采用双向测序的策略：双向测序可以将测通的短测序片段连接成较

长的片段，此外不同插入片段的reads还有助于识别可变剪切等。

3.数据预处理：A. 移除人工引入的序列：测序接头low-complexity reads 和

一致的reads (通常由PCR扩增造成)。B. 通过测序质量以及kmer频率移除测

序错误，kmer纠错的缺点是丰富较低的转录本将会被移除。

组装策略：

1.基于参考序列的组装：A. 首先将测序reads利用特定比对软件比对到基因组

上。B. 利用overlap关系构建graph C. 转换graph中的信息为转录本。软件

有Cufflinks, Scripture等。关键步骤是reads比对和构图解码，reads比对分为

两个策略：种子延伸和Burrows–Wheeler转换法。两种算法在处理跨越内

含子的reads处理上相对不同。构图现在主流的也有两种算法：Cufflinks

和Scripture。通常Cufflinks在重构转录本上更加保守而Scripture则在同

一个位置上能得到更多的转录本。

基于参考序列的组装的优点：1.将整体的数据组装转换为各个位点的局部组

装，内存需求小。2.污染及人工引入的序列影响小，因为这些reads不能被

比对回参考序列。3.灵敏度高，能检测低丰度的转录本4.组装的转录本序列

更完整，gap可以使用参考序列来填补，类似的可以获得更长的UTR序列。

4.可以发现参考序列中未注释的新的转录本。

基于参考序列的组装的应用：在组装细菌，古细菌，低等真核生物的转录

本中更加容易，是因为这些物种的基因含有较少的内含子以及较少的可变

剪切。转录本的边界可通过基因组中reads的连续覆盖度来判断，转录本的

起始终止点可通过5端帽子或者polyA来判断。但是在基因密度较大的基因

组中，这种策略无法区分来自两条链的转录出来的具有overlap的转录本，

所以会把他们融合组装成一个转录本，即使他们不是一个基因的多个顺反

字。链特异性的RNA测序也只能区分来自不同链的转录本而不能区分同一

个链上具有overlap的基因的转录本。植物和哺乳动物的基因结构较复杂，

很难进行组装。Cufflinks and Scripture主要是针对哺乳动物设计的重构转录

本的软件。在多倍体植物中，转录本的组装依然是个难题。

基于参考序列的组装的缺点：1.依赖于参考序列，如果参考序列本身不可靠，

那么转录本组装结果可信度很低。2.比对软件会导致错误的比对。3.不容易

组装trans-spliced genes，而这些基因对研究一些癌症一份关键。

其他：基于参考序列的组装当然不能没有参考基因组，然而在缺少本物种

的参考基因组的情况下可以使用相近物种的基因组序列（草莓基因组文章）。

总结：在高质量参考序列的存在下，该方法具有较高的灵敏度和精度，即

使在测序深度10x左右依然能得到全长的转录本。同时利用更长的reads也有

利于转录本的组装。结合基因预测，基于参考序列的组装将成为转录注释

的一个强有力工具。

2.从头组装：不利用基因组，直接利用测序的reads之间的overlap进行组装。

组装的算法为构建De Bruijn graph，然后从graph中连接reads构建转录本。

现在流行的组装策略有A. 首先对数据集进行多次组装，最后合并多次组装

得到的结代表软件有Rnnotator, Multiple-k and Trans-ABySS等。B. 直接从

graph中计算得到转录本。

从头组装的优点：与基于参考序列的组装策略相比，具有以下优点1.不依赖

于参考序列 2.不依赖于比对软件3.从头组装能较好的重建可变剪切或者

来自染色体重组的转录本。

从头组装的应用：对细菌，古细菌，低等真核生物的转录本组装十分轻松。

利用测序深度大于30层、测序长度为35bp的reads成功组装出了酵母的转录

本，其中大部分组装出来是全长转录本。在不构建互补反转的kmer的情况

下，可以区分来自不同链的具有overlap的基因转录本。然而对于来自同一

个链上的具有overlap的基因则依然无法区分，或许可以利用测序深度的不

同、明显的转录起始终止位点、编码阅读框来进行区分。由于在高等真核

生物中，数据量较大而且存在较多的可变剪切变异，所以利用从头组装策

略将对时间和内存有较大的需求，当然可以通过并行多节点运算来解决。

利用从头组装来解决可变剪切的具体策略现在又以下两个：1.利用双向测序

的reads，代表软件：Oases 2.逐步组装策略，首先使用贪婪算法进行初步组

装，再构建De Bruijn graph进行第二级组装，这样会大大提高运算速度。

从头组装的缺点：1.需要较大内存资源。2.需要较高深度的测序。3.对测序

错误敏感。4.高相似度的转录本可能会被合并

3.1和2结合的组装方法：结合基于参考序列的组装的高敏感度和从头组装查

找新基因、可变剪切的能力。是先比对到基因组上再进行从头组装还是先

先进行从头组装，到现在没有一个系统的评价，在不同的条件下需要选择

不同的策略。

先比对再组装：比对完成之后，进行基于参考序列的组装，将组装的得到

的初步结果和reads混在一起作为从头组装的输入文件（要求从头组装既支

持短reads也支持长reads，代表：Trans-ABySS and Oases）。在参考基因组

比较完整的情况下，含有错误的reads或者污染的reads将无法比对回基因组，这使得第二部中的从头组装占用更少的内存，更加准确。当reads中含有较

多污染时，应当首选该策略。

先组装再比对：当参考序列质量较差或者是近缘物种的基因组时，应该先

进行从头组装，在把从头组装得到的序列比对回参考序列进行延伸，构建

scaffold。这中策略的优点是参考序列的错误影响不大。最近的一项鲶鱼转

录本的研究中，在从头组装完成之后比对回棘鱼的基因组作进一步的组装，获得了更长的转录本（N50增加了27%），蚊子转录本也是用这种方法构建

的。

其他：现在还没有能实现结合方法组装的软件，也没有系统的研究这种方

法可能带来的错误。

选择策略：选择策略依赖于数个因素如：是否存在参考序列，测序能力，计算

能力，数据类型，项目的目标等等。转录本的数据能提供大量的信息，有时候一小部分数据的研究也能带来成果，如最近水稻的研究中发现了新649个

基因可能与耐盐性有关。还有的研究只关注数据的一部分，如老年痴呆症研究中假设发病机理与可变剪切的起始位点及剪切模式相关。随着越来越多的基因组被测序，基于参考序列的组装策略应用将越来越广泛，当然没有参考序列的只能使用从头组装方法。

选择组装软件：不同的测序平台有相应的不同数据类型，错误模型，因此也

有不同的相应的组装算法、组装软件

评价组装的质量：对于基因组的组装结果评价已经有较多的研究，但是转录

组质量的评价现在还没有一个统一的标准。现在主要的评价指标有：准确性，

完整性，连续性，嵌合现象，对变异的处理。

总结和未来的展望：两种不同的组装方法的发展使得转录组组装能应用于

几乎任何基因组，甚至在宏转录组中。HPC(高性能计算)的发展大大的减少

了组装大量数据的运算时间，最近也有研究在开发基于云计算的组装软件。

同时，实验方面如RNA提取和测序技术的发展也大大的改善了组装的结果。

第三代测序技术如PacBio的应用，使得reads的长度大幅提高，加入这种技术

的通量能达到现在第二代测序技术的能力，那么相信在不久的将来，转录组

的研究可能不在需要组装，而直接应用测序数据。

全文完

转录组测序结题报告

转录组测序结题报告 1．mRNA纯化：抽提得到的总RNA首先利用10U的DNaseI（Ambion，美国）在37℃消化1小时；然后利用Micropoly(A)PuristTM mRNA purification kit（Ambion，美国），进行mRNA纯化：把RNA稀释到250μl的体积，按照Kit的操作步骤（Cat.No:

1919）进行；最后得到的mRNA用100μl预热的THE缓冲液洗脱，利用NanoDrop 进行定量。 2．cDNA合成： cDNA合成是在Ng等2005年发表的方法基础上改进而成（文献1，图1）。第一链cDNA合成利用GsuI-oligo dT作为反转录引物，10μg的mRNA作为模板，用1000 单位的Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen，美国)在42℃作用1小时完成；随后利用NaIO4（Sigma，美国）氧化mRNA的5’帽子结构，并连接生物素；通过Dynal M280磁珠（Invitrogen，美国）筛选连接了生物素的mRNA/cDNA，并通过碱裂解释放第一链cDNA；然后通过DNA ligase（TaKaRa，日本）在第一链cDNA的5’末端加上接头，然后通过Ex Taq polymerase (TaKaRa，日本)合成第二链cDNA。最后通过GsuI酶切去除polyA和5’端接头。图1. 全长cDNA合成示意图 3．cDNA测序：合成的cDNA利用超声仪（Fisher）打断到300-500bp的范围，利用Ampure beads（Agencourt，美国）进行纯化。随后纯化的cDNA利用TruSeq TM DNA XXmple Prep Kit – Set A (illumina，美国)制备文库，并利用TruSeq PE Cluster Kit (illumina，美国)进行扩增。最后在illumina机器上进行测序反应。测序得到的数据统计见表1. 表1. Solexa测序统计样品对照 1 2

转录组学主要技术与应用研究

转录组学主要技术及其应用研究姓名：梁迪专业：微生物学年级：2013 学号：3130179 二零一四年六月十五日

转录学主要技术及其应用研究摘要：转录组(transcriptome)是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合。转录组学研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。目前，转录组学研究技术主要包括两种：基于杂交技术的微阵列技术（microarray)和基于测序技术的转录组测序技术，包括表达序列标签技术（Expression Sequence Tags Technology，EST）、基因表达系列分析技术（Serial analysis of gene expression，SAGE）、大规模平行测序技术（Massively parallel signature sequencing，MPSS）、以及RNA 测序技术（RNA sequencing，RNA-seq）。文章主要介绍了以上转录组学主要研究技术的原理、技术特点及其应用，并就这些技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论，为其今后的研究与应用提供参考。关键词：转录组学；微阵列技术；转录组测序技术；应用 Study on the main technologies of transcriptomics and their application Abstract: The transcriptome is the complete set of transcripts for certain type of cells or tissues in a specific developmental stage or physiological condition. Transcriptome analysis can provide a comprehensive understanding of molecularmechanisms involved in specific biological processes and diseases from the information on gene structure and function. Currently, transcriptomics technology mainly includes microarry -based on hybridization technology and transcriptome sequencing-based on sequencing technology, involving Expression sequence tags technology, Serial analysis of gene expression, Massively parallel signature sequencing and RNA sequencing. The detailed principles, technical characteristics and applications of the main transcriptomics technologies are reviewed here, and the challenges and application potentials of these technologies in the future are also discussed. This will present the useful information for other researchers. Keywords: transcriptomics ; microarray ; transcriptome sequencing; application 随着后基因组时代的到来，转录组学、蛋白质组学、代谢组学等各种组学技术相继出现，其中转录组学是率先发展起来以及应用最广泛的技术[1]。

转录组RNAseq术语解释

RNA-Seq名词解释 1.index 测序的标签，用于测定混合样本，通过每个样本添加的不同标签进行数据区分，鉴别测序样品。 2.碱基质量值（Quality Score或Q-score）是碱基识别（Base Calling）出错的概率的整数映射。碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。 3.Q30 碱基质量值为Q30代表碱基的精确度在99.9%。 4.FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的fragment个数。计算公式为公式中，cDNA Fragments 表示比对到某一转录本上的片段数目，即双端Reads数目；Mapped Reads(Millions)表示Mapped Reads总数，以10为单位；Transcript Length(kb)：转录本长度，以kb个碱基为单位。 5.FC（Fold Change）即差异表达倍数。 6.FDR（False Discovery Rate）即错误发现率，定义为在多重假设检验过程中，错误拒绝(拒绝真的原(零)假设)的个数占所有被拒绝的原假设个数的比例的期望值。通过控制FDR来决定P值的阈值。 7.P值（P-value）即概率，反映某一事件发生的可能性大小。统计学根据显著性检验方法所得到的P 值，一般以P<0.05 为显著，P<0.01为非常显著，其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.05或0.01。 8.可变剪接（Alternative splicing）

高通量测序技术在宏基因组学中的应用

高通量测序技术在宏基因组学中的应用 196 中国医药生物技术 2019年6月第8卷第3期 Chin Med Biotechnol, June 2019, Vol. 8, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2019.03.008 ·综述· 高通量测序技术在宏基因组学中的应用刘莉扬，崔鸿飞，田埂随着生命科学及研究技术的不断发展，人们对生命现象的了解更加深入。微生物因为其在工业、农业、医疗卫生、环境保护等各方面的重要地位，被越来越多的研究者关注。自然状态下，微生物几乎无处不在，无论是在自然环境如土壤、海洋甚至一些极端环境（如酸矿水）中，还是在人类和动物的皮肤、口腔、肠道中，微生物都与它们所在的环境相伴相生。除生存环境极为广泛以外，微生物的数量还极为庞大，以人类为例，人类的基因总数只占人类身上微生物基因总数的 1% 左右[1] 。这些微生物是环境能量、物质代谢的重要中间环节和组成部分，它们有些可以代谢生成周围其他生物所必需的底物，而有些则会代谢生成毒性物质，导致环境污染，或者宿主的疾病。因此，对微生物的研究显得极为重要。微生物的传统研究方法主要是依赖将微生物进行培养和分离（culture-dependent）。然而，到目前为止，绝大多数微生物（99% 以上）不能依靠这样的方式获得，这极大地限制了人们对微生物的研究。随着测序技术和数据处理分析能力的飞速发展，以及人们对微生物之间相互依存的共生互利和平衡关系的深入认识，一种可以对环境中所有微生物进行研究而不依赖培养的新方向——宏基因组学应运而生。 1 宏基因组简介宏基因组（Metagenome），或称为“元基因组”，于 1998 年由 Handelsman 等[2] 在一篇研究土壤微生物的文章中首次提出，当时的定义是“微生物群落中的所有基因组的集合”。在此之后，宏基因组的概念渐渐为人们所接受，并涌现了许多针对海洋、土壤、人类肠道等微生物的典型研究工作[3-6]，目前的宏基因组研究主要指对细菌的研究。宏基因组学研究与传统微生物研究方式的最大区别在于把微生物看成一个整体，摆脱了对单个微生物培养和分离的步骤，直接对环境中所有的微生物进行研究，进而可以全面地对所有微生物进行分析。随着宏基因组学研究技术的发展和研究者兴趣的不断增加，对其研究手段和研究对象的重点也不断发生着变化，大致可以分为三个阶段：①针对 16S rRNA 为主要研究对象的核糖体 RNA 研究；②以环境中所有遗传物质为研究对象；③以环境中所有转录本为主要研究对象的宏转录组研究。狭义的宏基因组学研究指第二个阶段，本文提到的“宏基因组学”倾向于广义的概念，即三个阶段的总和。

转录组测序技术的应用及发展综述

转录组测序技术的应用及发展综述摘要：转录组测序（RNA-Seq）作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。RNA-Seq利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA 反转录而成cDNA文库进行测序，通过统计相关读段(reads)数计算出不同RNA的表达量，发现新的转录本；如果有基因组参考序列，可以把转录本映射回基因组，确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息，已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。文章主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种RNA-Seq的研究平台，着重介绍RNA-Seq的原理、用途、步骤和生物信息学分析，并就RNA-Seq技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论及在相关领域的应用等内容，为今后该技术的研究与应用提供参考。关键词: RNA-Seq；原理应用；方法；挑战；发展前景 Abstract：Transcriptome sequencing (RNA-Seq) is a kind of high efficiency, quick transcriptome research methods are changing our understanding of transcriptome. RNA-Seq to use high-throughput sequencing of tissues or cells of all RNA reverse transcription into cDNA library were sequenced, through statistical correlation read paragraph (reads) numbers were calculated from the expression of different RNA transcripts, find new; if the genome reference sequence, the transcripts mapped to genomic, determine the position of the transcription shear condition, more genetic information, has been widely used in biological research, medical research, clinical research and drug development. This paper compared several methods of platform transcriptome studies and several kinds of RNA-Seq in recent years, RNA-Seq focuses on the principle, purpose, steps and bioinformatics analysis, and discusses the RNA-Seq technology challenges and future development prospect and the application in related field and other content, provide the reference for the research and application of the technology future. Key word：RNA-Seq ;application; principle; method; challenge; development prospects

转录组测序

真核mRNA测序是基于HiSeq平台，对真核生物特定组织或细胞在某个时期转录出来的所有mRNA进行测序，既可研究已知基因，亦能发掘新基因，全面快速地获得mRNA序列和丰度信息。真核mRNA测序方法可以分为：有参考转录组、无参考转录组以及数字基因表达谱（DGE）三大类。技术参数案例解析［案例一］ mRNA和small RNA转录组揭示新合成异源六倍体小麦杂种优势的动态部分同源调控诺禾致源携手中国农业科学院作物科学研究所，利用转录组测序技术，对杂交亲本、新合成异源六倍体小麦的幼苗、穗和种子进行了mRNA和smallRNA测序及信息分析，发现新合成异源六倍体小麦绝大部分基因表现为12类基因表达模式，包括加性表达，少部分的基因表现为非加性，基因的非加性表现出非常强的发育时期特异性，与生长势密切相关；miRNA的丰度随着倍性的增加逐渐下降，新合成异源六倍体小麦中非加性表达的 miRNA也同样表现出亲本显性表达，miRNA的表达敏感性与生长势和适应性密切相关。该研究揭示了不同倍性非对等杂种优势的分子基础。［案例二］磷酸三（2,3-二氯丙基）酯（TDCPP）对四膜虫生长繁殖的抑制作用与核糖体相关诺禾携手华中农业大学,利用转录组测序和信息分析技术,研究了TDCPP处理组和对照组差异基因表达,并对差异表达基因进行KEGG通路分析,发现核糖体基因通路显著富集, 同时伴随胞浆和粗面内质网上核糖体数量减少体积增大。这些探索表明四膜虫可以作为TDCPP反应的生物指标，为后续研究TDCPP作用其他生物的毒理机制提供了新视角。［案例三］转录组揭示寄主植物与宿主之间进行RNA交换的机制参考文献菟丝子被称作勒死草，会用被称作吸根的专用器官穿透宿主组织与其建立联系，可以吸取宿主的水份与营养物质，也能吸取RNA(mRNA)分子。本研究分别选取菟丝子和拟南芥及番茄的共生体茎上的三段组织进行转录组学的研究，发现寄生植物与寄主之间mRNA的转移量很大且是一种双向转移的模式；两种宿主相比，更多的拟南芥RNA被转移到菟丝子植物之中，而且菟丝子与拟南芥之间较自由的交换，可表明调节菟丝子吸根选择性的机制可能是宿主特异性的，从而揭示了寄主与宿主之间进行RNA转移的遗传机制。 [1] Li A, Liu D, Wu J, et al . mRNA and small RNA transcriptomes reveal insights into dynamic homoeolog regulation of allopolyploid heterosis in nascent hexaploid wheat [J]. The Plant Cell, 2014: tpc. 114.124388.[2] Jing Li, John P , Giesy, Liqin Yu, et al . Effects of Tris (1,3-dichloro-2-propyl) Phosphate (TDCPP) in Tetrahymena Thermophila: Targeting the Ribosome. Scientific Reports. 2015, 5:10562. [3] Kim G, LeBlanc M L, et al . Genomic-scale exchange of mRNA between a parasitic plant and its hosts [J]. Science, 2014, 345(6198): 808-811. 图1 非加性表达miRNA与亲本显性表达miRNA的等级聚类分析和两者的关联图2 显著富集的KEGG通路图3 菟丝子与拟南芥、番茄转移RNA和非转移RNA的表达和富集分析样品要求文库类型测序策略数据量类型分析内容项目周期真核有参转录组测序真核无参转录组测序 6 Gb、8 Gb、10 Gb、12 Gb clean data 6 M clean reads 3 Gb clean data 项目数据至少12 Gb clean data 数字基因表达谱（DGE） HiSeq PE150 HiSeq PE150 HiSeq SE50HiSeq PE125普通转录组文库；链特异性转录组文库 40天50天30天 35天（有参）45天（无参） RNA样品总量≥1.5 μg； RNA样品浓度≥50 ng/μL 参考基因组比对新转录本预测可变剪切分析SNP/InDel分析基因表达水平分析RNA-seq整体质量评估转录因子注释GO/KEGG富集分析蛋白互作网络分析基因共表达网络构建可视化结果展示参考转录组拼接转录本/Unigene长度统计基因功能注释NR，NT，Swiss Prot GO，KEGG，KOG Protein Family CDS预测分析SNP/SSR分析

组学研究

组学研究结构基因组学是继人类基因组之后又一个国际性大科学热点，主要目的是试图在生物体的整体水平上（如全基因组、全细胞或完整的生物体）测定出（以实验为主、包括理论预测）全部蛋白质蛋白质－蛋白质、蛋白质－核酸、蛋白质－多糖、蛋白质－蛋白质－核酸－多糖、蛋白质与其他生物分子复合体的精细三维结构，以获得一幅完整的、能够在细胞中定位以及在各种生物学代谢途径、生理途径、信号传导途径中全部蛋白质在原子水平的三维结构全息图。在此基础上，使人们有可能在基因组学、蛋白质组学、分子细胞生物学以致生物体整体水平上理解生命的原理。对疾病机理的阐明、对疾病的防治有重要应用意义。随着测序的完成，功能基因组学研究成为研究的主流，它从基因组信息与外界环境相互作用的高度，阐明基因组的功能。功能基因组学的研究内容：人类基因组DNA 序列变异性研究、基因组表达调控的研究、模式生物体的研究和生物信息学的研究等。 (1)基因组表达及调控的研究。在全细胞的水平，识别所有基因组表达产物mRNA和蛋白质，以及两者的相互作用，阐明基因组表达在发育过程和不同环境压力下的时、空的整体调控网络。 (2)人类基因信息的识别和鉴定。要提取基因组功能信息，识别和鉴定基因序列是必不可少的基础工作。基因识别需采用生物信息学、计算生物学技术和生物学实验手段，并将理论方法和实验结合起来。基于理论的方法主要从已经掌握的大量核酸序列数据入手，发展序列比较、基因组比较及基因预测理论方法。识别基因的生物学手段主要基于以下的原理和思路：根据可表达序列标签(STS)；对染色体特异性cosmid进行直接的cDNA选择；根据CpG岛；差异显示及相关原理；外显子捕获及相关原理；基因芯片技术；基因组扫描；突变检测体系，等等。（3）基因功能信息的提取和鉴定。包括：人类基因突变体的系统鉴定；基因表达谱的绘制；“基因改变-功能改变”的鉴定；蛋白质水平、修饰状态和相互作用的检测。（4）在测序和基因多样性分析。人类基因组计划得到的基因组序列虽然具有代表性，但是每个人的基因组并非完全一样，基因组序列存在着差异。基因组的差异反映在表型上就形成个体的差异，如黑人与白人的差异，高个与矮个的差异，健康人与遗传病人的差异，等等。出现最多基因多态性就是单核苷酸多态性(SNPs)。（5）比较基因组学。将人类基因组与模式生物基因组进行比较，这一方面有助于根据同源性方法分析人类基因的功能，另一方面有助于发现人类和其他生物的本质差异，探索遗传语言的奥秘。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。之后得到迅速发展并渗透到多项领域，比如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学，植物学等与人类健康护理密切相关的领域。基因组学和蛋白质组学分别从基因和蛋白质层面探寻生命的活动，而实际上细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面

转录组学领域研究进展一览(!!!)

转录组学领域研究进展一览关键词：Transcriptomics；RNA；RT-PCR；Profiling；Synthesis；Sequencing；Purification；Micro arrays；Extraction 转录组学（tranomics），是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科，也就是说，转录组学是从RNA水平来研究基因的表达情况。转录组即一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。本文中，小编对近年来转录组学领域的相关研究进行了盘点，分享给各位！【1】北大教授开发单细胞全转录组测序新技术 2014年4月29日，北京大学生物动态光学成像中心黄岩谊、汤富酬课题组在《美国科学院院刊》(PNAS)上发表题为“Microfluidic single-cell whole-tranome sequencing”的论文。该研究利用微流控芯片技术实现了高质量单细胞的全转录组测序样品准备，全面提高了单细胞全转录组分析的准确性和可靠性。细胞是生命活动的基本功能单位，而在生物体内没有任何两个细胞是完全相同的。传统的生命科学与医学研究，绝大多数情况下都是针对混合的大量细胞进行的，无法观察到单个细胞之间细微的差别。近年来不断发展的实验技术，提供了更加定量与客观的证据，表明在许多关键生命过程例如胚胎发育、细胞分化、疾病发生与发展等过程中，特定的单个细胞行为，以及其间的个体化差异与异质性，导致了极其重要甚至是决定性的结果。而之前基于大量细胞平均测量所获得的结果并无法正确反映复杂生物体系的全面真实信息，严重掩盖了独立个体样本的行为以及生命现象中大量存在的随机行为。针对单个细胞的研究，是细胞生命分析技术所追求的极限状态，是对传统技术极大的挑战。【2】doi：10.1126/science.aaf2403 在一项新的研究中，来自瑞典卡罗琳斯卡研究所和皇家理工学院等机构的研究人员开发出一种新的被称作空间转录组学（spatial tranomics）的高分辨率方法研究一种组织中哪些基因是有活性的。这种方法能够被用于所有类型的组织中，而且在临床前研究和癌症诊断中是有价值的。相关研究结果发表在2016年7月1日那期Science期刊上，论文标题为“Visualization and analysisof gene expression

华大转录组测序内部培训资料

（内部资料，请勿外传）动植物转录组（Transcriptome ）产品说明书科技服务体系动植物研究方向

版本信息： 2011年07月08日

目录 1产品概述 (1) 1.1 什么是转录组测序 (1) 1.2 转录组测序的产品功能 (1) 1.3 转录组测序产品优势 (1) 1.4 转录组测序产品发展史 (1) 1.5 项目执行时间 (3) 1.6 产品交付结果 (3) 2转录组测序研究方法 (4) 2.1 产品策略 (4) 2.2 样品准备 (5) 2.2.1 RNA样品要求 (5) 2.2.2 RNA样品送样标准 (6) 2.2.3 RNA提取的组织用量建议 (6) 2.3 样品运输要求 (7) 2.3.1 样品包装 (7) 2.3.2 样品标识 (8) 2.3.3 样品运输条件 (8) 2.4 文库的构建及测序 (9) 2.4.1 实验流程 (9) 2.4.2 测序及数据处理 (10) 2.5 转录组生物信息学分析 (10) 2.5.1 没有参考序列的转录组De novo (10) 2.5.2 有参考序列的转录组Re-sequencing (18) 2.5.3 参考文献 (24) 3成功案例 (25)

3.1 华大成功案例 (25) 3.2 相关文献解读 (26)

1产品概述 1.1什么是转录组测序？转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。转录组测序是指用新一代高通量测序技术对物种或者组织的转录本进行测序并得到相关的转录本信息。 1.2转录组测序的产品功能 1.获得物种或者组织的转录本信息； 2.得到转录本上基因的相关信息，如：基因结构，功能等； 3.发现新的基因； 4.基因结构优化； 5.发现可变剪切； 6.发现基因融合； 7.基因表达差异分析。 1.3转录组测序产品优势覆盖度高：检测信号是数字信号，几乎覆盖所有转录本；检测精度高：几十到数十万个拷贝精确计数；分辨率高：可以检测到单碱基差异，基因家族中相似基因及可变剪切造成的不同转录本的表达；完成速度快：整个项目周期只需要50个工作日时间；成本低：基本上每个实验室可以承担相关研究经费。 1.4转录组测序产品发展史转录组的研究手段大体包括：EST序列构建及研究，芯片研究，运用第二代测序技术研究等。EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次sanger测序获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在

RNA-Seq项目常见问题与解答

RNA-Seq项目常见问题与解答这两年随着测序成本的下降和转录组研究的日渐火热，RNA-seq俨然已经成为了分子生物学课题组推进项目的首选方向。在我们接触的转录组项目中，有些老师对项目分析结果存在或多或少不清楚或有疑惑的地方。那么春天来了，花儿开了，今天福利也到了，我们特意将转录组项目中常见的一些问题进行了汇总，各位老师可以按需自取哈。 1．如何判定生物学重复一致性的高低？生物学重复统计方法及公式答：（1）皮尔逊相关系数r可以作为生物学重复相关性的评估指标，理想的生物学重复试验r2≧0.92。考虑到个体差异、取材环境、时间以及人员操作熟练程度等因素对测序数据的影响，一般r2≧0.8为可接受范围。（2）Pearson（皮尔逊）相关系数：皮尔逊相关也称为积差相关（或积矩相关）是英国统计学家皮尔逊于20世纪提出的一种计算直线相关的方法。 2．DEG基因用Transcripts还是Unigenes？答：DEG基因用的是Unigene。 3．transcript-id代表什么意思？为什么有的基因有多个transcript-id？答：基因转录本id；因为可变剪切的缘故，一个基因可能有多个转录本。 4．在miRNA鉴定中，可能成为miRNA的reads是怎样计算的？哪些条件会影响到mrd值？micro RNA在不同组织有异构体的存在，是如何处理的？答：与 Rfam， miRbase， RepBase和 Exon\Intro 序列库进行比对，获得 sRNA 注释信息，以此作为预测新的 miRNA 的基础。 miRNA的鉴定是利用miRDeep2软件进行已知及新（保守及非保守）的miRNA鉴定。miDeep2会在reads比对到基因组上的位置两端分别延伸75、15bp进行结构预测，此软件认为极可能与可能是miRNA的根据是通过mrd值来区分的，mrd>-10为可能，mrd>0为极可能；影响mrd值的有reads在基因组上的分布和碱基结合的自由能等； 5．对于有生物学重复的项目，怎样计算差异基因？答：两两比对使用的是R的EBseq包, 是基于负二项分布检验的方式对reads数进行差异显著性检验，重复间的比对使用的是R的DEseq包，是基于分层贝叶斯模型的原理对组合内样品进行分析。 6．外显子，内含子及基因间区各自的比例如何评估建库情况？答：理论上，来自成熟mRNA的reads应该比对到外显子区。但是，由于基因组注释水平、可变剪切导致的内含子序列保存，以及很多RNA（比如lncRNA）就来自基因间区和内含子，因此有比对到内含子和基因间区的reads。受物种等的影响外显子所占比例不同，一般情况下外显子区域所占比例超过70%即比较理想。

转录调控-无参转录组测序最优解决方案

微生物基因组测序16S/18S/ITS等扩增子测序细菌基因组 de novo 测序真菌基因组 de novo 测序微生物重测序宏基因组测序动植物基因组测序全基因组su rvey 全基因组 de novo 测序泛基因组测序变异检测BSA性状定位遗传图谱全基因组关联分析群体进化Hi-C测序人类基因组测序全基因组测序外显子测序目标区域测序单细胞基因组测序建库测序建库测序版权所有：北京诺禾致源科技股份有限公司转录调控测序真核有参转录组测序医学转录组测序真核无参转录组测序比较转录组与泛转录组测序原核转录组测序宏转录组测序单细胞转录组测序LncRNA测序cir cRNA测序small RNA测序ChiP-seq RIP-seq 全基因组甲基化测序分析内容样本要求文库类型测序平台数据量三代测序样品类型：total 样品总量：RIN ：≥8cDNA 文库（1-2K 、2-3K 、3-6K ） Pa cBio RS Ⅱ 推荐8个 SMRT cell ／sam p l （约6G 数据量）图1 Trinity拼接基因 ATP5J 和 GABPA 的转录本 Corset 应用优势在无参转录组项目中,利用主流软件 Trinity 进行 De novo 拼接转录本, 而后选取最长的转录本作为 unigene 进行后续分析。但是研究表明，完全以 unigene 作为基因的替身，有失恰当。因为，拼接出来的最长转录本会掩盖掉本应真实的较短转录本（基因的 isoform）所具备的参考序列意义。 Corset 是 Trinity 官方推荐软件，可对拼接得到的转录本进行过滤和聚类，获得更接近真实的“gene”，突破了传统“unigene”概念。 Corset 应用案例 ATP 5J 和 GABPA 两个基因有一段重叠的部分，当使用无参拼接时,会得到8条转录本,其中3条最长的转录本为拼接引起的假阳性转录本（如 C lust er b 中的转录本）。若使用 uni gene 的方法,根据 uni gene 最长转录本原则,会选取假阳性转录本进行后续分析,这并不准确。而使用 Cors et 聚合“G ene”的方法,可以将这些真实的转录本分离出来（如 C lust e r a 和 C lus ter d ）。无参转录组拼接升级 Corset 让“基因”概念更准确策略 1 Trinity Corset or No Clustering Unigene *.fasta transcript.fasta 基因分类注释参考文献 [1] Davidson, N.M. and A. Oshlack, Corset: enabling differential gene expression analysis for de novo assembled transcriptomes. Genome Biol, 2014. 15(7): p. 410. 阅读原文 >> [2] Xu Z, Peters R, Weirather J. Full ‐length transcriptome sequences and splice variants obtained by a combination of sequencing platforms applied to different root tissues of Salvia miltiorrhiza and tanshinone biosynthesis[J]. Plant Journal, 2015, 82(6): 951-961. 阅读原文 >> 首页科技服务测序指南 NGS项目文章提高参考序列准确性提高差异表达基因检出率准确检测差异表达变化无参转录组测序最优研究策略分析方法全新升级三代测序大招辅助&

转录组学的一些概念

Gene Ontology可分为分子功能（Molecular Function），生物过程（biological process）和细胞组成（cellular component）三个部分。蛋白质或者基因可以通过ID对应或者序列注释的方法找到与之对应的GO号，而GO号可对于到Term，即功能类别或者细胞定位。功能富集分析: 功能富集需要有一个参考数据集，通过该项分析可以找出在统计上显著富集的GO Term。该功能或者定位有可能与研究的目前有关。 GO功能分类是在某一功能层次上统计蛋白或者基因的数目或组成，往往是在GO 的第二层次。此外也有研究都挑选一些Term，而后统计直接对应到该Term的基因或蛋白数。结果一般以柱状图或者饼图表示。 1.GO分析根据挑选出的差异基因，计算这些差异基因同GO 分类中某（几）个特定的分支的超几何分布关系，GO 分析会对每个有差异基因存在的GO 返回一个p-value，小的p 值表示差异基因在该GO 中出现了富集。 GO 分析对实验结果有提示的作用，通过差异基因的GO 分析，可以找到富集差异基因的GO分类条目，寻找不同样品的差异基因可能和哪些基因功能的改变有关。 2.Pathway分析根据挑选出的差异基因，计算这些差异基因同Pathway 的超几何分布关系， Pathway 分析会对每个有差异基因存在的pathway 返回一个p-value，小的p 值表示差异基因在该pathway 中出现了富集。 Pathway 分析对实验结果有提示的作用，通过差异基因的Pathway 分析，可以找到富集差异基因的Pathway 条目，寻找不同样品的差异基因可能和哪些细胞通路的改变有关。与GO 分析不同，pathway 分析的结果更显得间接，这是因为，pathway 是蛋白质之间的相互作用，pathway 的变化可以由参与这条pathway 途径的蛋白的表达量或者蛋白的活性改变而引起。而通过芯片结果得到的是编码这些蛋白质的mRNA 表达量的变化。从 mRNA 到蛋白表达还要经过microRNA 调控，翻译调控，翻译后修饰（如糖基化，磷酸化），蛋白运输等一系列的调控过程，mRNA 表达量和蛋白表达量之间往往不具有线性关系，因此mRNA 的改变不一定意味着蛋白表达量的改变。同时也应注意到，在某些pathway 中，如EGF/EGFR 通路，细胞可以在维持蛋白量不变的情况下，通过蛋白磷酸化程度的改变（调节蛋白的活性）来调节这条通路。所以芯片数据pathway 分析的结果需要有后期蛋白质功能实验的支持，如Western blot/ELISA，IHC（免疫组化），over expression（过表达），RNAi（RNA 干扰），knockout（基因敲除），trans gene（转基因）等。 3.基因网络分析目的：根据文献，数据库和已知的pathway 寻找基因编码的蛋白之间的相互关系(不超过1000 个基因)。

病毒宏基因组学方法优缺点及意义【可编辑版】

病毒宏基因组学方法优缺点及意义【可编辑版】病毒宏基因组学方法优缺点及意义病毒宏基因组学方法优缺点及意义病毒个体微小，多数病毒直径在100nm，较大的病毒直径300~450nm,较小仅为18~22nm,结构简单，不能独立复制需要依赖于宿主细胞复制繁殖，被许多生物学家认为是处于生命和非生命交叉区域的存在物。据估计目前对病毒的发掘还不到1%,对病毒的研究具有广阔的前景和现实意义。病毒独特的结构和特性给病毒的研究和鉴别带来许多困难，主要体现在两个方面: 第一，病毒没有专门的宿主细胞系，60%以上的病毒无法成功的进行离体培养或在培养中不能表达致病性;第二，病毒基因本身变异率高，通过与宿主间的相互作用进化，增加核酸多样性，产生新病毒，导致宿主范围扩大、跨物种传播.对细菌的研究可以通过保守的16sRNA的分析来定位分类信息、进化关系和种群多样性等。对于真菌有18sRNA及ITS序列。然而病毒不像细菌真菌，没有固定保守的进化标记基因。所以一些传统研究方法的应用受到限制，不能完全满足病毒研究的需要。如电镜观察病毒的灵敏性不高，细胞培养病毒可能观察不到细胞病变，血清学反应中不但难以获得高价抗体而且容易出现交叉反应导致错误结果，传统PCR方法对未知序列及高变异的病毒研究难以发挥作用。加之近年来病毒流行病的频繁发生及其可怕的传染性，对人类及动植物的健康产生严重威胁，如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒等，给人们造成了巨大的恐慌和经济损失。因此，对病毒基因组的研究、致病源的探索、病毒在生物体和环境中如何存在及传播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，宏基因组学的概念是1998年由Handelsman首次提出，对特定环境

转录组学研究进展精修订

转录组学研究进展集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#

转录组研究前沿随着转录组学，蛋白组学，代谢组学等组学的不断涌现，生物学研究已经跨入后基因组时代，转录组学作为一个率先发展起来的技术开始在生物学前沿研究中得到了广泛的应用。广义转录组（Transcriptome）系指从一种细胞或者组织的基因组所转录出来的RNA的总和，包括编码蛋白质的mRNA和各种非编码RNA（rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA,microRNA 和其他非编码RNA等）。狭义转录组系指所有参与翻译蛋白质的mRNA 总和。转录组研究历史：自从上世纪90 年代中期以来，随着微阵列技术被用于大规模的基因表达水平研究，转录组学作为一门新技术开始在生物学前沿研究中展露头脚并逐渐成为生命科学研究的热点。原因如下：1)蛋白质组研究需要更多的转录组研究的信息：因为单一的蛋白质组数据不足以清楚地鉴定基因的功能，因此蛋白质组的数据需要转录组的研究结果加以印证。2)非编码RNA研究的不断发展，使得转录组研究的范围不断扩大和深化。 3) 随着新一代高通量测序技术运用到转录组研究之中，转录组研究中提供的数据量呈现爆炸式的扩增，极大拓宽了转录组研究解决科学问题的范围。

目前进行转录组研究的技术主要包括如下三种：1）基于杂交技术的微阵列技术；2）基于Sanger测序法的SAGE (serial analysis of gene expression)和MPSS(massively parallel signature sequencing)；3）基于新一代高通量测序技术的转录组测序。各种转录组研究技术的特点如下：基于杂交技术的DNA芯片技术只适用于检测已知序列，却无法捕获新的mRNA。细胞中mRNA的表达丰度不尽相同，通常细胞中约有不到100种的高丰度mRNA，其总量占总mRNA一半左右，另一半mRNA由种类繁多的低丰度mRNA组成。因此由于杂交技术灵敏度有限，对于低丰度的mRNA，微阵列技术难以检测，也无法捕获到目的基因mRNA表达水平的微小变化。 SAGE是以Sanger测序为基础用来分析基因群体表达状态的一项技术。SAGE 技术首先是提取实验样品中RNA并反转录成cDNA，随后用锚定酶(Anchoring enzyme)切割双链cDNA，接着将切割的cDNA 片段与不同的接头连接，通过标签酶酶切处理并获得得到SAGE 标签，然后PCR 扩增连接SAGE 标签形成的标签二聚体，最后通过锚定酶切除接头序列，以形成标签二聚体的多聚体并对其测序（关于SAGE方法细致的介绍请参考网站）。SAGE可以在组织和细胞中定量分析相关基因表达水平。在差异表达谱的研究中，SAGE可以获得完整的转录组学图谱以及发现新的基因并鉴定其功能、作用机制和通路等。

RNA产品线常见问题汇总

RNA线常见问题汇总 Q:1、如何确定研究物种有无参考基因组？ A:根据研究物种的拉丁文名,可在Ensembl （https://www.360docs.net/doc/899336016.html,/index.html）、JGI(https://www.360docs.net/doc/899336016.html,/) NCBI(https://www.360docs.net/doc/899336016.html,/)中搜索是否有该物种的基因组信息，也可在其他专门介绍某种物种的网站寻找参考基因组。一般下载的文件包括：Assembled scaffolds(masked)、Genes、Functional Annotations三种文件；需要下载的文件具体如下： 1）序列信息：.fasta文件，用于进行mapping比对。 2)基因注释信息：.gff文件，里面包含基因名字，基因所在位置等信息，用于进行测得序列的基因注释，注释所得基因可以进行下一步表达差异分析。 3)GO注释信息：.txt文件，里面包含基因名字和对应注释信息编号（GO号），有此信息可以不用再重新进行GO注释，直接利用此信息进行GO富集分析。Q:2、送样要求？ A:1)组织样品动物组织：＞2g；植物组织：＞4g；培养细胞：＞1×107个；血液样品：≥2ml（最好是全血） 2)真核生物RNA 请提供浓度≥200ng/μL，总量≥10μg的RNA（单次建库用量为5μg）；OD260/2801.8~2.2之间，OD260/230≥2.0，RIN≥6.5，28S:18S≥1.0，确保RNA无降解；送样时请标记清楚样品编号，管口使用Parafilm膜密封；样品保存期间切忌反复冻融；送样时请使用干冰运输。

3)原核生物RNA 请提供浓度≥200ng/μL，总量≥10μg的RNA（单次建库用量为5μg）； OD260/280介于1.8~2.2之间，OD260/230≥2.0，RIN≥6.5，23S:16S≥1.0，确保RNA无降解；送样时请标记清楚样品编号，管口使用Parafilm膜密封；样品保存期间切忌反复冻融；送样时请使用干冰运输。 Q:3是否一定要求设置生物学重复，以及重复次数？目前没有生物学重复的实验发文章比较困难，尤其是IF≥5的杂志。如果确实受限于研究经费，无法设置生物学重复。文章投出之后，遭编辑质疑。那就得结合强有力的实验数据做支撑，比如定量实验，FISH荧光原位杂交，或者是northern 杂交等，用实验数据说服编辑。重复设置原则上越多越好，然而考虑到现实条件，重复设置≥3。一般不建议设置两个重复，因为如果两者结果不一致，我们无法确定以哪个数据为参考。注：3个生物学重复，不等同于将3个样品的RNA等量混合后测序。3个样品等量混合测序，相当于将3个样本的基因表达量取了平均值，其实就是相当于取了一个样本，由此得到的差异基因同样不可信，不能反应群体生物学现象。Q:4isogene与"unigenes"有什么区别？ Isogene是Trinity拼接软件得到的转录本，真核生物存在可变剪切，因此一个基因可能对应多个转录本。而Unigenes是组装得到的转录本中，最长的一条。Q:5为什么分析到的差异表达基因与Q-PCR实验结果不一致，无法被验证？RNA-seq是大规模筛选用的，反应样本整体的基因表达变化趋势，但不能保证每一个基因的变化趋势都与Q-PCR一致。RNA-seq与RT-PCR本身就是两种